专利名称：能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法，特别是涉及一种能精确识别同一生物个体的肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异或肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法。
在生物医学领域中，抗癌抗体的识别功能及其制备方法对于肿瘤的诊断、治疗和预防都有着十分重要的意义，因而受到国内外生物医学界的广泛关注，开展了大量的研究工作并取得了一定的进展。传统的制备单克隆抗癌抗体的方法主要包括三个步骤，即获取肿瘤细胞相关抗原、免疫小鼠和溶合杂交瘤。
一般来说，起源于同一组织的肿瘤细胞与正常细胞间的差异是很小的。因此，制备用于治疗肿瘤的抗癌抗体时，必须反复筛选出与非肿瘤细胞交叉免疫反应最弱的抗体，以尽量避免抗癌抗体对正常细胞的损伤。然而，采用传统方法制备单克隆抗癌抗体却很难做到这一点，究其原因主要有以下两方面。首先，抗癌抗体与正常细胞交叉免疫反应的强弱，不仅取决于肿瘤细胞相关抗原是否纯化，而且与抗原的表位结构有关，肿瘤细胞相关抗原与正常细胞抗原的表位结构越相似，则所制备的单克隆抗癌抗体与正常细胞发生交叉免疫反应的可能性就越大。在这方面，传统的制备单克隆抗瘤抗体的方法可谓先天不足。其次，采用传统方法制备的单克隆抗癌抗体没有经过个体早期胸腺和骨髓克隆选择过程，对受者而言，这样的外源性单克隆抗癌抗体就不能选择性识别其肿瘤细胞抗原决定簇中的突变点，也不能经宿主调节以此点形成免疫优势位点来区分“自身”与“非已”。正是由于以上两方面的原因，在很大程度上制约了各种单克隆抗癌抗体的发展，采用传统方法制备的单克隆抗癌抗体很难完全避免与正常细胞发生交叉免疫反应。
为了提高抗癌抗体对肿瘤细胞的特异性识别功能并避免对正常细胞的损伤，发明人王胜军在98100700.7发明专利申请中公开了一种能全方位选择性识别肿瘤细胞的多克隆抗癌抗体的制备方法，该制备方法主要包括建立“天然”免疫耐受、免疫小鼠、检测和溶合杂交瘤四个步骤。由于不需要体外扩增和纯化肿瘤抗原，因而该制备方法相当简便易行。所制备的多克隆抗癌抗体携带有起源于同一个体同一组织的正常细胞与肿瘤细胞间的全部抗原差异信息，因而具有全方位选择性识别肿瘤细胞的功能，它只与肿瘤细胞发生免疫反应，而不与正常细胞发生交叉免疫反应。可以说，上述制备多克隆抗癌抗体的方法已经在很大程度上克服了传统方法的缺陷和弊端。但是，上述制备方法在某些方面也还存在一定的局限性。
首先，在上述制备方法的建立“天然”免疫耐受的过程中，导入异品系或杂交鼠B的胚胎b中的正常细胞，仅限于患有肿瘤的纯系小鼠a的与肿瘤细胞起源于同一组织的正常细胞，而不包括其它组织的正常细胞，尤其是没有包括骨髓细胞。这一点势必将影响建立“天然”免疫耐受的有效性并最终影响到抗癌抗体识别肿瘤细胞的准确性。事实上，有证据表明，肿瘤细胞处于未分化或低分化的分子生态环境中时，可能会表达与其它组织细胞相同的抗原，如结肠癌细胞表达与骨髓细胞相同的抗原，胃癌细胞表达血型抗原等。而且，利用骨髓等淋巴造血细胞表达同种抗原更有利于“天然”免疫耐受的建立。
