专利名称：静脉注射用免疫球蛋白及其产物的制造方法
技术领域：
本发明的背景本发明涉及生产静脉给药的含IgG(γ球蛋白)为主要成分的免疫球蛋白的多步骤的完整的工业生产方法。
已知多种可以从人血浆科恩分级分离(Cohn fractionation)得来的原料中获得静脉给药的γ球蛋白溶液的方法。某些科恩级分(fraction)比其它的科恩级分含更高效价的γ球蛋白。常用的制造γ球蛋白溶液的原料为科恩级分II或科恩级分II+III。
尽管现有技术的方法采用了多种分离和灭菌技术，人们却在不断寻找改良过程以提高终产物的纯度和安全性以及总产量。
许多工业生产方法采用了溶剂/去污剂步骤使病毒灭活，或者热处理步骤使病毒灭活。目前，本领域尚未提供一种多步骤方法，从科恩级分II糊状物或科恩级分II+III糊状物开始，包括两个不同病毒灭活的步骤，这两个步骤作为高效、连续的高产量γ球蛋白制造过程的一部分。
Kameyama等人的美国专利5,151,499号涉及生产病毒被灭活了的蛋白质组合物的方法，其中在溶剂/去污剂处理蛋白质组合物时，对有包膜的病毒蛋白质组合物进行了病毒灭活，在热处理蛋白质组合物时，对无包膜的病毒进行了病毒灭活。专利5,151,499号指出，优选在有蛋白酶抑制剂存在时，首先进行溶剂/去污剂步骤，然后进行热处理。如果热处理在液态时进行，在热处理之前，先通过离子交换柱的吸附作用将蛋白质从溶剂/去污剂中回收。在有糖、糖醇或氨基酸稳定剂存在时，进行液态热处理。尽管专利5,151,499列出了很多包括免疫球蛋白在内的原料蛋白质组合物，其生产实例采用了因子IX、凝血酶、纤维蛋白原以及纤维结合蛋白。并未考虑通过分级分离除去在热处理中产生的变性蛋白质。
Yuki等人的美国专利5,371,196号涉及纯化分泌的免疫球蛋白A，描述了一种液态热处理和多种液态热处理和溶剂处理结合的灭活。每步后面都采用了聚乙烯乙二醇分级分离，而且总在最后一步。该专利不涉及高效价γ球蛋白的免疫球蛋白。
生产静脉注射用γ球蛋白溶液的一些现有技术的方法描述了在以科恩级分II+III糊状物为原料得多步骤纯化过程，在有山梨醇热稳定剂存在时，引入液态热处理。由Hirao等的美国专利4,845,199号中，科恩级分II+III进行聚乙烯乙二醇(以后成为PEG)分级分离(8％w/vPEG，然后是12％w/v PEG)，然后进行离子交换层析(DEAE-葡聚糖凝胶)，在有蛋白稳定剂山梨醇存在时进行液态热处理前，除去人血型抗体。另一方面，Hirao等人的美国专利4,876,088号中的实施例1描述了从科恩级分II+III糊状物中制备静脉注射用γ球蛋白溶液，其中糊状物悬浮在水中，其pH调至5.5，进行离心分离，然后取其上清液在有33％w/v的山梨醇存在时进行热处理灭活病毒，然后行PEG分级分离(6％/12％)，这样可以除去受热变性的蛋白质，然后进行其它纯化步骤，包括DEAE-葡聚糖凝胶离子交换层析。
发明的概述本发明的目的之一是提供一个由科恩分级分离方法生产高纯度的γ球蛋白溶液的整体的工业上可用的方法。
本发明的另外一个目的是提供非常纯的静脉给药的γ球蛋白溶液，其中不含有包括所有的热敏感病毒在内的包膜和无包膜的病毒。
本发明的另外一个目的是提供一个生产γ球蛋白的工业上可用的方法，能够在进行第二步病毒灭活前，除去高温灭菌时产生的任何变性蛋白质。
本发明的另外一个目的是提供一个连续生产γ球蛋白的工业上可用的方法，在进行过程中，中间不回收γ球蛋白，依次进行高温灭菌，PEG分级分离以及溶剂/去污剂病毒灭活。
