犬细小病毒的pcr检测方法

专利名称：犬细小病毒的pcr检测方法
技术领域：
本发明属于动物传染病的诊断技术，涉及对犬的犬细小病毒的检测方法。
犬细小病毒(CPV)是犬的一种烈性传染病。临床表现以急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征。对于犬细小病毒的检测方法，目前主要有病毒分离培养、电镜和免疫电镜技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸试验、血凝试验和血凝抑制试验等。但这些方法均存在一些缺点和不足。病毒分离培养费时费力，操作复杂，还需要必要的实验室条件；电镜和免疫电镜技术需昂贵的仪器设备；荧光抗体技术仅局限于检测病理组织或细胞培养物中的病毒；酶联免疫吸附试验除敏感性不高外，还易受干扰因素的影响；血凝试验和血凝抑制试验需随时准备新鲜的敏感红细胞，送检粪样稀释倍数低时，含有非特异性凝集素，还需做血凝抑制试验加以验证。PCR是一种具有敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法，标本中含有痕量CPV-DNA就能检出。目前虽已有对犬CPV的PCR检测方法的报道，但未形成完整的试剂盒检测技术，其样品处理过程复杂且需要时间长，循环条件没有得到最佳优化。
本发明的目的是提出一种以PCR试剂盒检测技术为基础的犬细小病毒的PCR检测方法，以实现对犬细小病毒检测的准确、快速的标准化。
本发明所建立的犬细小病毒的PCR检测方法包括以下内容(一)设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括(1)PCR试剂管，试剂管内含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，所述的引物1和引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)阳性对照，该对照为经CTAB消化，酚氯仿抽提的犬细小病毒DNA模板；(3)阴性对照，该对照为不含犬细小病毒并经热处理的粪样；(4)Taq酶；(5)普通琼脂糖；(6)溴化乙锭溶液；(7)溴酚兰上样缓冲液；(二)按照以下操作规程进行检测(1)样品处理粪样+灭菌生理盐水或PBS(PH7.2)，充分振荡后，离心去沉淀，取上清放入另一支灭菌离心管中，隔水煮沸使蛋白质变性，放入冰水降温后离心去沉淀，吸取上清放入另一离心管中保存备用；(2)PCR在PCR试剂管中加入经稀释的样品，同时设阴阳性对照，稍离心，94～96℃变性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍离心混匀，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件采用降落(TD)PCR程序，一般操作不少于20循环；(3)扩增产物分析将琼脂糖溶于电泳缓冲液，把温热凝胶倒入放好梳子的胶膜中，凝胶凝固后，移去梳子，将凝胶放入有电泳缓冲液的电泳槽，将样品扩增产物与溴酚兰上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电60～100V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳完成后，切断电源，取出凝胶，将此凝胶经溴化乙锭溶液浸泡后取出，放在透射紫外灯下观察，将样品孔出现的电泳带比对阳性对照和阴性对照，以判定样品为犬细小病毒阳性或阴性。
本发明所设置的PCR检测试剂盒，一般可采用以下配置(1)PCR试剂管，试剂管内含10×buffer1.5～2.5μl，2.5mMdNTP1.5～3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.3～0.6μl，25mM MgCl20.6μl；(2)阳性对照，该对照为经CTAB消化，酚氯仿抽提的犬细小病毒DNA模板；(3)阴性对照，该对照为不含犬细小病毒并经热处理的粪样；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通琼脂糖0.8g；(6)10μg/μl溴化乙锭溶液1ml；(7)0.25％溴酚兰上样缓冲液100μl。
本发明在设计特异引物并成功建立犬细小病毒PCR检测技术的基础上，进一步研制成简单快速敏感的PCR检测试剂盒，简化了试剂配制和样品制备时间，并首次采用降落PCR程序进行反应，提高了本试剂盒的特异性和敏感性。本发明突出的优点是建立起一套标准方法，可快速、准确地检测出供检样品中的CPV，可应用于对实验动物犬的质量监测，也为宠物犬和军犬、肉用犬等各种犬的疾病诊断提供简单快速准确的方法。