其次，以肿瘤组织血管内皮细胞表达的特征性分子为靶的治疗方法在肿瘤的导向治疗中已占据十分重要的地位，这是因为肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤新生血管的形成有着十分密切的关系。实验表明，当肿瘤生长到0.2～0.3mm大小时，如果不通过其血管供应营养，则肿瘤细胞将停止生长并被“饿死”，肿瘤细胞也不能经血液而转移。遗憾的是，采用传统方法制备的多克隆抗体或单克隆抗体都不能十分有效地选择性识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞之间的全部差异点，而采用98100700.7发明专利申请公开的方法制备的多克隆抗体或单克隆抗体又只能选择性识别肿瘤细胞，而根本不能选择性识别肿瘤组织血管内皮细胞，这种情况无疑也会给肿瘤的导向治疗带来一定的限制。试想，如果能有某种能准确识别肿瘤组织血管内皮细胞表达的全部特征性分子的多克隆抗体和以这种抗体可变区为模板而改造的基因工程抗体，再连接放射性核素、毒性分子或制备重组蛋白等细胞毒性物质，则完全有可能准确地以肿瘤组织血管新生过程表达的一些特征性分子为靶、破坏其血管内皮细胞并形成血栓，从而断绝其营养通道并最终导致肿癌细胞的死亡。果真如此的话，制备出能全方位选择性识别肿瘤组织血管内皮细胞的新型多克隆抗体，定将为肿瘤的生物导向治疗开辟出新的更有效的途径。
本发明的目的正是在于获得一种能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法，特别是获得一种能精确识别同一生物个体的肿瘤细胞与正常细胞间差异或肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，以使所制备的多克隆抗体能准确识别肿瘤细胞或肿瘤组织血管内皮细胞，从而更加有效地预防或治疗肿瘤或者对应性寻找肿瘤细胞或细胞内尚未发现的特异性抗原分子、癌基因和抗癌基因以及肿瘤组织血管内皮细胞特征性分子。
上述目的可通过①建立“天然”免疫耐受和②免疫小鼠两个步骤来实现。
建立“天然”免疫耐受的过程是、从患有肿瘤的绝对纯系小鼠a的体内提取与肿瘤细胞起源于同一组织的正常细胞及骨髓细胞并制成正常细胞及骨髓细胞悬液，从患有肿瘤的绝对纯系小鼠c的体内的正常组织中分离提取正常组织血管内皮细胞并制成正常组织血管内皮细胞悬液；然后，将小鼠a的正常细胞及骨髓细胞悬液导入已怀孕的异品系或杂交小鼠B的胚胎b中，将小鼠c的正常组织血管内皮细胞悬液导入已怀孕的异品系或杂交小鼠D的胚胎d中，以造成小鼠a的正常细胞及骨髓细胞在胚胎b中的“天然”免疫耐受和小鼠c的正常组织血管内皮细胞在胚胎d中的“天然”免疫耐受，从而使小鼠a的正常细胞及骨髓细胞和小鼠c的正常组织血管内皮细胞分别被出生后的小鼠b和小鼠d的免疫系统视为“自我”，也即在小鼠b和小鼠d的体内分别建立起能够识别小鼠a正常细胞及骨髓细胞和小鼠c正常组织血管内皮细胞的“自我”识别系统，该“自我”识别系统可将小鼠a的正常细胞及骨髓细胞和小鼠c的正常组织血管内皮细胞分别视为小鼠b本身的正常细胞或小鼠d本身的正常组织血管内皮细胞。
免疫小鼠的过程是，待小鼠b和小鼠d出生后并进入青春期时，再将小鼠a的肿瘤细胞悬液和小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞悬液分别注入小鼠b和小鼠d的体内。由于在胚胎期对小鼠a的正常细胞及骨髓细胞和小鼠c的正常组织血管内皮细胞都已建立了“天然”免疫耐受，因此小鼠b和小鼠d的双重免疫识别体系在分别识别小鼠a的肿瘤细胞和小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞的同时，也必然能够识别“自我”，包括识别在胚胎期分别导入的小鼠a的正常细胞及骨髓细胞和小鼠c的正常组织血管内皮细胞。在小鼠b和小鼠d的双重免疫识别体系选择性识别“自我”与“非我”的机制下，小鼠b的双重免疫识别体系对小鼠a的肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间完全相同的抗原以及小鼠d的双重免疫识别体系对小鼠c的正常组织血管内皮细胞与肿瘤组织血管内皮细胞间完全相同的抗原都不会产生免疫应答反应，而小鼠a的肿瘤细胞抗原(包括肿瘤细胞抗原决定簇中仅有一个氨基酸改变或者仅有空间构象改变的差异点)和小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞表达的全部特征性分子，则会在宿主精细调节和选择下形成免疫优势位点(包括尚未发现的肿瘤细胞特异性抗原和肿瘤组织血管内皮细胞特征性分子)。