验鱼随机分为对照组、I、II、III组， 每组3个重复。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂0.5,1.0和2.0%环-(苯丙氨酸-丝氨 酸）。每天投喂两次（9:00和15:00)，投喂量占体重的3%。
[0022] 对照组饲料配方按重量份：进口鱼粉15. 23、国产鱼粉15. 6、棉柏7. 5、菜柏6. 3、 蚕蛹4. 4、墨鱼粉2. 4、血球蛋白粉3. 2、豆柏18. 62、维生素预混料1. 0、花生柏9. 68、面粉 25. 42、鱼油2. 4、玉米6. 5、矿物质预混料2. 0。
[0023] 试验组I饲料配方按重量份：进口鱼粉15. 6、国产鱼粉15. 84、环-(苯丙氨 酸-丝氨酸）〇. 5、蚕蛹3. 5、豆柏16. 5、血球蛋白粉2. 45、花生柏7. 0、面粉30. 2、维生素预 混料1. 0、鱼油2. 2、玉米5. 5、矿物质预混料2. 0、棉柏5. 6、菜柏5. 3、墨鱼粉2. 3。
[0024]试验组II饲料配方按重量份：进口鱼粉15.36、国产鱼粉15.38、环-(苯丙氨 酸-丝氨酸）1. 0、蚕蛹4. 25、棉柏6. 8、血球蛋白粉2. 56、菜柏5. 2、豆柏18. 75、墨鱼粉2. 5、 花生柏8. 84、面粉26. 2、维生素预混料1. 0、鱼油2. 5、矿物质预混料2. 0、玉米6. 3。
[0025] 试验组III饲料配方按重量份：进口鱼粉15. 23、国产鱼粉15. 6、棉柏7.5、环-(苯 丙氨酸-丝氨酸）2. 0、菜柏6. 3、蚕蛹4. 4、墨鱼粉2. 4、血球蛋白粉3. 2、豆柏18. 62、维生 素预混料1. 0、花生柏9. 68、面粉25. 42、鱼油2. 4、玉米6. 5、矿物质预混料2. 0。
[0026] 维生素预混料： 盐酸硫胺素，15mg;核黄素，20g;叶酸，I. 5g;盐酸啦咳醇，4g;尼克酸，80g;泛酸I丐， 28g;肌醇，40g;生物素，0.6g;VitB3,30mg;VitB9,3.0mg;VitB12,0.01g;VitA，6000IU; VitD3,0.005g;VitC，200mg;VitD，2000IU;VitE，50mg;VitK，5.0mg，载体为脱脂米糠。
[0027] 矿物质预混料： 磷酸二氢钠，450g;氯化钾，129g;七水硫酸镁，102g;五水硫酸铜，0. 6g;柠檬酸铁 150mg;七水硫酸锌，80mg;-水硫酸锰，3. 25g;六水三氯化铝，0. 15g;碘化钾，0. 23g;亚硒 酸钠，〇?Olg;七水硫酸钴〇? 〇30g; 实施例3 免疫测定的血液样本 饲养7、14和21d时收集血样。因此每个处理组的每个缸子总共取15尾鱼进行免疫检 测。试验鱼被注射过量MS-222进行安乐死后，用2. 5mL注射器进行尾静脉取血。每条鱼只 取样一次，以避免多次取血和手挤压对检测的影响。白细胞分离参考Arddet等（2009)的 方法。
[0028] 实施例4免疫学检测 白细胞菌能力的测定采用Mathews等（2012)的方法，血清杀菌活性参照Secombes 等（2011)的方法。溶菌酶活性测定采用Parry等（2013)方法。
数据用平均值土标准差表示，凡标有不同小写字母者表示组间差异显著（代〇. 05)。下 表同
实施例5IL-IP基因的表达 免疫相关基因表达的检测方法在Yang等（2012)的基础上进行小的改动。总RNA提取 采用TRIzolReagent(simgen)。实时荧光定量PCR采用THUNDERBIRDSYBRqPCRMixKit (T0Y0B0)试剂盒，在astratageneMxProSystem(stratagenemx3005p,USA) 96孔板上进 行操作反应。每个引物的扩增效率在97.2%-99. 5%之间。反应体系为10uLTHUNDERBIRD SYBRqPCRMix，luL上游引物和下游引物（10mM)和IuLcDNA，最后添加超纯水至总体 积为20ul。反应条件为：95°C30s，95 °C5s，60°C10s进行40个循环。每个PCR管设 置3个重复。数据米用stratageneMxPro(stratagenemx3005p,USA)软件分析。
