嵌合的免疫原性组合物及其编码核酸的制作方法

专利名称：嵌合的免疫原性组合物及其编码核酸的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及免疫学和药物。本发明提供了使用嵌合分子，包括热激蛋白(HSP)，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)的胞质转运结构域(cytoplasmic translocationdomain)(ETA dII)，和抗原性多肽，例如与肿瘤相关的抗原或者病原体衍生的抗原以便增强抗原-特异性免疫应答，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的组合物和方法。因此，本发明的一个实施方案涉及DNA疫苗。
背景抗原特异性免疫治疗最近成为控制癌症的一个途径，因为它能够产生抗致瘤细胞的特异免疫性而不攻击正常细胞。DNA接种不同于传统接种之处在于编码抗原的DNA(不是抗原本身)被注射给受治者。抗原的产生，即疫苗中DNA编码的抗原的表达，在接种的个体的体内发生。但是，传统的DNA疫苗具有局限性。例如，大多数DNA疫苗的主要缺点是它们的效价。
概述本发明提供编码一种嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列的第一多肽结构域，和包括抗原性多肽的第二多肽结构域。该嵌合核酸的融合蛋白产物也可以具有几个结构域，包括HSP结构域的羧基末端片段，FL结构域，ETA dII结构域，或者GM-CSF结构域以任何顺序的任何组合。也可以加上其它结构域，例如为了有助于纯化所述融合蛋白或者原位鉴定所述多肽等等的结构域。在可供选择的实施方案中，编码第一多肽结构域的核酸是5′端连接编码第二多肽结构域的核酸，和，编码第二多肽结构域的核酸是5′端连接编码第一多肽结构域的核酸。因此，这种嵌合核酸的融合蛋白产物可以具有或者氨基末端或者羧基末端与第一多肽结构域连接的抗原性多肽；各个结构域的任何顺序都是可接受的，即使所述嵌合核酸编码两个以上的结构域。
在一个实施方案中，热激蛋白(HSP)的羧基末端片段具有陪伴蛋白活性，例如肽陪伴蛋白活性。热激蛋白(HSP)(或者其核酸编码序列)可以来自任何生物体，包括，例如，人或细菌HSP。HSP可以包括热激蛋白70(HSP 70)，例如来自分枝杆菌属，例如人结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的HSP70。所述热激蛋白(HSP)可以包括SEQ ID NO9的残基312-625所示的序列，或者SEQ ID NO9的大约残基517至大约残基625给出的序列，或者其功能等价物。
在可供选择的实施方案中，Flt-3配体多肽(或者其核酸编码序列)来自任何生物体，包括，例如，人或细菌。Flt-3配体多肽可以包括SEQ ID NO25的大约残基1至大约残基189给出的序列。
在可供选择的实施方案中，胞质转运结构域(或者其核酸编码序列)来自任何生物体，包括，例如，人或细菌。胞质转运结构域可以来自毒素，例如来自细菌，例如，假单孢杆菌属的毒素，例如假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)，例如包括SEQ ID NO3的大约残基247至大约残基417给出的序列的ETA dII。假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域也可以包括SEQ ID NO3的大约残基253至大约残基364给出的序列。
在可供选择的实施方案中，GM-CSF序列(或者其核酸编码序列)来自任何生物体，包括，例如，人或细菌。所述GM-CSF序列可以是GM-CSF片段，例如含有二硫键的片段。GM-CSF片段可以包括SEQ ID NO1的大约残基18至大约残基22，或者大约残基34至大约残基41，或者大约残基38至大约残基48，或者大约残基52至大约残基61，或者大约残基94至大约残基115，或者大约残基95至大约残基111给出的序列。