由于几乎所有的自身免疫反应都是Th细胞依赖性的，而能够与正常细胞和肿瘤细胞间完全相同的抗原或正常组织血管内皮细胞与肿瘤组织血管内皮细胞完全相同的抗原发生免疫反应的相应淋巴细胞在胚胎期或被克隆删除或被抑制，因此，在正常情况下不会产生针对小鼠a正常细胞及骨髓细胞和针对小鼠c的正常组织血管内皮细胞的自身抗体，也不会发生与小鼠a正常细胞及骨髓细胞和小鼠c正常组织血管内皮细胞的交叉免疫反应。而那些与小鼠a正常细胞及骨髓细胞不同的肿瘤细胞异常抗原(包括尚未发现的肿瘤细胞特异性抗原)和与小鼠c正常组织血管内皮细胞不同的肿瘤组织血管内皮细胞表达的特征性分子(包括尚未发现的特征性抗原)，都将分别在小鼠b和小鼠d的体内刺激诱导出与之相应的多克隆抗体。小鼠b和小鼠d体内刺激诱导出的多克隆抗体可利用常规方法加以检测。检测的过程是，利用生物技术，如免疫组合中的免疫荧光法、检测小鼠b体内诱导出的多克隆抗体分别与小鼠a的肿瘤细胞和正常细胞及骨髓细胞的免疫反应，并确认小鼠b体内诱导出的多克隆抗体只与肿瘤细胞发生免疫反应，而不与正常细胞及骨髓细胞发生交叉免疫反应。利用同样的方法可检测小鼠d体内诱导出的多克隆抗体分别与小鼠c的正常组织血管内皮细胞和肿瘤组织血管内皮细胞的免疫反应，并确认小鼠d体内诱导出的多克隆抗体只与肿瘤组织血管内皮细胞发生免疫反应，而不与正常组织血管内皮细胞发生交叉免疫反应。
利用本发明衔接杂交瘤技术可以获得大量专一的能精确识别肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异和精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体，其过程是从经过确认的小鼠b和小鼠d的脾脏中分离出带有多克隆抗体免疫信息的致敏淋巴细胞，并采用杂交瘤技术分别与骨髓瘤细胞溶合成杂交瘤细胞，然后将溶合成的两种杂交瘤细胞分别进行体外扩增或接种于小鼠腹腔内，即可从培养上清液或小鼠腹水中源源不断地获得能精确识别肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异和精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的单克隆抗体。
除此之外，还可通过现已成熟的基因工程技术，从杂交瘤细胞或免疫小鼠的脾细胞中提取总的RNA或mRNA，以mRNA为模板在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后通过PCR扩增、克隆、测序分析、抗体基因表达等过程制备基因工程抗体；或通过模板替换、表面重塑、补偿变换以及定位保留等方式将利用本发明获得的鼠源抗体改造成人源化抗体。
以下结合具体实施例对本发明能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法的技术特征作进一步的详细说明。
一、能精确识别肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异的新型抗体的制备方法。
能精确识别肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异的新型抗体的制备方法主要包括①建立“天然”免疫耐受和②免疫小鼠两个步骤。
