一种利用水产品下脚料制备抗菌饲料蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用水产品下脚料制备抗菌饲料蛋白的方法，属于水产品加工与利用领域。
【背景技术】
[0002]目前中国每年生产的大约21万吨抗生素原料中有9.7万吨用于畜牧养殖业，占年总产量46.1%。过量的使用抗生素不仅导致了养殖动物对抗生素药物的耐药性，使养殖动物的抗病能力下降，而且这些抗生素会随食物链进入人体，使人体在无意中产生耐药细菌，一旦生病就会增加治疗难度和费用，甚至有可能会产生“超级细菌”，出现无药可治的情况。随着人们生活质量的不断提高，对各类食品包括肉食品的卫生安全有了更高的要求，对“放心肉”、“绿色食品”的呼声也日渐强烈。因此，寻找抗生素的绿色替代品是我国饲料和养殖行业发展中亟待解决的问题。
[0003]作为饲用抗生素的一种替代品，抗菌肽通常具有耐热、抗菌谱广、水溶性好和不易产生耐药性等特性，近年来备受关注。抗菌肽的来源于动物、植物和微生物，但动植物源抗菌肽由于来源有限，应用受到了限制；而微生物抗菌肽可以大规模生产，成本相对较低，因而微生物源抗菌肽更有应用前景。目前微生物源抗菌肽研宄最多的是乳酸菌的抗菌肽，而国际上对枯草芽孢杆菌产生的枯草菌素这种新型细菌素类抗菌肽研宄则很少，国内更是少见。工业微生物(2008，38 (4):14?18)公开了一种枯草芽孢杆鬼〈Bacillus subtil is) FB123产枯草菌素的液体发酵条件，但是对于枯草菌素的固态发酵生产还没有研宄报道。
[0004]1988年乳酸链球菌素首次作为食品添加剂得到FDA的认可，已有超过100个国家和地区在使用乳酸链球菌素作为食品防腐剂。抗菌肽在食品上的直接使用，这也说明了抗菌肽对动物和人类是安全的。但目前，由于高昂的生产成本使得抗菌肽的应用主要在食品领域，而在饲料行业的应用很少。因此急需降低抗菌肽的生产成本，以促进抗菌肽在饲料工业的应用。
[0005]固体发酵具有投资低和运行成本低的特点；并且发酵产物直接干燥和粉碎制备成成品，大大降低了后处理成本。因而，与液体发酵相比，固体发酵生产抗菌肽可明显降低抗菌肽的生产成本。专利CN101381757A “抗菌肽的固体发酵法制备及应用”公开了一种抗菌肽的固体发酵方法。南京农业大学2010年硕士论文《ifeci77w5.amyloliquefacies ES_2_4抗菌脂肽固态发酵工艺的研宄》公开了一种淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽的固态发酵生产工艺。固态发酵生产抗菌肽虽然能大大降低抗菌肽的生产成本，但是目前很少有固态发酵的抗菌肽产品应用于饲料工业中。
【发明内容】
[0006]固体发酵法生产的抗菌肽成品虽然能降低抗菌肽的生产成本，但由于含量低，低剂量的抗菌肽成品不能在饲料中发挥有效的作用；高剂量的抗菌肽成品又影响饲料的配方设计。针对目前固体发酵的抗菌肽产品存在的这一问题，本发明的目的是制备成一种抗菌饲料蛋白，以显著增加固体发酵的抗菌肽类产品在配合饲料中添加量而又不影响饲料配方的设计。
[0007]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:一种利用水产品下脚料制备抗菌饲料蛋白的方法，包括如下步骤:
(1)将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌(^3ci77i/5.subtil is) HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 V、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌?BaciIIussub tills') HL-1种子液备用；
(2)将新鲜的水产品下脚料绞碎后备用，将植物饲料蛋白粉碎后过60目筛备用；
(3)将步骤(2)制得的绞碎的水产品下脚料和粉碎后过60目筛的植物饲料蛋白按质量比为0.5~1.5:1的比例混合，并加营养物和水混匀，获得最终水分含量控制在40%?80%范围内的发酵培养基；
(4)将步骤(3)获得的混匀的发酵培养基于121°C灭菌30min;
(5)将步骤(4)获得的灭菌后的发酵培养基冷却至室温，然后接入步骤(I)所制备的枯草芽孢杆菌{BacillusHL-1种子液，并混勾；
(6)原料的发酵:将步骤(5)获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵:发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm?8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在28 0C ~30°C，发酵时间为35h?45h ；
(7)成品处理:发酵结束，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了一种利用水产品下脚料制备的抗菌饲料蛋白成品。
[0008]所述步骤(I)中接入的枯草芽孢杆菌HL-1能产生枯草菌素，该菌已于2015年I月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.10379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0009]所述步骤(2)中的水产品下脚料为罗非鱼下脚料、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、鲤鱼下脚料、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种；所述步骤(2)中的植物饲料蛋白为豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一种或其中两种以上的组合物。。
[0010]所述步骤(3)中的营养物为葡萄糖、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物；所述步骤(3)中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为:葡萄糖0.01%?5%，氯化亚铁0.01%?5%，磷酸氢二钾0.01%?5%O
[0011]所述步骤(5)中枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5.subtilis)VL~\种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%?5%。
[0012]本发明跟现有的技术相比，有如下优点。
[0013](I)抗菌肽产品蛋白质含量高，用于饲料工业可灵活地进行配方设计。本发明制备的抗菌饲料蛋白的蛋白质含量大于50%，这一含量与三级鱼粉的蛋白质含量持平。本发明制备的抗菌饲料蛋白在对虾配合饲料中添加量甚至可达20%以上，并且不影响对虾配合饲料配方的设计。
[0014](2)富含营养小肽。本发明由于发酵培养基蛋白含量高，发酵过程中会大量的营养小肽，这不但会提高蛋白质的利用率，而且还有明显的促生长效果。
[0015]本发明提供了一种利用水产品下脚料制备抗菌饲料蛋白的方法。本发明得到的抗菌饲料蛋白在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，用本发明生产的抗菌饲料蛋白配合的饲料，不但可提高饲养动物的生长效果，而且还可提高饲养动物的免疫力和抗病力，可直接用来配制无抗饲料，具有良好的应用前景和社会意义。
【具体实施方式】
[0016]为了更好地理解本发明，下面就水产品下脚料与植物饲料蛋白的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
[0017]实施例1:将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌subtil is)HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 °C、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌HL-1种子液备用。将新鲜的罗非鱼下脚料绞碎后备用；将豆柏粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的罗非鱼下脚料和100公斤粉碎并过60目筛的豆柏混合，并加入400克葡萄糖、200克氯化亚铁、500克磷酸氢二钾和10公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养基于121°C灭菌30min ;接着往灭菌后冷却的发酵培养基中加入2公斤枯草芽孢杆菌{BacillusHL-1种子液，搅拌并混合均勾；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为8厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为28°C，发酵时间为45h ;发酵结束后，将发酵后获得的产品经干燥、粉碎和包装后，即制得了本发明所述的一种利用水产品下脚料制备的抗菌饲料蛋白成品。
[0018]实施例2:将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌subtil is)HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37