在一个实施方案中，抗原性多肽包括I类MHC-结合肽表位。所述I类MHC-结合肽表位的长可以是大约8个氨基酸残基至大约11个，或者大约15个，或者大约25个，或者大约50个氨基酸残基之间。抗原性多肽可以来自任何病原体或微生物。在可供选择的实施方案中，抗原性多肽来自病毒，例如人病毒，例如，人乳多空病毒。所述乳多空病毒可以是人乳头瘤病毒(HPV)，例如人乳头瘤病毒-16(HPV-16)。所述抗原性多肽可以包括人乳头瘤病毒E6多肽或者人乳头瘤病毒E7多肽。所述病毒也可以是慢病毒，例如人免疫缺陷型病毒(HIV)，例如HIV-1。
所述抗原性多肽来自其中的其它病原体包括疟疾，牛病毒性腹泻病毒，巨细胞病毒，脑炎病毒，肝炎病毒，单纯疱疹病毒或者流感病毒，这些只是其中的几种。
抗原性多肽也可以是肿瘤特异性或者与肿瘤相关的多肽。所述肿瘤特异性或者与肿瘤相关的多肽可以包括在肿瘤细胞表面上表达的抗原。所述肿瘤特异性或者与肿瘤相关的多肽可以是突变体p53，MAGE-1或者MAGE-3。
在一个实施方按中，所述核酸编码进一步包括包括胞质转运多肽结构域(cytoplasmic translocation polypeptide domain)的第三多肽结构域的嵌合多肽。因此，本发明提供编码一种嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列(或者其任何组合)的第一多肽结构域，和包括抗原性多肽的第二多肽结构域，和包括胞质转运多肽结构域的第三多肽结构域。如上所述，这些结构域可以以任何顺序存在于嵌合核酸或者多肽中。
胞质转运多肽结构域可以来自任何来源，例如，人，细菌等等。胞质转运多肽结构域可以包括假单孢杆菌属外毒素A(ETA)的胞质转运结构域。假单孢杆菌属外毒素A(ETA)的胞质转运结构域可以包括SEQ IDNO3的大约残基253至大约残基364给出的序列。胞质转运多肽结构域可以包括病原体毒素的胞质转运结构域，所述毒素例如细菌毒素，例如，来自白喉(Diptheria)，梭状芽孢杆菌属，Botulinum，芽孢杆菌属，耶尔森氏菌属，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，或者百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)。编码第三多肽结构域的核酸位于编码第一或者第二结构域的核酸5′端，或者位于编码第一或者第二结构域的核酸之间，或者位于编码第一或者第二结构域的核酸的3′端。
所述核酸可以进一步包括调控核酸序列，例如转录(例如启动子或者增强子)或者翻译调控序列。
本发明提供一种表达盒(例如质粒，载体，病毒)，其包括本发明的嵌合核酸，包括例如编码一种嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域的第一多肽结构域；和包括抗原性多肽的第二多肽结构域。所述表达盒至少包括启动子和编码序列。所述启动子可以是组成型的，可诱导型的，组织特异性的，等等。所述表达盒还可以包括胞质转运结构域的编码序列。所述表达盒还可以包括自主复制RNA复制子，例如Sindbis病毒自主复制RNA载体，例如，自主复制RNA载体SINrep5。
本发明提供了包括编码一种嵌合多肽的核酸的转化细胞，所述嵌合多肽包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域的第一多肽结构域；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域。该核酸还可以包括胞质转运结构域的编码序列。
本发明提供了包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域的第一多肽结构域；和包括抗原性多肽的第二多肽结构域的嵌合多肽。所述融合蛋白可以是多个结构域的，类似于本发明的嵌合核酸。所述融合蛋白也可以包括胞质转运结构域。第一多肽结构域可以与第二多肽结构域非共价连接。或者，第一多肽结构域可以与第二多肽结构域共价连接，例如，它可以是重组蛋白。如果嵌合多肽是多个结构域的，可以设计连接/融合蛋白的任何组合的方案。