①建立“天然”免疫耐受建立“天然”免疫耐受是本制备方法最为关键的步骤，其过程是首先从患有肿瘤的纯系小鼠a的某一特定组织内提取正常细胞，同时从骨髓中提取骨髓细胞，并制成正常细胞及骨髓细胞悬液(骨髓细胞应占正常细胞的20％以上)；然后将小鼠a的正常细胞及骨髓细胞悬液导入已怀孕的异品系或杂交小鼠B的胚胎b中。
从小鼠a提取的正常细胞必须与肿瘤细胞起源于同一组织、但又必须远离肿瘤，以防止正常细胞中混入肿瘤细胞(可通过镜检确定提取的正常细胞)。例如，小鼠a患有左肺癌时，则可从右肺提取正常细胞。为了建立彻底的“天然”免疫耐受，小鼠a的正常细胞及骨髓细胞悬液应在异品系或杂交小鼠B的胚胎期导入胚胎b中，导入时可利用微型注射器经手术剖腹后注射到小鼠B的胚胎b中。导入的部位可选在胚胎b的胸腺内或其它部位；导入的时间可选在胚胎b的骨髓细胞到达胸腺的某段特定时间内；导入的细胞数量应根据胚胎b形成的时间和大小精确计算。
在上述建立“天然”免疫耐受的过程中，纯系小鼠a的正常细胞及骨髓细胞可由粉碎后的正常细胞及骨髓细胞匀浆、或正常细胞外膜、或正常细胞外膜蛋白、或正常细胞内容物代替，也可由正常细胞核内容物或正常细胞核酸性分子代替，还可由患有肿瘤的不同种属动物或人的正常细胞及骨髓细胞、或粉碎后的正常细胞及骨髓细胞匀浆、或正常细胞外膜、或正常细胞外膜蛋白、或正常细胞内容物、或正常细胞核内容物、或正常细胞核酸性分子代替。小鼠a的正常细胞及骨髓细胞或其多种替代物也可导入异品系或杂交小鼠B的初生期小鼠b体内，还可导入无免疫缺陷的不同种属动物B的胚胎b中或初生期动物b体内。
②免疫小鼠免疫小鼠的过程是，待上述接受小鼠a正常细胞及骨髓细胞“天然”免疫耐受的小鼠b出生后并进入青春期时，再将小鼠a的肿瘤细胞悬液多次重复注入小鼠b体内。例如，首次可腹腔注射细胞2×107个/鼠，2-3周后重复注射一次，3周后腹腔或静脉加强。
提取小鼠a的肿瘤细胞并制备肿瘤细胞悬液时，应尽可能清除其它杂质细胞并可进行体外培养。利用小鼠a的肿瘤细胞免疫小鼠b的时机最好选择在小鼠b的青春期，此时小鼠b的“自我”与“非我”双重免疫识别功能最强。由于不同品系、不同种属和不同个体的动物对同一个体同一组织来源的肿瘤细胞的免疫识别功能存在很大的差异，因此应筛选出那些差异性较大、无免疫缺陷且免疫监视功能强的健康活泼的小鼠b进行免疫。免疫小鼠b的过程也应多次进行，以求在小鼠b体内产生更多、更具特异性识别功能的多克隆抗体；肿瘤细胞抗原量也应精确计算。
在上述免疫小鼠b的过程中，根据建立“天然”免疫耐受过程中导入的小鼠a的正常细胞及骨髓细胞替代物的不同，肿瘤细胞悬液可相应由粉碎后的肿瘤细胞匀浆、或肿瘤细胞外膜、或肿瘤细胞外膜蛋白、或肿瘤细胞内容物代替，也可相应由肿瘤细胞核内容物或肿瘤细胞核酸性分子代替，还可相应由患有肿瘤的不同种属动物或人的肿瘤细胞悬液、或粉碎后的肿瘤细胞匀浆、或肿瘤细胞外膜、或肿瘤细胞外膜蛋白、或肿瘤细胞内容物、或肿瘤细胞核内容物、或肿瘤细胞核酸性分子代替。
二、能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法。
能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，同样主要包括①建立“天然”免疫耐受和②免疫小鼠两个步骤。
①建立“天然”免疫耐受建立“天然”免疫耐受同样是本制备方法中最为关键的步骤，其过程是首先从患有肿瘤的纯系小鼠c的体内提取正常组织血管内皮细胞并制成正常组织血管内皮细胞悬液，然后将小鼠c正常组织血管内皮细胞悬液导入已怀孕的异品系或杂交小鼠D的胚胎d中。
导入小鼠c正常组织血管内皮细胞悬液时，可在无菌操作下利用微型注射器经手术剖腹后注射。导入部位可选在胚胎d的胸腺内，也可选在其它部位；导入时间可选在胚胎d的骨髓细胞到达胸腺的某段特定时间内，并在小鼠d刚出生时重复注入小鼠c的正常组织血管内皮细胞悬液，以求建立彻底的免疫耐受。
