降解的方法

降解的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品化学及食品微生物技术领域，涉及应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒 素&降解的方法，涉及提高菌菇对黄曲霉毒素1降解能力的培养基和培养基后期营养补充 液。
【背景技术】
[0002] 20世纪60年代在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件，经调查确认这起事 件与从巴西进口的花生柏有关，这些花生柏被一种来自真菌的有毒物质污染，最终使人们 发现了是由黄曲霉（Aspergillus,flavus)产生的有毒代谢物质，称为AFB1OAFB1是一 类由黄曲霉（Aspergillusflavus)、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus)以及特曲霉 (A.nomius)等真菌产生的次级代谢产物，无色、无味、无嗅，是一类具有二氢呋喃杂氧萘环 结构的衍生物的总称。AFB1是已发现真菌毒素中危害性最大的一种。
[0003] AFB1是一种毒性极强的剧毒物，无论对人还是多种动物都表现出剧烈的毒性，而 且具有明显的致癌、致畸、致突变能力。AFBj^靶细胞在肝脏，中毒后还会产生黄疸、低烧、 沮丧、厌食和腹泻等典型而又非特异性的变化。在AFB1家族里，毒性最大的AFBi，其毒性是 氰化钾的10倍，砒霜的68倍，二甲基亚硝胺的75倍。八?81还可以与体内的tRNA结合形成 加成物质，从而抑制与氨基酸的结合，对体内合成必须氨基酸产生不同程度的抑制，干扰蛋 白的合成，影响细胞代谢。
[0004] 黄曲霉毒素B1能污染多种农作物，如玉米，花生，大米，油料种子和香料等，在我 国，以玉米和花生中污染最为严重。由于其污染范围较广且毒性较强，黄曲霉毒素被普遍认 为是一种造成全球范围危害的真菌毒素。并且，黄曲霉毒素B1具有稳定的耐热性，且通过正 常的烹饪手段难以将其去除，更增加了其危害性。鉴于此，开展如何去除AFB1的研宄迫在眉 睫，并且具有重要意义。目前，黄曲霉毒素的生物学脱毒方法主要有以下两种：微生物菌体 吸附去除黄曲霉毒素：例如鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌干酪亚种 及某些酿酒酵母等，上述菌株能通过物理吸附方式与黄曲霉毒素结合，形成毒素-菌体复 合物，但如何将复合物从食品和饲料中分离去除，成为有待于解决的难题。微生物代谢产生 的酶降解黄曲霉毒素：例如从嗜麦窄食单胞菌、诺卡氏菌、假密环菌、分枝杆菌及红串红球 菌中提取出的降解酶，此方法降解效率高，降解条件温和，成本低而受到越来越多的关注。
[0005] 有实验证明大型真菌也具有降解毒素能力。平菇可降解木质素，这是一个氧化过 程，降解木质素的酶系主要有木质素过氧化物酶（LiP)、锰过氧化物酶（MnP)、漆酶（Lac)和 藜芦醇氧化酶（VAO)，其中起主要降解作用的是漆酶（Lac)。平菇菌丝能够产生降解纤维素 的酶一一漆酶。有研宄者从可食用的真菌平菇中筛选到降解黄曲霉毒素的菌株，该菌株经 发酵培养可产生漆酶，是安全无毒的，可以直接食用。试验表明，农业废弃物（如稻草、棉籽 壳等）被平菇等真菌降解后，其营养价值明显得到提高，可有效改善动物粗饲料贫乏的状 况。虽然平菇来源容易，但是平菇漆酶存在酶活性不稳定、降低毒素能力还有待于进一步提 高的缺点，而提高平菇降解黄曲霉毒素能力又遇到瓶颈。榆黄菇是一种可在榆树等阔叶树、 玉米芯、稻草培养基上生长发育的可食用真菌，具有降解纤维素、木质素等物质的能力，榆 黄菇来源广泛、容易培养。香菇不仅是人们日常生活中的美味食物，而且是一类降解能力相 当强的白腐真菌，富含具有降解能力的多种酶，且易于提取并具有较高的耐热性。但国内外 对榆黄菇与香菇降解黄曲霉毒素的研宄处于空白，寻求适用的新菌菇资源、探索有效毒素 降解方法和方式、提供特定培养基成为急需解决的问题。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的：提供降解黄曲霉毒素菌菇新资源；提供更有效的黄曲霉毒素&降 解方法，科学步骤和参数。
[0007] 本发明解决的技术问题：寻找到高效降解黄曲霉毒素菌菇新资源榆黄菇和香菇； 克服平菇漆酶存在酶活性不稳定、降低毒素能力不高的缺点，提供具体的用榆黄菇或香菇 对黄曲霉毒素&进行降解的方法及科学步骤和参数；提供特定培养基和特定营养补充液， 并采用协同方式进行培养，大大提高毒素降解能力。
[0008] 本发明的技术方案：
[0009] 一种应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素&进行降解的方法，其特征在于按以下步骤 进行：
[0010] (1)菇菌活化：将榆黄菇或香菇从PDA试管斜面转接到YEH)固体平板中央， 30-32°C恒温培养5-6d，进行活化；
[0011] ⑵菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有IOOmLMSM液体培养 基的三角瓶中，25-28°C、80-200rpm摇床培养4-5d，榆黄菇培养条件的pH= 5-6,香菇培养 条件的pH= 3-3. 5 ;然后7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0. 22ym滤膜过滤后，即得 无菌发酵液，置于4°C冰箱中备用；