本发明提供了对本领域的技术人员来说显而易见的上述或其它目的，其中可被部分纯化但富含γ球蛋白的醇化的科恩级分，在有热稳定剂存在时，在含水的介质中进行热处理以灭活病毒，然后对热处理溶液进行PEG分级分离，中间不回收γ球蛋白，然后在有溶剂(优选溶剂-去污剂混合物)存在时，进行第二步病毒灭活，以破坏有包膜的病毒，然后从溶剂或溶剂-去污剂混合物中分离出来。
在本发明的一个优选的实施方案中，在进行溶剂或溶剂-去污剂病毒灭活之前，将膨润土与收集的PEG分级分离产物进行混合以进一步除去病毒。
在本发明的一个优选的实施方案中，热稳定剂是山梨醇并且溶剂是三烷基磷酸盐。
在本发明的另外一个优选的实施方案中，在进行第二步病毒灭活之前，通过PEG分级分离除去热处理灭活病毒的变性产物，以获得极纯的经热处理的γ球蛋白。
在本发明的另外一个优选的实施方案中，在进行溶剂-去污剂处理之前，除去存在的任何颗粒物。
在本发明的优选的实施方案中，用阴离子交换树脂处理γ球蛋白溶液。
在本发明的优选的实施方案中，进行一步聚乙烯乙二醇分级分离步骤时，没有沉淀希望的γ球蛋白。
在本发明的另外一个优选的实施方案中，完成病毒灭活后，用阳离子交换树脂，或者二次过滤和/或正切流过滤处理γ球蛋白溶液。
在本发明的另外一个优选的实施方案中，提供了一种经高温灭菌和溶剂-去污剂灭菌的适用于静脉给药的γ球蛋白。
发明的详细说明这里公开的生产方法是一个连续的操作，在这种意义上，一旦该操作以一定数量的包含免疫球蛋白(如科恩级分II+III糊状物)的不纯的原料级分启动，该操作持续进行，中间不回收部分纯化的γ球蛋白，直到该操作结束(获得高纯度的γ球蛋白作为合成产物)。应注意，在这里公开的本方法的聚乙烯乙二醇分级分离步骤中，不回收作为中间产物的部分纯化的γ球蛋白糊状物。
含免疫球蛋白的级分被用作原料。这种级分没有特别限定在来源于人血浆以及含免疫球蛋白的级分的范围。这种含免疫球蛋白的级分的特例包括通过乙醇科恩分级分离得到的级分II+III和级分II，以及与此相当的含免疫球蛋白的级分的糊状物。其它的原料包括级分I+II+III，和级分II+IIIw以及级分III糊状物。原料可能含杂质，比如人血型抗体、血浆纤维蛋白溶酶原、血浆纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、激肽释放酶原激活剂、IgM、IgA、IgG聚合物(以后称为聚集物)等。
优选的原料为科恩级分II+III或科恩级分II糊状物。科恩级分II+III糊状物可被用作原料，或可首先经过预洗过程形成级分II+IIIw，级分II+IIIw以后被用于本发明的方法中。“级分II+IIIw”是经磷酸二钠溶液清洗的科恩级分II+III沉淀物。
通过将级分II+III沉淀物悬浮在冷水中可以得到级分II+IIIw，以便按每大约20体积水中加入大约1千克II+III糊状物的比例进行注射。加入磷酸钠使其终浓度达到大约0.003M磷酸钠以溶解脂类，脂蛋白类和白蛋白。加入冷乙醇使乙醇的最终浓度达到大约20％。添加乙醇过程中，温度被逐渐降低到-5±1℃，可使用例如醋酸缓冲液或稀释的氢氧化钠将pH保持或调节到7.2±0.1。形成的级分II+IIIw沉淀物通过离心分离和/或过滤回收，同时将温度保持在-5±1℃。在本发明第一次病毒灭活步骤之前，可进行各种初步的纯化和/或减少聚集物的步骤。例如，当使用级分II+IIIw糊状物(通常含大约20％乙醇和超过70％以IgG形式存在的蛋白质)时，可将其悬浮在3到20体积，优选10到15体积温度在大约0到5℃的冷水中，使用pH为4.0的醋酸缓冲液或盐酸将pH被调到4.5到6.0之间，优选5.0到5.5。将混合物搅拌大约2到15小时使所有的γ球蛋白溶解于溶液中。此后，可通过离心分离和/或过滤除去不被溶解的蛋白质如白蛋白和α球蛋白。