[0030] 实施例6抗病力 从病鱼体内分离出嗜水气单胞菌，接种在TSB培养基中，28 °C条件下进行孵育。培养 物1500rpm离心15min，沉淀的细胞清洗后，将所需的剂量保存在磷酸盐缓冲盐水中。饲养 21d后，剩下的25条鱼通过腹腔注射半致死浓度的细菌，半致死浓度通过预试验确定为3. 5 XlO7cfu/mL。观察15d，记录死亡率。15d内相对生存率=1-(试验组死亡率/对照组死 亡率）XlOO
注：放养在10亩池塘中，饲养3个月后的出塘情况 从上述的试验结果表明，从海洋细菌/wtit/a中分离出活性次级代谢产 物，并将其不同剂量添加在饲料中饲喂乌鳢，通过免疫反应的影响来评价其活性。应用层析 技术获得纯化的代谢分子，并通过光谱数据(质谱和核磁共振）确认添加剂化合物。结果饲 喂该活性成分的饲料后，其非特异性免疫指标(溶菌酶活性、噬菌活性和杀菌活性）显著升 高，上调IL-IP基因的表达。攻毒后，饲喂活性成分的乌鳢成活率显著高于对照组，表明 从海洋细菌/WdVa分离出来的活性成分环-(苯丙氨酸-丝氨酸）对免疫反 应有积极影响，并能够增强乌鳢对嗜水气单胞菌的抗病能力，同时进行生产试验，表明搭配 养殖充分利用水体，添加免疫增强剂，提高免疫力，促进生长，从而提高经济效益。
【主权项】
1. 环-(苯丙氨酸-丝氨酸）作为提高抗病能力及促生长的乌鳢饲料添加剂的应用。2. -种乌鳢的配合饲料，其特征在于：添加了上述的饲料添加剂，按质量份： 进口鱼粉15. 2~16. 0、国产鱼粉15. 3~19. 0、环-(苯丙氨酸-丝氨酸）0. 5~2. 0、维 生素预混料1. 〇、蚕蛹3. 5~4. 5、血球蛋白粉2. 40~3. 2、矿物质预混料2. 0、豆柏16. 0~ 19. 00、花生柏7. 0~10. 0、面粉25. 40~31. 00、鱼油2. 12~2. 6、玉米5. 5~6. 5、棉柏 5. 6~7. 5、菜柏5. 2~6. 3、墨鱼粉2. 3~2. 5,混合后，膨化。3. 根据权利要求2所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：添加了上述的饲料添加 剂，按质量份： 进口鱼粉15. 23~15. 6、国产鱼粉15. 38~15. 84、环-(苯丙氨酸-丝氨酸）0.5~ 2. 0、维生素预混料1. 0、蚕蛹3. 5~4. 4、血球蛋白粉2. 45~3. 2、矿物质预混料2. 0、豆柏 16. 5~18. 75、花生柏7. 0~8. 84、面粉25. 42~30. 2、鱼油2. 2~2. 5、玉米5. 5~6. 5、 棉柏5. 6~7. 5、菜柏5. 2~6. 3、墨鱼粉2. 3~2. 5,混合后，膨化。4. 根据权利要求3所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于： 进口鱼粉15. 6、国产鱼粉15. 84、环-(苯丙氨酸-丝氨酸）0.5、蚕蛹3. 5、豆柏16. 5、血球蛋白粉2. 45、花生柏7. 0、面粉30. 2、维生素预混料1. 0、鱼油2. 2、玉米5. 5、矿物质预 混料2. 0、棉柏5. 6、菜柏5. 3、墨鱼粉2. 3。5. 根据权利要求3所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于： 进口鱼粉15. 36、国产鱼粉15. 38、环-(苯丙氨酸-丝氨酸）1.0、蚕蛹4. 25、棉柏6. 8、血球蛋白粉2. 