本发明提供一种药物组合物，其含有编码一种嵌合多肽的核酸(本发明嵌合核酸)，包括编码本发明的嵌合多肽的核酸的表达盒(例如质粒，载体，病毒)，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域；和，药学可接受的赋形剂。所述融合蛋白还可以包括胞质转运结构域。
所述药物组合物可以包括任何剂型，例如，其可以用磷脂配制形成脂质体。例如对于口服或者肠胃外施用或者弹道给药等等是合适的。其可以是任何合适的剂量或剂型，例如，片剂，液体，吸入剂，用于注射/弹道输送的颗粒剂等等。
本发明提供一种DNA疫苗，其包括编码一种嵌合多肽的核酸，包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域；和，药学可接受赋形剂。所述融合蛋白还可以包括胞质转运结构域。
本发明提供一种颗粒(particle)，其包括编码一种嵌合多肽的核酸或者包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域。所述融合蛋白还可以包括胞质转运结构域。所述颗粒可以包括任何适合颗粒轰击的材料，例如金。
本发明提供诱导免疫应答的方法，该方法包括施用有效量的一种组合物，该组合物含有编码一种嵌合多肽的核酸，包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域，或者包括所述核酸，载体，嵌合多肽或者其组合的DNA疫苗，其中施用有效量的组合物诱导免疫应答。融合蛋白还可以包括胞质转运结构域。该方法能够诱导免疫应答，包括细胞应答，例如主要地T细胞应答，例如主要地细胞毒素T细胞应答。在该方法中，编码嵌合多肽的核酸或者载体可以作为裸DNA分子被施用。通过基因枪或者等价物可以施用本发明的核酸，例如裸DNA。或者，在该方法中，组合物可以作为脂质体制剂被施用。该组合物可以皮内，通过吸入剂，等等给药。
本发明还提供对哺乳动物免疫接种抗病原体感染的方法，该方法包括施用有效量的一种药物组合物，该组合物含有编码一种嵌合多肽的核酸，包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和包括来自病原体的抗原性多肽的第二多肽结构域，或者包括所述核酸，载体，嵌合多肽或者其组合的DNA疫苗，其中施用组合物诱导对病原体的免疫应答。
本发明还提供对哺乳动物免疫接种疫苗抗肿瘤抗原的方法，该方法包括施用有效量的一种药物组合物，该组合物含有编码一种嵌合多肽的核酸，包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和，包括肿瘤抗原的第二多肽结构域，或者包括所述核酸，载体，嵌合多肽或者其组合的DNA疫苗，其中施用该组合物诱导对肿瘤抗原的免疫应答。
本发明还提供一种组合物制备用于对哺乳动物接种抗一种抗原的药物制剂的用途，其中所述药物制剂包括编码一种嵌合多肽的核酸，包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，一种嵌合多肽，或者其组合，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域；和，包括肿瘤抗原的第二多肽结构域，和药学可接受载体。
下面的附图和说明书给出本发明的一个或多个实施方案的详细描述。从这些说明和附图以及从权利要求书，本发明的其它特征，目的和优点将清晰可见。
这里引述的所有的公开物，专利，专利申请，GenBank序列和ATCC保藏号在表达上为了所有的目的引作参考。


图1A是说明ELISPOT分析的结果的直方图。应用ELISPOT分析测定IFN-γ产生E7-特异性CD8+T细胞前体的数目。点数值是各个接种组一式三份试验SE的平均值。用E7-HSP70 DNA接种的小鼠产生最高的IFN-γ+点数值。给出的数据代表E7-特异性点-形成细胞(减去没有E7 CTL肽存在下检测到的点数值)。