以下对本发明的实施方式作进一步的详细说明1、试剂盒的组成(1)PCR试剂管，试剂管内含10×buffer 2μl，2.5mMdNTP 3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.5μl，25mM MgCl20.6μl，用灭菌三蒸水补至15μl，其中引物1和引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)阳性对照，该对照为经CTAB消化，酚氯仿抽提的犬细小病毒DNA模板；(3)阴性对照，该对照为不含犬细小病毒并经热处理的粪样；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通琼脂糖0.8g，可配成100ml；(6)10μg/μl溴化乙锭溶液1ml，可配成终浓度为0.5μg/ml；(7)0.25％溴酚兰上样缓冲液100μl。
2、试剂盒检测操作规程取被测粪样50μl放入灭菌离心管中，加50μl PBS(pH7.2)，充分振荡后，3000转/分离心10分钟；取上清放入另一支灭菌离心管中，隔水煮沸10分钟，放入冰水中5分钟后，10000转/分离心8分钟，将上清按1/20稀释后取2μl加入PCR试剂管中，同时取2μl阴阳对照分别加入另外两支PCR试剂管中，每管再补3μl灭菌无离子水；稍离心后，96℃变性10分钟，取出每管加入Taq酶0.3μl，稍离心混匀，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件采用降落(TD)PCR程序94℃2分钟，退火温度从58℃开始，逐步降至48℃，每2个循环降低1℃，退火时间1分钟，72℃30秒，如此进行22个循环，再94℃2分钟，55℃1分钟，72℃30秒进行10循环，最后72℃延伸10分钟；将样品扩增产物与上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入电泳槽中凝胶点样孔内；100V恒压电泳，电泳完成后，切断电源，取出凝胶，将此凝胶浸泡在含溴化乙锭溶液中，5～7分钟后取出，放在透射紫外灯下观察，如果样品孔出现和阳性对照同样的电泳带，而阴性对照无相同带出现，则判此样品为犬细小病毒阳性，否则为阴性。
权利要求
1．一种犬细小病毒的PCR检测方法，其特征在于(一)设置PCR检测试剂盒，该试剂盒包括(1)PCR试剂管，试剂管内含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，所述的引物1和引物2分别是由DNA合成仪按碱基序列为5’TACCATGGTACAGATCCAG3’和5’CTCCTATATCACCAAAGTTA3’合成的DNA片段；(2)阳性对照，该对照为经CTAB消化，酚氯仿抽提的犬细小病毒DNA模板；(3)阴性对照，该对照为不含犬细小病毒并经热处理的粪样；(4)Taq酶；(5)普通琼脂糖；(6)溴化乙锭溶液；(7)溴酚兰上样缓冲液；(二)按照以下操作规程进行检测；(1)样品处理粪样+灭菌生理盐水或PBS(PH7.2)，充分振荡后，离心去沉淀，取上清放入另一支灭菌离心管中，隔水煮沸使蛋白质变性，放入冰水降温后离心去沉淀，吸取上清放入另一离心管中保存备用；(2)PCR在PCR试剂管中加入经稀释的样品，同时设阴阳性对照，稍离心，94～96℃变性，每管加入Taq酶不少于0.3μl，稍离心混匀，置PCR仪进行扩增，PCR反应循环条件采用降落(TD)PCR程序；(3)扩增产物分析将琼脂糖溶于电泳缓冲液，把温热凝胶倒入放好梳子的胶膜中，凝胶凝固后，移去梳子，将凝胶放入有电泳缓冲液的电泳槽，将样品扩增产物与溴酚兰上样缓冲液混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电60～100V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳完成后，切断电源，取出凝胶，将此凝胶经溴化乙锭溶液浸泡后取出，放在透射紫外灯下观察，将样品孔出现的电泳带比对阳性对照和阴性对照，以判定样品为犬细小病毒阳性或阴性。
2．根据权利要求1所述的犬细小病毒的PCR检测方法，其特征在于所述的PCR检测试剂盒包括(1)PCR试剂管，试剂管内含10×buffer1.5～2.5μl，2.5mMdNTP1.5～3μl，0.2ug/ul的引物1和引物2各0.3～0.6μl，25mM MgCl20.6μl；(2)阳性对照，该对照为经CTAB消化，酚氯仿抽提的犬细小病毒DNA模板；(3)阴性对照，该对照为不含犬细小病毒并经热处理的粪样；(4)Taq酶7μl，3U/μl；(5)普通琼脂糖0.8g；(6)10μg/μl溴化乙锭溶液1ml；(7)0.25％溴酚兰上样缓冲液100μl。
3．根据权利要求1所述的犬细小病毒的PCR检测方法，其特征在于所说的PCR反应循环条件为采用降落(TD)PCR程序，不少于20循环。
全文摘要
本发明提供一种犬细小病毒的PCR检测方法,本发明的内容包括一套由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚兰上样缓冲液组成的PCR检测试剂盒以及一套检测操作程序。本发明突出的优点是建立起一套标准方法,可快速、准确地检测出供检样品中的犬细小病毒,可应用于对实验动物犬的质量监测,也为宠物犬和军犬、肉用犬等各种犬的疾病诊断提供简单快速准确的方法。
文档编号C12Q1/68GK1298025SQ9911726
公开日2001年6月6日 申请日期1999年12月2日 优先权日1999年12月2日
发明者刘忠华, 钟翎 申请人:广东省昆虫研究所