级分II+III糊状物作为原料，每千克级分II+III糊状物悬浮于3到20千克，优选13到17千克冷水中。悬浮液的pH被调节在4.5到6.0，优选4.8到5.4。在0到25℃，优选0到10℃混合悬浮液1到20小时，优选2到10小时。然后通过使用深层过滤或离心分离除去不溶解的物质。离心液或滤液可通过膜过滤器被进一步纯化。使用10,000到100,000分子量的切割(MWCO)膜进行超滤可将澄清液浓缩到大约1到12％，优选4到8％的蛋白质。
使用不同的原料科恩级分时，如果需要进行初步纯化以得到高IgG含量的级分以进一步处理，可适当选择本方法的起始步骤和其它步骤。例如，当科恩级分II(含超过95％IgG)从科恩级分III中分离出来，将科恩级分II进行进一步处理时，可以在酸性pH为3.2到5.0，优选3.8到4.2时开始处理(如Uemura等人的美国专利4,371,520号所希望的)，以使存在的免疫球蛋白聚集物分解为免疫球蛋白单体或二聚物，因为已知聚集物具有抗-互补活性(ACA)。作为另外一个选择，用科恩级分II+III作为原料，在Uemura等人的专利中，紧接着上述初步纯化步骤，在进行病毒灭活热处理步骤之前，可进行一个作为附加步骤的低pH处理。
对于高温灭菌步骤，可使用以从上述部分纯化后收集的含水混合物(如级分II+III糊状物的纯化滤液)的形式存在的免疫球蛋白，或可以将其通过超滤被浓缩到大约1到12％，优选4到8％后再使用，并向其中加入糖、糖醇和/或氨基酸热稳定剂。热稳定剂优选蔗糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇，最优选山梨醇。可以将糖或糖醇以粉末的形式加入到免疫球蛋白溶液中，或者先将其与少量水混合后再加入，以便使浓度为大约25到50w/w％，达饱和，优选30到40w/w％。这时，免疫球蛋白的水溶液含有足量的水以使得该溶液含大约1到8％总蛋白，通常级分II+III原料每千克糊状物含大约300克蛋白质。
加入热稳定剂之后，将溶液的pH调至4.5到6.5，优选5.0到6.0，将混合物在大约50-70℃下加热大约1-20小时，优选在大约60℃下加热10到11小时，以对热敏感病毒进行病毒灭活。热处理步骤不仅可以灭活病毒，而且通过蛋白质变性作用，可以优先降低某些正常情形下与科恩级分II+III结合的不需要的蛋白质的量，该蛋白质如激肽释放酶原、血浆纤维蛋白溶酶、血浆纤维蛋白溶酶原和IgA。
热处理之后，溶液可以直接处理或用冷水稀释到热处理过的溶液的体积的5倍。然后将溶液冷却到0-10℃，优选0到5℃。
然后，对热处理过的溶液进行PEG分级分离。PEG分级分离在纯化免疫球蛋白以将希望的IgG单体和二聚物从IgG聚集物或者其它天然存在于原料血浆蛋白级分中的杂质分离出来的领域中是公知的方法。然而，在本方法中，PEG分级分离同时完成了所需的IgG单体和二聚物与经热处理产生的不需要的变性的蛋白产物之间的分离。这些变性的蛋白产物是变性的激肽释放酶原激活剂、血浆纤维蛋白溶酶原、血浆纤维蛋白溶酶、IgA、IgM和聚集物。
可以使用现有技术中记载的任何PEG分级分离步骤，只要选择PEG的浓度和pH使得所需IgG单体和二聚物留在溶液中而不需要的蛋白质如聚集物沉淀在溶液外即可。PEG以粉末、薄片或50％的溶液的形式直接加入热处理过的溶液，以获得所需的PEG浓度。