在上述建立“天然”免疫耐受的过程中，纯系小鼠c的正常组织血管内皮细胞可由粉碎后的正常组织血管内皮细胞匀浆、或正常组织血管内皮细胞外膜、或正常组织血管内皮细胞外膜蛋白代替，也可由患有肿瘤的不同种属动物或人的正常组织血管内皮细胞、或粉碎后的正常组织血管内皮细胞匀浆、或正常组织血管内皮细胞外膜、或正常组织血管内皮细胞外膜蛋白代替。正常组织血管内皮细胞或其多种替代物也可导入异品系或杂交小鼠D的初生期小鼠d体内，还可导入无免疫缺陷的不同种属动物D的胚胎d中或初生期动物d体内。
②免疫小鼠免疫小鼠的过程是，待上述已建立对小鼠c正常组织血管内皮细胞“天然”免疫耐受的小鼠d出生后并进入青春期时，将小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞悬液多次重复注入小鼠d体内。如首次腹腔注射细胞2×107个/鼠，2-3周后重复注射一次，3周后腹腔或静脉加强。
提取小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞和制备肿瘤组织血管内皮细胞悬液时，应尽可能清除其它杂质细胞并进行体外条件培养。利用小鼠c肿瘤组织血管内皮细胞免疫小鼠d的时机最好选择在小鼠d的青春期，此时小鼠d的免疫识别功能最强。由于不同品系、不同种属和不同个体的动物对同一个体同一肿瘤组织的血管内皮细胞的免疫识别功能存在很大差异，因此小鼠d也应选择那些无免疫缺陷且免疫监视功能强的健康小鼠。
免疫小鼠d的过程中，根据建立“天然”免疫耐受过程中导入的小鼠c的正常组织血管内皮细胞替代物的不同，肿瘤组织血管内皮细胞悬液可相应由粉碎后的肿瘤组织血管内皮细胞匀浆、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜蛋白代替，也可相应由患有肿瘤的不同种属动物或人的肿瘤组织血管内皮细胞悬液、或粉碎后的肿瘤组织血管内皮细胞匀浆、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜蛋白代替。
在本发明中，建立“天然”免疫耐受是制备新型抗体的关键性步骤，建立“天然”免疫耐受和免疫小鼠虽然都是以一只小鼠a对一只小鼠b或一只小鼠c对一只小鼠d的方式进行的，但在实际操作中应该以若干只小鼠a和若干只小鼠c分别对若干只小鼠b和若干只小鼠d的方式进行，以保证成功率和可靠性。请注意，小鼠a、c与小鼠b、d的差异性越大，则最终产品的精确度也越高。
利用本发明制备新型多克隆抗体不需要纯化抗原、所制备的多克隆抗体携带有起源于同一个体的肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异信息或同一个体肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异信息，因而具有准确识别肿瘤细胞或肿瘤组织血管内皮细胞的功能，它只与肿瘤细胞或肿瘤组织血管内皮细胞发生免疫反应，而不与正常细胞及骨髓细胞或正常组织血管内皮细胞发生交叉免疫反应。利用本发明与杂交瘤技术或基因工程技术相衔接，可大批量获得能准确识别肿瘤细胞或肿瘤组织血管内皮细胞的新型抗体并直接用于白血病治疗中的骨髓净化及各种癌症或转换癌的诊断和治疗。此外，由于利用本发明制备的新型抗体能够选择性识别有别于正常细胞的肿瘤细胞不同部位的特异性抗原分子，因此还可用于对应性寻找尚未发现的肿瘤细胞不同部位的特异性抗原分子及其相应的癌基因和抗癌基因，或用于对应性寻找尚未发现的肿瘤组织血管内皮细胞表达的特征性分子。