图1B是给出流式细胞仪分析结果的图表。来自接种小鼠的脾细胞体外与E7肽(残基49-57；RAHYNIVTF；SEQ ID NO5)一起培养过夜，并且对CD8+和胞内IFN-γ染色。通过标准流式细胞仪分析用各种重组DNA疫苗免疫的小鼠中IFN-γ分泌CD8+T细胞前体的数目。用E7-HSP70 DNA接种的小鼠产生最高的IFN-γ+CD8+双阳性T细胞。右上角给出3×105个脾细胞中CD8+IFN-γ+双阳性T细胞数目。图1A-B中给出的数据表明用E7-HSP70 DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠内E7-特异性CD8+T细胞前体的频率。通过基因枪用空白质粒(pcDNA3)，HSP70DNA(HSP)，E7 DNA(E7)，E7-HSP70 DNA(E7/HSP)或者与HSP70 DNA混合的E7 DNA(E7+HSP)免疫C57BL/6小鼠，或者不接受接种。对于接种的小鼠，给予2μgDNA/小鼠两次。在最后的DNA接种之后10天，收集脾细胞。
图2是用各种重组DNA疫苗接种小鼠的IFN-γ分泌E7-特异性CD4+细胞的流式细胞仪分析的图表。如图1A-1B所示免疫C57BL/6小鼠。来自接种的小鼠的脾细胞在体外与E7肽(残基30-67；DSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRL；SEQ ID NO6)一起培养过夜，并且对CD4和胞内IFN-γ染色。通过流式细胞仪分析IFN-γ分泌CD4+T细胞的数目。用E7-HSP70 DNA接种的小鼠产生与用野生型E7 DNA接种的小鼠可比较的CD4+IFN-γ+双阳性细胞。右上角给出了3×105个脾细胞中CD4+IFN-γ+双阳性T细胞的数目。
图3是说明用各种重组DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠中E7-特异性抗体应答的直方图。通过基因枪用对照质粒(没有插入物)，野生型HSP70，野生型E7，或者E7-HSP70 DNA免疫C57BL/6小鼠。接种之后14天从免疫的小鼠获得血清样品。使用系列稀释的血清通过ELISA检测E7-特异性抗体的存在。给出了1∶80稀释度的结果，表明在450nmSE下平均吸收度(O.D.)。
图4A和4B是说明用E7-HSP70 DNA接种保护小鼠抗TC-1肿瘤生长的线性图。通过基因枪用空白质粒(pcDNA3)，HSP70 DNA(HSP)，E7DNA(E7)，或E7-HSP70 DNA(E7/HSP)免疫C57BL/6小鼠。最后一次接种之后一周，对每只小鼠在右腿皮下用5×104TC-1细胞攻击小鼠。通过一周两次触诊和检查对小鼠监测肿瘤生长的证据。在TC-1攻击之后第60天，对每只小鼠在左腿皮下用5×104TC-1细胞再次攻击没有肿瘤的小鼠。为了产生图4A所示的数据，每一只小鼠接受2微克DNA疫苗。一周之后，用和第一次接种同样的类型和量的DNA对小鼠再次接种。为了产生图4B所示的数据，每一只小鼠只接受一次2微克DNA疫苗注射，没有进一步加强。
图5A和5B是说明用E7-HSP70 DNA接种消灭预先存在的TC-1肿瘤细胞的线性图。最初用2×104TC-1细胞皮下攻击各个小鼠，接着通过基因枪用空白质粒(pcDNA3)，HSP70 DNA(HSP)，E7 DNA(E7)，或E7-HSP70 DNA(E7/HSP)进行DNA接种。通过一周两次触诊和检查对小鼠监测肿瘤生长的证据。为了产生图5A所示的数据，每一只小鼠在肿瘤攻击之后3天和10天接受2微克DNA疫苗。对于图5B，每一只小鼠只在肿瘤攻击之后3天接受2微克DNA疫苗。没有进一步加强免疫。
图6是说明E7-HSP70 DNA产生的抗肿瘤免疫性要求HSP70 DNA序列与E7基因序列融合的线性图。通过基因枪用E7-HSP70 DNA(E7/HSP)，或者与HSP70 DNA混合的E7 DNA(E7+HSP)免疫C57BL/6，或者不接受接种。对于接种的小鼠，只是给于一次2微克DNA/小鼠。接种之后1星期，对每只小鼠在右腿皮下用5×104TC-1细胞攻击小鼠。通过一周两次触诊和检查对小鼠监测肿瘤生长的证据。
