专利名称：L－氨基酸的发酵生产方法
技术领域：
本发明涉及使用棒状杆菌发酵生产L-氨基酸的方法，其中向发酵液中加入L-脯氨酸作为渗透保护物质。
已知在渗透压力下，大多数微生物在其细胞质中浓缩钾离子或所谓的渗压剂(有机化合物)，这导致内部渗透阻力，从而防止细胞脱水。在这一方面，已知加入甜菜碱能刺激细胞的生长速率，尤其是在具有抑制渗透压的培养基中。这会导致糖消耗速率的增加，以及L-赖氨酸的产量增加(Y.Kawahara，Y.Yoshihara，S.Ikeda，H.Yoshii，Y.Hirose，甜菜碱对L-赖氨酸发酵的刺激效应，(1990)，34(1)，pp87-90，应用微生物学生物工程)。
在乳发酵短杆菌的脯氨酸营养缺陷型突变体中，已发现脯氨酸在渗透调节中起一定作用。
已证明这些菌株的渗透耐受性比其野生型菌株低，在这一方面，发现当细胞在渗透压力下生长时，吡咯啉-5-羧酸还原酶的活性提高3倍(Y.Kawahara，T.Ohsumi，Y.Yoshihara，S.Ikeda，脯氨酸在乳发酵短杆菌的渗透调节中，(1989)，53(9)，pp2475-2479，农业及生物化学)。
在上述文献中未涉及氨基酸的生产。
本发明的一个目的在于提供一种用于发酵生产L-氨基酸的方法，其中高渗透压对细胞的效应被抑制。
本发明提供了一种用于发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于将产生和分泌L-氨基酸的棒状杆菌在一种培养基中培养，其中该培养基除了常规组分外，还添加有L-脯氨酸，优选地是在发酵开始时加入L-脯氨酸。其特别适用于由规定量和类型的组分组成的所谓的最小培养基和确定成分培养基。但是在包括水解物或提取物的复合培养基中加入L-脯氨酸也能提高产量。
此处L-脯氨酸并不作为微生物代谢中的C源或N源，但是其添加能促进氨基酸生产菌的生长并增加L-氨基酸的产量。
棒状杆菌特别是谷氨酸棒状杆菌很久以来就已知是一种氨基酸生产菌种。优选地使用适于生产L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸或L-缬氨酸的菌株。L-谷氨酸也可以如此方式生产。
发酵通常在25-50℃、优选地30-45℃进行，同时pH为6-8，优选地pH为7-7.5，铵浓度优选地为0.5-8g/l。
L-脯氨酸以0.01-10g/l、优选地0.1-2.5g/l的量加入到发酵液中。
棒状杆菌属特别是谷氨酸棒状杆菌的合适菌株是例如已知的生产谷氨酸的野生型菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，醋谷棒状杆菌ATCC15806，嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870，黄色短杆菌ATCC14067，乳发酵短杆菌ATCC13869和扩展短杆菌ATCC14020及由其产生的突变体和菌株，如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708和乳发酵短杆菌FERM-P 1712或如生产L-苏氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌FERM-P 5835黄色短杆菌FERM-P 4164和乳发酵短杆菌FERM-P 4180或如生产L-异亮氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌FERM-P 756黄色短杆菌FERM-P 759和乳发酵短杆菌FERM-P 4192或如生产L-缬氨酸的菌株黄色短杆菌FERM-P 512和乳发酵短杆菌FERM-P 1845。
用于发酵的培养基是用于生产本发明中所提到的L-氨基酸的已知基本培养基，或者常规用于生产L-氨基酸并且适用于生产L-氨基酸的细菌的培养基。
