专利名称：弹性蛋白酶的修饰固定化技术及其应用方法
技术领域：
本发明与酶有关，进一步来说，与固定化酶的制备有关，也与使用酶制备组合物的方法有关。
人们早已知道，弹性蛋白酶(Elastase)广泛存在于哺乳动物的胰脏之中，它是一种能溶解弹性蛋白的酶，具有良好的生物活性。由于它有降低血清中胆固醇、甘油三酯，阻止主动脉和冠状动脉斑块形成，扩张血管、降低血压、增加心肌血流量等作用，因此医学临床上用于治疗高血脂症，防治脂肪肝和动脉粥样硬化等症。近年来，世界各国的许多科学家都在研究如何将从动物体提取的弹性蛋白酶用于为人类健康服务。然而，动物胰脏中具有生物活性的物质很多，其中弹性蛋白酶和激肽释放酶在提取过程中相互影响较大，提取条件难以控制，所得到的提取物活性不高；同时，提取的弹性蛋白酶在常温下极易失活，一般情况下，2小时内弹性蛋白酶将完全失活。虽然科技人员为此进行了大量研究，但迄今为止，对于弹性蛋白酶的提取并进行修饰固定化尚未有能够用于工业化生产的技术、方法报导，更未见到将修饰固定化的弹性蛋白酶应用于化妆品或食品的方法报导。
本发明的目的就是提供一种弹性蛋白酶的修饰固定化技术，以及将其应用于化妆品或食品的方法。
发明人采用从猪胰脏中提取的弹性蛋白酶原粉为原料。具体的提取方法是将猪胰脏洗净、捣碎，用4～5倍体积pH值为4.1～4.5、浓度为0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲液抽提4小时，接着过滤，所得的滤液用牌号为AmberliteIRC-50的树脂吸附4小时，再用pH9.6的氨水-氯化铵缓冲液进行0.5～1小时的洗脱，得到洗脱液；之后，用稀氨水将洗脱液调至中性，再用2～3倍体积温度为0～-5℃的丙酮沉淀，所需沉淀时间为12小时左右；最后，将其过滤，冻干4小时左右得到弹性蛋白酶原粉，其比活≥20u/mg。
由于作为生物活性物质的弹性蛋白酶在室温及空气中的酶活力极易失活，因此欲对其加以利用，必须进行修饰固定化处理。为此，发明人经过反复研究和优选，找到了以硅藻土为固定剂的弹性蛋白酶的修饰技术。该修饰技术包括(1)将固定剂硅藻土高温熔炼、杀菌后冷却至室温；(2)添加抗氧化剂，并加入弹性蛋白酶原粉，用醋酸-醋酸铵缓冲液将所有物质混合均匀，取得固定液；(3)将固定液冻干，即制得固定化的弹性蛋白酶原粉。在此过程中，硅藻土的熔炼温度为300℃；醋酸-醋酸铵缓冲液的pH值为7～9；所用的抗氧化剂为葡聚糖凝胶。
人们在研究中发现，弹性蛋白酶除了用作心血管疾病的药物外，它直接作用于皮肤，可以改善皮肤上毛细血管的微循环，恢复对皮肤的充分供给营养、水分，能够迅速消除皮肤起皱、失泽、生成黑斑等老化现象。因此，固定化弹性蛋白酶的应用，除了药物而外，首先就是用于护肤化妆品。发明人对此进行了开发研究，找出一种可以工业化的工艺方法，制成化妆品弹性酶护肤霜。其工艺方法包括(1)将硬脂酸、液体石蜡、白凡士林、单甘脂、十六醇、吐温-80、蜂蜡按80∶12∶35∶35∶5∶7∶10的比例混合加热，制成油相备用；(2)在热蒸馏水中加入比例为80∶10∶80∶12的三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、甘油和研细的钛白粉，混合均匀，制得水相备用；(3)在上述油相中加入同温度水相，密封抽真空，然后在恒温下搅拌，乳化均质1小时后放出，再搅拌均质并冷却至50℃后加入固定化的弹性蛋白酶、防腐剂和香精，最后冷却结膏，即得到弹性酶护肤霜成品。该过程中，油相加热的温度为70～90℃；水相所用的蒸馏水温度也为70～90℃；所用的防腐剂通常是尼泊金乙酯或尼泊金甲酯，其用量不多，由生产技术人员国际需要确定。
固定化弹性蛋白酶的另一个应用是制造降脂食品——弹性蛋白酶胶囊。该胶囊的生产方法为(1)将弹性蛋白酶、卵磷脂按25∶4的比例，同时加入无水氯化钙、乙醇、滑石粉和蒸馏水混合，搅拌1小时使其混合均匀；(2)再加入维生素A、维生素E，继续搅拌0.5小时；(3)添加碳酸钙、淀粉、硬脂酸镁及稳定剂后使物料混匀，用胶体磨磨细，然后冻干，最后用常规方法灌制成胶囊。此过程中，使用的无水氯化钙和滑石粉的量是弹性蛋白酶用量的0.12％和4％左右；以1000g弹性蛋白酶计所用的乙醇、和蒸馏水的量为48ml和480ml左右，所加入的维生素A为1240000国际单位、维生素E为24g；常用的稳定剂是葡聚糖凝胶，其用量为弹性蛋白酶的20％左右。