图7是说明淋巴细胞亚群耗竭状态对E7-HSP70 DNA疫苗效价的影响的线性图。通过基因枪用2微克E7-HSP70 DNA免疫C57BL/6小鼠并且一周之后，用2微克E7-HSP70 DNA加强。最后接种之后两周，在右腿皮下用5×104TC-1细胞/小鼠攻击小鼠。在肿瘤攻击之前一周开始细胞耗竭并且在肿瘤攻击之后持续40天。MAb GK1.5用于CD4耗竭，MAb2.43用于CD8耗竭，以及MAb PK136用于NK1.1耗竭。流式细胞仪分析表明耗竭了95％以上的合适的淋巴细胞亚型，而其它亚型的水平正常。通过一周两次触诊和检查对小鼠监测肿瘤生长的证据。
图8是GM-ETA(dII)-E7，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CSF，ETA(dII)，E7的构建体的示意图。
图9是说明进行以测定用GM-ETA(DII)-E7 DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠中的E7-特异性CD8+T细胞前体的胞内细胞因子染色的流式细胞仪分析的图表。通过基因枪用带有GM，ETA(dII)，E7，GM-ETA(dII)，ETA(DII)-E7，GM E7或GM-ETA(DII)-E7基因插入物的质粒DNA或者“空白”质粒载体皮内免疫C57BL/6小鼠，或者不接受接种。对于接种过的小鼠，给于两次2微克DNA/小鼠。最后一次DNA接种之后10天，收集脾细胞。来自接种小鼠的脾细胞在体外与E7肽(残基49-57；SEQID NO5)培养过夜并且对于CD8和胞内IFN-γ染色。通过流式细胞仪分析用各种重组的DNA疫苗免疫的小鼠中IFN-γ分泌CD8+T细胞前体的数目。用GM-ETA(DII)-E7 DNA接种的小鼠产生最高的IFN-γ+CD8+双阳性T细胞。
图10是说明用各种重组的DNA疫苗免疫的小鼠中IFN-γ分泌E7-特异性CD4+细胞的流式细胞仪分析的图表。和对上面图2描述的一样免疫C57BL/6小鼠。来自接种过的小鼠的脾细胞在体外与E7肽(残基30-67；SEQ ID NO6)培养过夜并且对于CD4和胞内IFN-γ染色。通过流式细胞仪分析IFN-γ分泌CD4+T细胞的数目。当与用GM-E7 DNA接种的小鼠相比时，用GM-ETA(DII)-E7 DNA接种的小鼠产生可比较的CD4+IFN-γ+双阳性细胞。与用空白质粒(pcDNA3)，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CS F，ETA(dII)，或E7 DNA免疫的小鼠相比，用GM-ETA(dII)-E7接种的小鼠产生更大数目的E7-特异性CD4+IFN-γ+双阳性细胞。
图11是说明用GM-ETA(DII)-E7 DNA接种保护小鼠抗TC-1肿瘤生长的线性图。通过基因枪用2微克/小鼠的空白质粒(pcDNA3)，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CSF，ETA(dII)，E7 DNA，或GM-ETA(dII)-E7 DNA免疫C57BL/6小鼠。一周之后，用和第一次接种一样的相同类型和量的DNA再次对小鼠接种。最后接种之后一周，对每只小鼠在右腿皮下用5×104TC-1细胞攻击小鼠。通过一周两次触诊和检查对小鼠监测肿瘤生长的证据。在TC-1攻击之后第60天，对没有肿瘤的小鼠在左腿皮下用5×104TC-1细胞/小鼠再次攻击。
图12是说明淋巴细胞亚群耗竭状态对GM-ETAdII-E7 DNA疫苗效价的影响的线性图。通过基因枪用2微克GM-ETAdII-E7 DNA免疫C57BL/6小鼠并且一周之后，用2微克GM-ETAdII-E7 DNA加强。最后一次接种之后两周，在右腿皮下用5×104TC-1细胞/小鼠攻击小鼠。在肿瘤攻击之前一周开始细胞耗竭并且在肿瘤攻击之后持续指定数量的天数。MAb GK1.5(Dialynas等，1983，免疫学杂志(J.Immunol.) 1312445-2451)用于CD4耗竭，MAb 2.43(Sarmiento等，1980，免疫学杂志(J.Immunol.)1252665-2672)用于CD8耗竭，以及MAb PK136(Koo等，1986，免疫学杂志(J.Immunol.)1373742-3747)用于NK1.1耗竭。流式细胞仪分析表明耗竭了95％以上的合适的淋巴细胞亚型，而其它亚型的水平正常。通过一周两次触诊和检查对小鼠监测肿瘤生长的证据。