如通常已知的，所用的主要碳源是糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和淀粉水解物、纤维素和糖化纤维素、乳糖；脂肪酸，如乙酸、丙酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；有机酸，如丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、马来酸；醇类，如乙醇、丁醇；上述化合物的单个组分或化合物。另外，来自所选的L-氨基酸的生物合成途径的前体或L-氨基酸本身也可以使用。
所用磷源通常是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。
所用的氮源是通常已知的铵盐，如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵、尿素、液态氨或氨水。所用的复合有机氮源是酪蛋白氨基酸、玉米浸渍液、豆粉水解物、酵母提取物、生物量水解物和蛋白水解物。
可以使用的无机盐是磷酸盐、镁盐、钙盐、钾盐、钠盐、铁盐、锰盐、锌盐、铜盐，及其它微量元素，如果需要。另外，如果需要，可以使用维生素如生物素、硫胺等。
本发明的培养条件与已知的氨基酸发酵培养条件相同。尽管发酵液的组成根据L-氨基酸或所用菌株而变化，但是培养温度为25-50C，优选30-45℃。关于pH值，当pH值处于中性范围时能获得良好的结果。当使用蛋白水解物作为复合氮源时，其中所含的脯氨酸含量有利地是计算进补加的脯氨酸量中。由水解物来源的脯氨酸的量由这些产物的天然组成限制，从而在本发明方法框架内加入另外的脯氨酸证明是有利的。
实施例本发明以下经实施例更详细地描述。
为此，用下列氨基酸生产菌株进行试验，在试验中证明了本发明方法的优越性L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌DSM5715，(EP-B 0 435132)和L-苏氨酸及L-异亮氨酸生产菌株黄色短杆菌DSM5399，(EP-B 0 385 940)实施例1 L-赖氨酸的发酵生产用氢氧化钠将含2.5g/lNaCl、10g/l蛋白胨和10g/l酵母膏的培养基的pH调节为pH7.4，热灭菌后，每升培养基中加入40ml 50％葡萄糖溶液。用接种针挑取在脑心浸液琼脂板上培养48小时的谷氨酸棒状杆菌DSM5715接种到47ml所述培养基中，在购自Infors AG(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培养箱中于33℃以150rpm振荡培养20小时。然后用无菌生理盐水洗细胞，在Beckman离心机J 6B中以4000rpm离心20分钟分离细胞。
为了在摇瓶中进行主培养，在1升烧杯中称入40g(NH4)2SO4，0.5gKH2PO4，0.5g K2HPO4，0.25g MgSO4·7H2O和0.3g L-亮氨酸，并向其中加入750ml蒸馏水。还加入1ml微量元素盐溶液，该微量元素盐溶液含有溶解于100ml蒸馏水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02g CuSO4和0.002g NiCl2·6H2O，该溶液用几滴HCl稍加酸化以增加盐的溶解。另外，还加入1ml 0.02g生物素在100ml蒸馏水中的溶液。随后加入NaCl至浓度为5g/l。将这-培养基分成45ml的等份，置于500ml Erlenmeyer烧瓶中，并调节脯氨酸至0.1-10g/l的各种浓度。在121℃热灭菌20分钟后，向每个烧瓶中加入单独灭菌的12ml 50％葡萄糖溶液和1.2g无菌CaCO3。然后用前述已在无菌状态下洗涤的培养基中的细胞接种，洗涤的细胞的光密度为18.5(测定用波长535nm)，用7.7ml这种悬液接种57ml培养基。
在购自Infors AG(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培养箱中于33℃以150rpm振荡培养72小时，随后测定光密度(OD)(购自Dr.Lange，德国柏林的分光光度计LP2W)及培养悬液中的L-氨基酸的浓度。用购自Eppendorf BioTronik(德国汉堡)的氨基酸分析仪经离子交换层析及利用茚三铜的柱层析后反应分析氨基酸。测试结果见表1。