需要特别指出的是，利用本发明不仅可以制备能精确识别同一个体正常细胞及骨髓细胞与肿瘤细胞间差异和精确识别同一个体正常组织血管内皮细胞与肿瘤组织血管内皮细胞间差异的新型抗体，而且还可以制备出各种不同的新型抗体，用于精确识别任何细胞间差异，包括识别细胞外膜间差异、细胞外膜蛋白间差异、细胞内容物间差异、细胞核内容物间差异和细胞核酸性分子间差异。制备能精确识别A、B两种细胞间差异的新型抗体的一般方法为需要识别A细胞时、对B细胞建立“天然”免疫耐受，并用A细胞免疫小鼠；反之，需要识别B细胞时，则对A细胞建立“天然”免疫耐受，并用B细胞免疫小鼠。
权利要求
1.一种能精确识别肿瘤细胞与正常细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于包括①建立“天然”免疫耐受和②免疫小鼠两个步骤；即首先从患有肿瘤的纯系小鼠a的体内提取与肿瘤细胞起源于同一组织的正常细胞及骨髓细胞并在特定的时间内将其导入已怀孕的异品系或杂交小鼠B的胚胎b中，以造成小鼠a的正常细胞及骨髓细胞在胚胎b中的“天然”免疫耐受；待小鼠b出生后并进入青春期时，再将小鼠a的肿瘤细胞悬液多次重复注入小鼠b的体内，在随后发生的免疫应答反应中，起源于同一个体同一组织的肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间完全相同的抗原在小鼠b体内的克隆选择中被克隆排除，而与正常细胞及骨髓细胞不同的异常表达的肿瘤细胞抗原则被视为“非我”并在小鼠b体内刺激诱导出相应的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的能精确识别肿瘤细胞与正常细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述纯系小鼠a的正常细胞及骨髓细胞由粉碎后的正常细胞及骨髓细胞匀浆、或正常细胞外膜、或正常细胞外膜蛋白、或正常细胞内容物代替；所述小鼠a的肿瘤细胞悬液相应由粉碎后的肿瘤细胞匀浆、或肿瘤细胞外膜、或肿瘤细胞外膜蛋白、或肿瘤细胞内容物代替。
3.根据权利要求1所述的能精确识别肿瘤细胞与正常细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述纯系小鼠a的正常细胞及骨髓细胞由正常细胞核内容物或正常细胞核酸性分子代替；所述小鼠a的肿瘤细胞悬液相应由肿瘤细胞核内容物或肿瘤细胞核酸性分子代替。
4.根据权利要求1所述的能精确识别肿瘤细胞与正常细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述纯系小鼠a的正常细胞及骨髓细胞由患有肿瘤的不同种属动物或人的正常细胞及骨髓细胞、或粉碎后的正常细胞及骨髓细胞匀浆、或正常细胞外膜、或正常细胞外膜蛋白、或正常细胞内容物、或正常细胞核内容物、或正常细胞核酸性分子代替；所述小鼠a的肿瘤细胞悬液相应由患有肿瘤的不同种属动物或人的肿瘤细胞悬液、或粉碎后的肿瘤细胞匀浆、或肿瘤细胞外膜、或肿瘤细胞外膜蛋白、或肿瘤细胞内容物、或肿瘤细胞核内容物、或肿瘤细胞核酸性分子代替。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的能精确识别肿瘤细胞与正常细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述建立“天然”免疫耐受是将小鼠a的正常细胞及骨髓细胞或其多种替代物分别导入异品系或杂交小鼠B的初生期小鼠b体内。
6.根据权利要求1或5所述的能精确识别肿瘤细胞与正常细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述异品系或杂交小鼠B的胚胎b或初生期小鼠b由无免疫缺陷的不同种属动物B的胚胎b或初生期动物b代替。