图13是E7 HSP70免疫原构建体的氨基酸和核苷酸序列的图。
图14是GM ETA(dII)-E7免疫原构建体的氨基酸和核苷酸序列的图。该构建体的GM-CSF部分，ETA(dII)，和E7部分用括号表示。
图15是ETA(没有信号序列)的氨基酸和核苷酸序列的图。括号中是构建免疫原构建体中使用的残基247-417(和相应的核苷酸序列)。
图16是说明全长结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)HSP70蛋白质(SEQ ID NO9)的结构域结构的图。ATP酶结构域(残基1-356)用下划线表示；底物结合结构域(SD；残基357-516)用斜体字表示，而C一末端结构域(CD；残基517-625)用粗体字表示。
图17是哺乳动物细胞表达载体中质粒构建体的示意图。将所有的嵌合E7/热激蛋白构建体(E7-HSP70，E7-ATP. E7-SD，E7-CD，和E7)克隆到巨细胞病毒启动子下游的表达载体的多个克隆位点。
图18A是用包含编码Hsp片段一抗原嵌合体(E7-HSP70，E7-ATP，E7-SD，E7-CD，和E7)的核酸构建体的重组DNA疫苗免疫的小鼠中的IFN-γE7-特异性CD8+细胞的流式细胞仪分析的图。图18B是说明IFN-γ产生E7-特异性CD8+T细胞的平均数的直方图。
图19是哺乳动物细胞表达载体中质粒构建体的示意图。
图20A是SINrep5，SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70DNA构建体的示意图。图20B是用和下面实施例6详述中描述一样的SP6 RNA聚合酶从这些DNA构建体衍生的RNA转录物的示意图。
各个附图中类似参考标记指示类似元件。
发明详述本发明提供编码嵌合多肽的新的嵌合核酸，体外和体内表达这些多肽的构建体，分离的嵌合多肽，药物组合物和制备和使用这些组合物的方法。这些组合物和方法特别用于刺激或者增强选择的抗原的免疫原性，或者刺激或者增强对那种抗原的特异性的细胞免疫应答。本发明的核酸包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列的第一多肽结构域，和包括抗原性多肽的第二多肽结构域。
本发明的一个实施方案以这样的发现为基础，即在包括编码热激蛋白的羧基末端片段，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)热激蛋白70(HSP70)(参见，例如，SEQ ID NO9)，或者Flt-3配体(参见，例如，SEQ ID NO25)，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)(SEQ ID NO1)，或者胞质转运结构域(参见，例如，假单胞杆菌ETA dIISEQ ID NO3)的第一结构域；和编码一种抗原，例如来自病原体或者肿瘤的抗原肽的第二结构域的嵌合核酸DNA的存在下，增强嵌合核酸编码的靶抗原，例如DNA疫苗的免疫原性。因此，本发明提供明显增强DNA疫苗的效价，并且因此提高临床功效的接种的组合物和方法。
在一个实施方案中，本发明的嵌合核酸编码免疫原性组分(immunogenic composition)，所述免疫原性成分含有一种嵌合多肽，所述嵌合多肽包括包括热激蛋白(HSP)，例如HSP70，的羧基末端结构域(CD)片段的第一结构域(由第一结构域DNA编码的)，和包括一种抗原，例如I类主要组织相容性复合体(MHC)-限制的抗原，例如I类MHC-结合的表位的第二结构域(由第二结构域DNA编码的)。在一个实施方案中，蛋白质的羧基末端片段是长度至少10个氨基酸并且从天然存在的蛋白质的羧基末端那一半衍生的多肽和肽。例如，HSP70的羧基末端片段是一种肽，其从HSP70的部分衍生的氨基酸序列跨越SEQ ID NO9的大约残基312至大约残基625；跨越那些残基的编码区的DNA编码该肽。所述羧基末端结构域(CD)片段也可以是具有SEQ ID NO9的大约残基517至大约残基625的氨基酸序列的肽。