表1脯氨酸(g/l)OD 535nm赖氨酸(g/l)024.6 23.60.5 30.5 29.4实施例2 L-苏氨酸的发酵生产将含有100g/l蔗糖、12g/l(NH4)2SO4、100ml/l大豆粉水解物、0.5gKH2PO4、0.5g K2HPO4、0.25g MgSO4·7H2O、5.0g/l NaCl和1ml微量元素盐溶液的培养基的pH调节为7.0并高压灭菌。该微量元素盐溶液由溶解于100ml去离子水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02g CuSO4和0.002g NiCl2·6H2O及几滴1N HCl组成。
将各1ml的0.2mg/l生物素和硫胺储存液(已过滤除菌)加入到培养基中。将10.0g/l CaCO3与摇瓶一起灭菌。培养基中由引入豆粉水解物产生的脯氨酸浓度为0.34g/l。向过滤除菌的培养基中加入来自脯氨酸储存溶液的规定浓度的脯氨酸。
将在脑心浸液琼脂板上培养72小时的DSM5399悬浮于10ml无菌生理盐水中，将10ml培养基等份置于100ml Erlenmeyer摇瓶中并接种100μl上述细胞悬液。于30℃以300rpm振荡培养72小时，之后如实施例1所述，测定波长660nm的OD及苏氨酸的浓度。测试结果见表2。
表2脯氨酸(g/l)OD 660nm苏氨酸(g/l)0.3451.2 0.630.6652.6 1.29实施例3 L-异亮氨酸的发酵生产将含有100g/l蔗糖、12g/l(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.25g MgSO4·7H2O、5.0g/l NaCl和1ml微量元素盐溶液的培养基的pH调节为7.0并高压灭菌。该微量元素盐溶液由溶解于100ml去离子水中的1.0g FeSO4·7H2O，1.0g MnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.02gCuSO4和0.002g NiCl2·6H2O及几滴1N HCl组成。
将各1ml的0.2mg/l生物素和硫胺储存液(已过滤除菌)加入到培养基中。将10.0g/l CaCO3与摇瓶一起灭菌。培养基中由引入豆粉水解物产生的脯氨酸浓度为0.34g/l。向过滤除菌的培养基中加入来自脯氨酸储存溶液的规定浓度的脯氨酸。
将在脑心浸液琼脂板上培养72小时的DSM5399悬浮于10ml无菌生理盐水中，将10ml培养基等份置于100ml Erlenmeyer摇瓶中并接种100μl上述细胞悬液。于30℃以300rpm振荡培养72小时，之后如实施例1所述，测定波长660nm的OD及异亮氨酸的浓度。测试结果见表3。
表2脯氨酸(g/l)OD 660nm异亮氨酸(g/l)051.2 0.180.1 52.0 0.3权利要求
1.通过培养产生并分泌L-氨基酸的棒状杆菌而发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于优选地在发酵开始时向含有已知碳源和氮源的发酵液中加入L-脯氨酸。
2.权利要求1的方法，其特征在于基于发酵液，L-脯氨酸的加入量为0.01-10g/l。
3.权利要求2的方法，其特征在于基于发酵液，L-脯氨酸的加入量为0.1-2.5g/l。
4.权利要求1-3的方法，其特征在于发酵是在最小培养基和/或确定成分培养基中进行。
5.权利要求1-3的方法，其特征在于发酵是在含有水解物的培养基中进行。
6.权利要求1-5的方法，其特征在于生产出L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸或L-缬氨酸。
7.权利要求1-6的方法，其特征在于使用棒状杆菌属的微生物。
全文摘要
本发明涉及使用棒状杆菌发酵生产L－氨基酸的方法,其中向发酵液中加入L－脯氨酸作为渗透保护物质以抑制高渗透压力对细胞的效应。
文档编号C12P13/06GK1257930SQ9912209
公开日2000年6月28日 申请日期1999年10月28日 优先权日1998年10月28日
发明者乌尔里希·贝克尔, 海丁·波得, 苏珊·莫尔巴赫, 伊洛娜·瓦尔格, 赖因哈德·克雷默, 瓦尔特·普费弗勒 申请人:德古萨－于尔斯股份公司