7.一种能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于包括①建立“天然”免疫耐受和②免疫小鼠两个步骤，即首先从患有肿瘤的纯系小鼠c的体内提取正常组织血管内皮细胞并在特定的时间内将其导入已怀孕的异品系或杂交小鼠D的胚胎d中，以造成小鼠c的正常组织血管内皮细胞在胚胎d中的“天然”免疫耐受；待小鼠d出后后并进入青春期时，再将小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞悬液多次重复注入小鼠d的体内，在随后发生的免疫应答反应中，起源于同一个体的肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞之间完全相同的抗原在小鼠d体内的克隆选择中被克隆排除，而那些与正常组织血管内皮细胞不同的异常表达的肿瘤组织血管内皮细胞特征性分子则被视为“非我”并在小鼠d体内刺激诱导出相应的多克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述纯系小鼠c的正常组织血管内皮细胞由粉碎后的正常组织血管内皮细胞匀浆、或正常组织血管内皮细胞外膜、或正常组织血管内皮细胞外膜蛋白代替；所述小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞悬液相应由粉碎后的肿瘤组织血管内皮细胞匀浆、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜蛋白代替。
9.根据权利要求7所述的能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述纯系小鼠c的正常组织血管内皮细胞由患有肿瘤的不同种属动物或人的正常组织血管内皮细胞、或粉碎后的正常组织血管内皮细胞匀浆、或正常组织血管内皮细胞外膜、或正常组织血管内皮细胞外膜蛋白代替；所述小鼠c的肿瘤组织血管内皮细胞悬液相应由患有上述肿瘤的不同种属的动物或人的肿瘤组织血管内皮细胞悬液、或粉碎后的肿瘤组织血管内皮细胞匀浆、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜、或肿瘤组织血管内皮细胞外膜蛋白代替。
10.根据权利要求7、8或9所述的能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述建立“天然”免疫耐受是将小鼠c的正常组织血管内皮细胞或其多种替代物分别导入异品系或杂交小鼠D的初生期小鼠d体内。
11.根据权利要求7或10所述的能精确识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法，其特征在于所述异品系或杂交小鼠D的胚胎d或初生期小鼠d由无免疫缺陷的不同种属动物D的胚胎d或初生期动物d代替。
全文摘要
能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法,包括建立“天然”免疫耐受和免疫小鼠两个步骤。所制备的多克隆抗体可准确识别肿瘤细胞或肿瘤组织血管内皮细胞,因而只与肿瘤细胞或肿瘤组织血管内皮细胞发生免疫反应,而不与正常细胞及骨髓细胞或正常组织血管内皮细胞发生交叉免疫反应。利用本发明与杂交瘤技术或基因工程技术衔接,可大量获得专一的高特异性抗体而直接用于白血病治疗中的骨髓净化及各种癌症和转移癌的诊断治疗。
文档编号C12N5/18GK1250782SQ9912209
公开日2000年4月19日 申请日期1999年10月29日 优先权日1999年10月29日
发明者王胜军, 李晋京 申请人:王胜军, 李晋京