例如，所述免疫原性组分可以含有一种嵌合多肽，所述嵌合多肽包括包括编码包含SEQ ID NO9的残基517至625的氨基酸序列的多肽的DNA的第一结构域和(可操作地连接于)包含编码I类MHC限制性的抗原的第二DNA的第二结构域。因此，本发明包括乳头瘤病毒E7-HSP70-CD融合多肽以及编码该融合多肽的嵌合核酸(DNA)。任选地，所述组合物包括编码一种多肽的DNA，所述多肽包含从HSP70的氨基末端片段衍生的残基，例如SEQ ID NO9的残基161-370。DNA成分，例如第一和第二(和任选地，第三)DNA可操作地连接的顺序(即重组蛋白质上结构域的排列)可以改变而不影响免疫原性。例如，HSP-编码(或者Flt-3配体-或者胞质转运结构域-编码)DNA序列位于靶抗原编码序列的5′和3′端。在一个实施方案中，这些多肽-编码核酸结构域符合读框(即，DNA是可操作地连接的)使得该DNA构建体编码重组多肽，其中抗原(例如，I类MHC限制性抗原)位于HSP-和Flt-3配体-和胞质转运结构域-衍生的残基的氨基末端。
如下面所讨论的，抗原(例如I类MHC限制性抗原)可以从象病毒这样的病原体产生，或者从癌组织，例如，肿瘤特异性或肿瘤相关的多肽衍生。本发明的DNA疫苗可以包括表达盒，例如，包括编码HSP羧基末端片段或者Flt-3配体或者胞质转运结构域的第一DNA和(可操作地连接于)编码一种抗原(例如I类MHC限制性抗原)的第二DNA的表达或质粒载体。本发明的治疗方法包括通过对哺乳动物施用这里描述的免疫原组分诱导哺乳动物对一种抗原的细胞毒性T细胞应答的方法。
在另一个可供选择的实施方案中，本发明的嵌合核酸或免疫原组分含有下面的成分(a)包括编码与专门的(professional)抗原呈递细胞(APC)结合的多肽，或者HSP的羧基末端片段，Flt-3配体，或者假单孢杆菌属外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域的序列的第一DNA；(b)包括编码胞质转运体(translocator)肽(例如包括ETA dII)的序列的第二DNA，和(c)包括编码一种抗原，例如一种I类MHC限制性抗原的序列的第三DNA。所述第一，第二，和第三DNA可以可操作地连接。所谓＂可操作地连接＂指编码一种多肽的DNA序列符合读框地与编码另一种多肽的另一种DNA连接产生重组的嵌合的，或者“融合，”蛋白质。可操作地连接的DNA信息的翻译产生嵌合多肽或者融合基因产物。本发明包括这样的嵌合核酸和多肽，其中各个结构域以所有可能的组合连接，即第一，第二，和第三DNA可操作地连接的顺序是无关紧要的。
构建体(例如表达盒，载体等)还可以含有调控序列，例如转录或翻译调控序列。多肽编码序列和调控序列以这样一种方式连接，使得允许当合适的分子(例如转录激活子蛋白)与调控序列结合时的基因表达。
在一个实施方案中，所述免疫原成分的第一核酸结构域编码HSP，例如结核分枝杆菌热激蛋白70(HSP70)(SEQ ID NO9)的片段。给定蛋白质的“片段”是长度比参照多肽短的多肽。例如，所述多肽长度至少9或10个氨基酸，但是少于成熟的参照蛋白或多肽的残基的总数。例如，结核分枝杆菌HSP70的片段分子量小于70kDa。HSP70的片段具有与天然存在的HSP70的氨基酸序列至少50％等同的氨基酸序列。HSP70片段的长度小于625个氨基酸。该片段可以具有参照蛋白的生物活性。例如，在一个实施方案中，该片段能够结合专门的抗原呈递细胞(APC)，例如树状细胞(DC)，或者该片段能够介导嵌合多肽(由免疫原成分的DNA所编码)转运到胞质中。在一个实施方案中，第一DNA或者第二DNA(或者两者)编码热激蛋白或ETA(dII)的片段例如(例如，SEQ ID NO3)。
(免疫原性成分的)DNA的第二结构域(或者第三结构域，如果也存在胞质转运结构域的话)能编码抗原表位，例如I类MHC-限制性抗原。在一个实施方案中，所述抗原来自病毒，例如人乳多空病毒，例如，宫颈癌-相关的人乳头瘤病毒(HPV)。所述病毒抗原可以是来自HPV-16的E6或E7抗原的全部或部分。本发明的嵌合核酸能够表达的其它病毒抗原包括牛病毒性腹泻病毒E2抗原；巨细胞病毒的ppUL83或pp89；脑炎病毒SLE的prM/E；乙肝病毒的HBV表面抗原或者HBV核心抗原；HIV-1抗原，例如gp160；单纯疱疹病毒的ICP27，gD2，糖蛋白B，或者单纯疱疹病毒糖蛋白B。备选地，所述抗原可以是癌症(例如肿瘤—相关的)抗原，例如突变体p53；与黑素瘤细胞相关的MAGE-1或者MAGE-3，例如在肿瘤细胞表面上表达的癌症-相关抗原。其它抗原包括疟疾肽(NANP)40，HIV-1 p24，或者流感核蛋白。