56、菜柏5. 2、豆柏18. 75、墨鱼粉2. 5、花生柏8. 84、面粉26. 2、维生素预混料 1. 0、鱼油2. 5、矿物质预混料2. 0、玉米6.3。6. 根据权利要求3所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于： 进口鱼粉15. 23、国产鱼粉15. 6、棉柏7.5、环-(苯丙氨酸-丝氨酸）2.0、菜柏6.3、蚕蛹4. 4、墨鱼粉2. 4、血球蛋白粉3. 2、豆柏18. 62、维生素预混料1. 0、花生柏9. 68、面粉 25. 42、鱼油2. 4、玉米6.5、矿物质预混料2. 0。7. 根据权利要求2、3、4、5或6所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：所述的维 生素预混料：盐酸硫胺素，15mg ;核黄素，20g ;叶酸，I. 5g ;盐酸啦咳醇，4g ;尼克酸，80g ;泛 酸钙，28g;肌醇，40g;生物素，0.6g;Vit B3,30mg;Vit B9,3.0mg;Vit B12,0.01g;Vit A， 6000IU ;Vit D3,0.005g;Vit C，200mg;Vit D，2000IU;Vit E，50mg;Vit K，5.0mg，载体为脱 脂米糠。8. 根据权利要求7所述的一种乌鳢的配合饲料，其特征在于：所述的矿物质预混料： 磷酸二氢钠，450g ;氯化钾，129g ;七水硫酸镁，102g ;五水硫酸铜，0. 6g ;梓檬酸铁150mg ; 七水硫酸锌，80mg ;-水硫酸锰，3. 25g ;六水三氯化铝，0. 15g ;碘化钾，0. 23g ;亚硒酸钠， O.Olg;七水硫酸钴0.030g。9. 一种乌鳢综合饲养的方法，它包括： (1) 每10亩塘放养体长10-15cm左右的乌鳢鱼种50000尾、搭配养殖的鱼类有：鲢（30g /尾）2000尾，鳙（20g /尾）800尾，鲤（40g /尾）800尾，鲫（30g /尾）800尾，细鳞斜 颂鲴（20g /尾）500尾； (2) 先将鲢鱼、鳙鱼放养鱼池中，适应3d，每亩施用光合细菌200g调水2d后放养鲤、鲫 和细鳞斜颂鲴； (3) 乌鳢鱼苗饥饿2d，投喂权利要求2所述的一种乌鳢配合饲料驯食，待3~5d完全 摄食后，再与鲢、鳙、鲤、鲫和细鳞斜颂鲴混养； (4) 每天投喂权利要求2所述的一种乌鳢配合饲料，三个月后捕捞。
【专利摘要】本发明公开了一种乌鳢的抗病免疫增强剂环-(苯丙氨酸-丝氨酸)，提供的一种乌鳢配合饲料中添加了海洋细菌<i>Pseudomonas？putida</i>代谢物环-(苯丙氨酸-丝氨酸)，具有提高乌鳢抗病能力及促进生长的作用；喂食配合饲料后通过免疫学检测，实验组乌鳢的血清溶菌酶活性、血清噬菌能力、血清杀菌能力均有显著提高，最大值分别为78.26U/mL、63.52U/mL、75.69U/mL，远超过对照组的17.23U/mL、20.96U/mL、39.36U/mL；上调了实验组乌鳢IL-1β基因的相对表达为25.81，对照组仅为2.45；通过向鱼腹腔注射半致死浓度细菌检测其抗病能力，15天后实验组累计死亡率最小为36%，对照组为68%，实验组成活率显著高于对照组；本发明提供的综合饲养方法，搭配养殖充分利用水体，添加免疫增强剂，提高免疫力，促进生长，从而提高经济效益。
【IPC分类】A23K1/16, A23K1/10, A61K38/12, A23K1/14, A01K61/00, A23K1/18, A61P37/04
【公开号】CN105076861
【申请号】CN201510576866
【发明人】王桂芹, 郑伟, 闫先春, 夏长革, 冯伟志, 刘凡宁, 田佳鑫, 杨秋实
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月12日