使用本发明提供的修饰技术，可以有效地保存弹性蛋白酶的生物活性(保存期达到18个月)，由此制得的固定化弹性蛋白酶使其在化妆品和食品上的应用并实现工业化生产成为可能。用固定化弹性蛋白酶制得的护肤霜，对皮肤弹性纤维有较强亲合力，通过化妆品基质的协同渗透作用分解老化弹性纤维，促进弹性蛋白更新，增强人体对皮肤供养能力，有效改善皮肤弹性，减少皱纹，并对雀斑、老年斑、粉刺、硬皮症等有明显疗效。用固定化弹性蛋白酶制得的弹性蛋白酶胶囊，是一种降脂保健食品，对患有心血管疾病的病人具有协助治疗的作用，对健康人的心血管则有保健作用。
以下实施例可以更清楚地说明本发明实施例1 取80g硅藻土作为固定剂，经高温熔炼杀菌后，冷却至室温，添加20g弹性蛋白酶原粉，用pH值7～9的醋酸-醋酸铵缓冲液100ml将所有物质混合均匀，取得固定液；将固定液冻干，即制得150g固定化的弹性蛋白酶原粉。
实施例2 先将80g硬脂酸、12g液体石蜡、35g白凡士林、35g单甘脂、5g十六醇、7g吐温-80、10g蜂蜡混合后加热至80℃左右备用；再将加热至80℃左右的880ml蒸馏水中加入80g三乙醇胺、10g十二烷基硫酸钠、80g甘油和12g研细的钛白粉，混合均匀，制得水相备用；将上述80℃左右油相加入乳化罐中，再加入同温度水相，密封抽真空，然后在恒温下搅拌，乳化均质1小时后放出，再搅拌均质并在冷却至50℃后加入5～15u(活力单位)的固定化弹性蛋白酶、防腐剂尼泊金乙酯和香精，继续搅拌均质，最后冷却结膏，即得到1000ml弹性酶护肤霜成品。
实施例3 取250g固定化弹性蛋白酶粉，加入40g卵磷脂、0.3g无水氯化钙、12ml乙醇、10g滑石粉，搅拌1小时使其混合均匀；再加入维生素A310000个国际单位、维生素E 6g，继续搅拌0.5小时；之后添加487g碳酸钙、3.8g淀粉、19.2g硬脂酸镁及50g稳定剂葡聚糖凝胶后使物料混匀，用胶体磨磨细，然后冻干，最后用常规方法灌制成胶囊1000g。
权利要求
1 一种弹性蛋白酶的修饰固定化技术，其特征包括(1)将固定剂硅藻土高温熔炼、杀菌后冷却至室温；(2)添加抗氧化剂，并加入弹性蛋白酶原粉，用醋酸-醋酸铵缓冲液将所有物质混合均匀，取得固定液；(3)将固定液冻干，即制得固定化的弹性蛋白酶原粉。
2 如权利要求1所述的技术，其特征在于硅藻土的熔炼温度为300℃；醋酸-醋酸铵缓冲液的pH值为7～9；所用的抗氧化剂为葡聚糖凝胶。
3 如权利要求1所述的技术在应用于护肤化妆品生产上的方法，其特征包括(1)将硬脂酸、液体石蜡、白凡士林、单甘脂、十六醇、吐温-80、蜂蜡按80∶12∶35∶35∶5∶7∶10的比例混合加热，制成油相备用；(2)在热蒸馏水中加入比例为80∶10∶80∶12的三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、甘油和研细的钛白粉，混合均匀，制得水相备用；(3)在上述油相中加入同温度水相，密封抽真空，然后在恒温下搅拌，乳化均质1小时后放出，再搅拌均质并冷却至50℃后加入固定化的弹性蛋白酶、防腐剂和香精，最后冷却结膏，即得到弹性酶护肤霜成品。
4 如权利要求3所述的应用方法，其特征在于油相加热的温度为70～90℃；水相所用的蒸馏水温度也为70～90℃；所用的防腐剂通常是尼泊金乙酯或尼泊金甲酯。
5 如权利要求1所述的技术在应用食品生产上的方法，其特征包括(1)将弹性蛋白酶、卵磷脂按25∶4的比例，同时加入无水氯化钙、乙醇、滑石粉和蒸馏水混合，搅拌1小时使其混合均匀；(2)再加入维生素A、维生素E，继续搅拌0.5小时；(3)添加碳酸钙、淀粉、硬脂酸镁及稳定剂后使物料混匀，用胶体磨磨细，然后冻干，最后用常规方法灌制成胶囊。
6 如权利要求5所述的应用方法，其特征在于所用的无水氯化钙和滑石粉的量是弹性蛋白酶用量的0.12％和4％；以1000g弹性蛋白酶计所用的乙醇、和蒸馏水的量为48ml和480ml，所加入的维生素A为1240000国际单位、维生素E为24g；所用的稳定剂是葡聚糖凝胶，其用量为弹性蛋白酶的20％。
全文摘要
弹性蛋白酶的修饰固定化技术及其应用方法,与固定化酶的制备也与使用酶制备组合物的方法有关,目的是提供一种弹性蛋白酶的修饰固定化技术,并将其应用于化妆品或食品的方法。本发明以硅藻土为固定剂、添加抗氧化剂并用醋酸－醋酸铵缓冲溶液进行固定化弹性蛋白酶的修饰,还将固定化的弹性蛋白酶用于生产弹性酶护肤霜和弹性蛋白酶胶囊食品。本发明的技术,可有效地保存弹性蛋白酶的生物活性,使其在化妆品和食品上实现工业化生产。
文档编号C12N11/14GK1264735SQ9911742
公开日2000年8月30日 申请日期1999年12月3日 优先权日1999年12月3日
发明者赵红杰, 兰辛, 房贵, 许国, 姚杰, 佘湘黔, 张丽萍, 杨璇, 孙建和, 周昆 申请人:贵阳市食品生物工程研究所, 贵阳海日食品生物工程有限公司