例如，当使用级分II+IIIw糊状物作为原料时，在pH为大约5.0到7.5，优选大约6.0到7.5进行PEG分级分离，以及当使用级分II+III糊状物作为原料时，优选pH为大约5.5到6.0进行PEG分级分离，PEG浓度范围在大约4到8％，当使用级分II+IIIw糊状物作为原料时，优选4到6％，或者当使用级分II+III糊状物作为原料时，优选6到8％。同时保持低温约0到2℃，可进行大约1到8小时的PEG分级分离，然后通过离心分离或者过滤除去沉淀物。
作为任选的病毒去除步骤，将膨润土加入离心分离液或过滤液中使其终浓度在大约0.05到2.0w/w％，优选0.1到1.0w/w％，混合混合物1到5小时，然后通过过滤将膨润土糊状物除去。
本发明最后的必要步骤是使用溶剂或溶剂-去污剂混合物进行第二步病毒灭活步骤。如下所述，可以在溶剂-去污剂处理之前或之后进行进一步的纯化步骤，特别是那些涉及使用离子交换树脂的步骤。一种选择是在溶剂-去污剂病毒灭活之前进行阴离子交换处理以进一步除去白蛋白、转铁蛋白以及激肽释放酶原激活剂。在优选的实施方案中。在溶剂去污剂病毒灭活之后进行阳离子交换处理。通过该步骤，可将人血浆中某些不需要的蛋白物质(如IgA、IgM和白蛋白)以及PEG从IgG中除去，同时通过阳离子交换处理，溶剂-去污剂处理中使用的残留试剂也被除去。
在整个操作中，如果不用其它的方法完成，用于溶剂-去污剂处理的溶液需进行处理以除去所有的颗粒物，其中包括变性的蛋白质。因此，在添加溶剂-去污剂之前，优选用1微米的或精制过滤器过滤溶液。这也可以减少病毒存在于大粒子中的情形发生，由此可能避免与溶剂-去污剂接触的可能性。
滤液可经二次过滤和/或浓缩到大约12％的蛋白质，优选5-10％的蛋白质，然后将其进行溶剂或溶剂-去污剂处理。
目前，优选的灭活有包膜的病毒的溶剂是三烷基磷酸盐，本发明中使用的三烷基磷酸盐并不受特别限定，但优选使用三(n-丁基)磷酸盐(此后称为“TNBP”)。其它可以使用的三烷基磷酸盐有三(叔-丁基)磷酸盐、三(n-己基)磷酸盐，三(2-乙基己基)磷酸盐等。可能使用两种或两种以上不同的三烷基磷酸盐的混合物。
三烷基磷酸盐的用量在0.01到10(w/w)％之间，优选大约0.1到3(w/w)％。
三烷基磷酸盐可以在有或没有去污剂或表面活性剂时使用。优选三烷基磷酸盐与去污剂结合使用。去污剂的功能是提高免疫球蛋白组合物中的病毒与三烷基磷酸盐的接触。
去污剂的实例包括脂肪酸的聚氧乙烯衍生物、无水山梨醇的部分酯类如聚山梨醇酯80(商品名Tween 80等)和聚山梨醇酯20(商品名Tween 20等)；以及非离子油浴漂洗试剂如乙氧基烷基酚(商品名Triton X100等)。实例包括其它表面活性剂和去污剂如两性离子去污剂等。
当使用去污剂时，加入的量并不严格；如其使用浓度在大约0.001％到大约10％之间，优选在大约0.01％到3％之间。
在本发明中，在大约20到35℃，优选25到30℃对含免疫球蛋白的组合物进行三烷基磷酸盐处理超过1小时，优选大约5到8小时。
在三烷基磷酸盐处理中，免疫球蛋白以大约5到10％的蛋白质水溶液的形式存在。
如果在溶剂-去污剂处理之前不进行任选的阴离子交换处理，可以对经过溶剂去污剂处理的免疫球蛋白进行。优选地，对经过溶剂去污剂处理的进行至少一次阳离子交换处理。对经溶剂(或溶剂-去污剂)处理的免疫球蛋白水溶液进行离子交换处理，一般pH在大约4.5到6.5，其中希望低的离子强度可以有最大的IgG吸附量。蛋白质浓度的范围一般在大约1-15w/v％，更加优选在大约3-10w/v％。离子交换剂用所用的相同水溶液平衡。
进行连续操作使免疫球蛋白溶液经过阴离子交换柱，其比率是每毫升离子交换剂大约10到100毫升溶液，同时回收未吸附的级分。