[0012] (3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液800-1200yL，优选1000yL;加入到2.OmL灭 菌离心管中，向离心管中加入0. 05mLIOOjOOngAiLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于 25-35°C(榆黄菇35°C或香菇25°C)，pH值为5. 5-6. 5,转速80-200rpm，摇床培养6-8d，得 混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心l-5min，得降解了黄曲霉毒素&的上清液，记为 S液。后续将上清液，即S液，加入到三角瓶中，再向三角瓶中加入4-5mL乙腈-水（V:V= 84:16)，剧烈震荡15min，然后将三角瓶中的溶液加入到IOmL离心管中，静置30min，取下层 清液2mL加到氮吹试管中，于60°C氮气吹干，再用甲醇-水溶液（V:V= 1:9)溶解出AFB1, 经0. 22um滤膜过滤后，上机测定；降解率计算：降解率=(1 -S液中八?81浓度/标准品中 AFB1 的浓度）xlOO%。
[0013] 一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于按以下步骤 进行：
[0014] (1)菇菌活化：将榆黄菇或香菇从PDA试管斜面转接到YEro固体平板中央，30°C 恒温培养5d，进行活化；
[0015] (2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有IOOmL特定液体培 养基的三角瓶中，分两个阶段培养，第一阶段：先于25-28°C、榆黄菇pH= 6或香菇pH= 4、 150-200rpm摇床培养1-1. 5天；第二阶段：再于30-35°C、榆黄菇pH= 5或香菇pH= 3， 80-90rpm摇床培养3-4天，并且在第二阶段开始补充营养补充液10mL，7000-8000rpm离心 5-8min，上清液经0. 22ym滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4°C冰箱中备用；其中特定 液体培养基按如下组分与配比制备：可溶性淀粉l〇g，蔗糖5g，葡萄糖5g，胰蛋白胨2. 0g， KH2PO4O. 17g，MgSO4 ? 7H20 0? 36g，CaCl2 ? 2H20 0? 37g，吐温 800. 5mL，微量元素溶液 80mL， 121°C灭菌20min，冷却得到；其中，I升微量元素溶液：MgSO4.7H20 0. 3g，MnS04 .H2O0. 05g， CoCl2 *6H20 0.Olg,ZnSO4 *7H200.Olg,CuSO4 *5H20 0.Olg,KAl(SO4) 2 ? 12H20lmg,H3BO3Img, Na2MoO4 ? 2H20或Na2MoO4Img,余量为无菌纯净水；其中，I升营养补充液：胰蛋白胨2. 0g、甘 氨酸I.Og、硝酸钠I.Og、CuSO4 ? 5H20 0. 5g、余量为无菌纯净水，121°C灭菌20min，冷却得 到；
[0016] (3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液800-1200yL，优选1000yL;加入到2.OmL灭 菌离心管中，向离心管中加入0. 05mLIOOjOOngAiLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于 25-35°C(榆黄菇35°C或香菇25°C)，pH值为5. 5-6. 5,转速150-200rpm，摇床培养6-8d，得 混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心l-5min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液。记为 S液。后续将上清液，记S液，加入到三角瓶中，再向三角瓶中加入4-5mL乙腈-水（V:V= 84:16)，剧烈震荡15min，然后将三角瓶中的溶液加入到IOmL离心管中，静置30min，取下层 清液2mL加到氮吹试管中，于60°C氮气吹干，再用甲醇-水溶液（V:V= 1:9)溶解出AFB1, 经0. 22um滤膜过滤后，上机测定；降解率计算：降解率=(1 -S液中八?81浓度/标准品中 AFB1 的浓度）xlOO%。
[0017] -种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素&降解能力的方法，其突出性特点，使用了 所述的特定培养基和所述的营养补充液协同培养。
[0018] 本发明的MSM培养基选用最低盐MSM培养基。
[0019] 本发明的有益效果：对黄曲霉毒素B1的降解率达79-87%。
[0020] (1)本发明尝试使用榆黄葫和香葫来降解黄曲霉毒素，虽然榆黄葫、香葫与平葫都 属于常见真菌，但子实体生理生化特性也存在诸多差异，使用榆黄菇、香菇是也是从成千上 万种真菌中筛选出来的，这本身就具有创新性。提供了一种应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒 素B1进行降解的具体方法，提供了科学的步骤和参数，这些参数的获得是付出了创造性劳 动的，尤其提供了一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法。
[0021] (2)创造性的采用特定培养基和特定补充液协同方式进行培养，能够显著提高降 解能力。漆酶为一种次生代谢产物，一般在营养匮乏的时候才开始分泌，而且通常认为漆酶 在低碳