使用的阴离子交换剂，例如，包括与不溶的载体结合的阴离子交换基团。该阴离子交换基团包括二乙基氨乙基(DEAE)、四-氨乙基(QAE)等，不溶的载体包括琼脂糖、纤维素、右旋糖苷、丙烯酰胺等。在0.4％的氯化钠溶液中，1克DEAE葡聚糖凝胶树脂可膨胀到大约20到30克湿重。
可以使用的阳离子交换剂为羧甲基葡聚糖凝胶(CM-葡聚糖凝胶)、CM-纤维素、SP-葡聚糖凝胶、CM-琼脂糖凝胶和SP-琼脂糖凝胶。经过预处理的阳离子交换剂(例如，1克CM-葡聚糖凝胶C-50树脂在0.4％的氯化钠溶液中膨胀到大约25到35克湿重)用作柱床，经溶剂(或溶剂-去污剂)处理的免疫球蛋白溶液以连续的方式在大约0到5℃通过该柱床。
当上述条件用于阳离子交换剂时，可以吸附IgG，此后，冲洗吸附了蛋白质的阳离子交换树脂后，IgG可被洗脱，例如，用大约1.4N的氯化钠溶液冲洗。
不采用离子交换处理时，用正切流过滤对经溶剂(或溶剂-去污剂)处理的溶液进行二次过滤及浓缩，以除去溶剂-去污剂和PEG。如果希望终产物中有极低浓度的溶剂-去污剂和PEG，优选的处理过程是用阳离子交换剂进行处理，之后进行正切流过滤。
经过上述方法的各个步骤之后，IgG被纯化，二次过滤并且浓缩到所需的程度。如果需要，可加入稳定剂，如D-山梨醇，并且进行最终调节，以生产pH为大约5.4，含大约50到100mg/mlIgG和50mg/mlD-山梨醇的组合物的溶液。为了进一步除去病毒，溶液可已经35纳米或更小孔径的过滤器过滤。然后将该稳定的并任选纳米过滤的溶液经消毒的细菌滞留过滤器消毒过滤并且被装到小瓶内。
提出以下实施例来说明本发明，但并不限制本发明。
实施例静脉注射用免疫球蛋白及其产物的制造方法将1800克级分II+III糊状物悬浮于15千克冷水中。在0到5℃混合1小时后，用稀醋酸将悬浮液的pH值调节到大约5.0。将悬浮液混合3小时后，添加大约900克过滤器助剂(酸洗硅藻土)再混合45分钟。通过过滤将不溶的物质和硅藻土一起除去。过滤液被纯化然后使用100,000分子量切割膜(MWCO)超过滤浓缩，蛋白质的浓度达到大约6％。
向浓缩的蛋白质溶液中加入D-山梨醇，使其终浓度为33w/w％，在pH为5.0时混合直到所有的山梨醇被溶解。然后将溶液在60℃加热10小时。加热的溶液被冷却至10℃以下，然后用等量的冷水稀释。用稀氢氧化钠溶液将经稀释的溶液的pH调节到5.7，然后添加50％的聚乙烯乙二醇溶液(PEG)3350，使其终浓度为6w/w％。在pH为5.7时混合大约2小时之后，所形成的沉淀物通过过滤被除去，添加酸洗硅藻土过滤器助剂，使浓度达到3w/w％。保留大约3.5千克的6％的PEG滤液作其它实验用。将剩余的6％的PEG过滤液的pH调到4.9，每千克过滤液中添加1克膨润土，使pH升到大约5.1。混合2小时之后，过滤悬浮液以除去膨润土。然后将过滤液进行浓缩，并使用100,000MWCO膜，通过超滤进行二次过滤。
用稀氢氧化钠溶液将溶液的pH调到大约6.5，然后在溶液中加入0.4千克预膨胀的DEAE葡聚糖凝胶A-50树脂，将蛋白质溶液与树脂混合以后，通过过滤除去树脂。向过滤液中加入含三-n-丁基磷酸盐(TNBP)和聚山梨酸酯80混合物的溶剂-去污剂(SD)溶液，其终浓度分别为0.3w/w％和1.0w/w％。将含SD的溶液在27℃下保温6小时之后，将溶液冷却到0到5℃，用氯化钠溶液将传导率调到大约7mS/cm，pH调到5.8。向溶液中加入预处理的Cm葡聚糖凝胶C-50树脂2.7千克，混合，然后过滤使树脂剩下。用0.3％的氯化钠溶液清洗含吸附了IgG的树脂，然后用1.4M的氯化钠溶液洗脱吸附的IgG。洗脱液用冷水纯化，浓缩并二次过滤。加入D-山梨醇并且进行终调节以生产含大约100mg/mlIgG和50mg/mlD-山梨醇的组合物的溶液，其pH为大约5.4。最终调节之后，将溶液经消毒过滤并装进小玻璃瓶内。产物的测试结果见下表。
表实施例产物的测试结果
对本领域得技术人员来说，本发明的变化是显而易见的。
权利要求
1.一种连续制备静脉给药的γ球蛋白溶液的方法，它包括(a)在足以灭活热敏感病毒的时间和温度条件下，热处理不纯的γ球蛋白溶液；(b)不回收γ球蛋白，将热处理过的γ球蛋白溶液进行聚乙烯乙二醇分级分离，而不引起需要的γ球蛋白的沉淀，以获得纯化的γ球蛋白溶液，；以及(c)不回收γ球蛋白，用有机溶剂处理纯化的γ球蛋白溶液以灭活有包膜的病毒。
2.如权力要求1所述的方法，其中不纯的γ球蛋白溶液含科恩级分I+II+III、科恩级分II+III糊状物、科恩级分II+IIIw或者科恩级分II。
3.如权力要求1所述的方法，其中不纯的γ球蛋白溶液含来自科恩级分II+III糊状物的蛋白质。
4.如权力要求1所述的方法，其中不纯的γ球蛋白溶液在进行热处理步骤(a)之前，至少要经过一步纯化，然后不进行中间回收，将经过部分纯化的溶液进行热处理步骤(a)。
5.如权力要求1所述的方法，其中热处理步骤(a)在大约50到70℃下进行大约10到20小时。
6.如权力要求5所述的方法，其中热处理步骤(a)在大约60℃下进行大约10到11小时。
7.如权力要求1所述的方法，其中进行一步聚乙烯乙二醇分级分离，包括至少一个步骤，其中杂质以沉淀物的形式被除去，希望的蛋白质留在溶液中。
8.如权力要求6所述的方法，其中不纯的γ球蛋白溶液含从科恩级分II+III糊状物分离的蛋白质。
9.如权力要求1所述的方法，其中用于步骤(c)的有机溶剂是烷基磷酸盐。
10.如权力要求7所述的方法，其中用于步骤(c)的有机溶剂是烷基磷酸盐。
11.如权力要求10所述的方法，其中烷基磷酸盐是三-n-丁基磷酸盐。
12.如权力要求1所述的方法，其中有机溶剂含去污剂。
13.如权力要求11所述的方法，其中有机溶剂含去污剂。
14.如权力要求1所述的方法，其中步骤(c)后，不回收γ球蛋白将γ球蛋白溶液经阳离子交换树脂进行处理。
15.如权力要求7所述的方法，其中对经聚乙烯乙二醇分级分离后得到的γ球蛋白溶液进行膨润土处理步骤。
16.如权力要求15所述的方法，其中经膨润土处理过的溶液用阴离子交换树脂进行处理。
17.如权力要求1所述的方法，其中步骤(b)后，γ球蛋白溶液用阴离子交换树脂进行处理。
18.如权力要求14所述的方法，其中经阳离子交换处理之后，γ球蛋白溶液通过正切流过滤浓缩。
19.如权力要求1所述的方法，其中步骤(c)后，不回收γ球蛋白，γ球蛋白溶液通过正切流过滤浓缩。
20.通过如权利要求1所述的方法生产的静脉给药的γ球蛋白溶液。
21.通过如权利要求18所述的方法生产的静脉给药的γ球蛋白溶液。
全文摘要
连续生产基本上不含感染性病毒的静脉给药的γ球蛋白的方法,通过热处理γ球蛋白溶液使病毒灭活,分级分离以获得的纯化的γ球蛋白溶液而不会使所希望的γ球蛋白沉淀,然后用溶剂－去污剂处理纯化的γ球蛋白以使病毒进一步失活。在该公开的方法中,作为中间产物部分纯化的γ球蛋白不被回收。
文档编号A61L2/00GK1358100SQ00808372
公开日2002年7月10日 申请日期2000年6月6日 优先权日1999年6月15日
发明者R·R·马米第, A·巴格达萨里安, G·卡尼亚韦拉尔 申请人:阿尔法治疗公司