编码嵌合多肽的第一结构域的DNA可以包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者其片段。在一个实施方案中，编码的蛋白是包含二硫键，例如跨越SEQ ID NO1的Cys 51和Cys93的二硫键的功能性GM-CSF片段。GM-CSF的其它生物活性片段是包括SEQ IDNO1的残基18-22，34-41，38-48，52-61，94-115，95-111的多肽。
备选地，编码第一多肽结构域的DNA可以包括Flt3配体(FL)(例如参见SEQ ID NO25)，CTLA-4，4-1BB，CD40配体，或者TNF受体序列(或者其APC-结合片段)或者APC-结合多肽序列。
编码第二多肽结构域的DNA能编码转运结构域序列，例如假单胞杆菌外毒素A(ETA)的转运结构域序列，例如ETA的II结构域(dII)(例如，跨越SEQ ID NO3的大约253至大约364残基)。转运结构域是诱导与其连接的蛋白质或多肽转运到细胞的胞质溶胶的多肽。例如，第二DNA能编码来自白喉，梭状芽孢杆菌(Botulinum，例如tetanus)，炭疽芽孢杆菌(炭疽)，耶尔森氏菌，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(霍乱)，或者百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)毒素。本发明不受任何特定机理的限制，免疫原成分中编码转运结构域的DNA的存在能够通过从内体/溶酶体区室向细胞溶胶的抗原转运而增强该成分编码的抗原的I类MHC呈递。优选地，编码该毒素的基因的毒性结构域被突变或缺失。
所述免疫原成分不需要包含如上所述的第一，第二和第三DNA。在一个可供选择的实施方案中，编码第三结构域(需要其免疫性的靶抗原)的DNA可操作地连接于编码HSP的羧基末端片段(参见例如，SEQ IDNO9)，Flt-3配体(参见例如，SEQ ID NO25)，或者假单胞杆菌外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)(参见SEQ ID NO3)，或者APC结合多肽(没有编码转运体多肽的DNA存在)的DNA；在另一个实施方案中，所述嵌合核酸进一步编码编码转运体(例如，胞质转运体)多肽的DNA。例如，本发明的嵌合核酸能够编码包含E7-ETA，E7-HSP70，E7-GM-CSF，或E7-FL(即，E7-Flt-3配体)的融合多肽。本发明的免疫原成分可以含有与编码对其寻求免疫性的抗原的DNA可操作地连接的SEQ ID NO25 (Flt-3配体)的大约1至大约189残基的编码DNA。
本发明的嵌合核酸还能编码含有E7-HSP70融合多肽，GM-ETA(dII)-E7融合多肽，或者ETA(dII)-E7(即，没有GM成分)的免疫原成分。
本发明还提供了一种DNA疫苗。所述DNA疫苗组合物能够含有一种质粒或者其它表达载体，其包括(a)编码热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)，或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者，一种与专门的抗原呈递细胞结合的多肽的第一DNA，和(b)编码一种抗原，例如I类MHC限制性抗原的第二DNA。所述疫苗可以包括包括编码胞质转运体多肽的DNA的第三结构域。以这样一种方式将多肽结构域编码序列(DNA)克隆到表达(例如质粒)载体中，使得第一，第二，和，如果合适，第三DNA是＂符合读框＂的(可操作地连接)。当在转化了表达(质粒)载体的细胞中转录和翻译时，该载体指导产生包括上述结构域(例如APC-结合部分，胞质转运体部分，和I类限制性抗原的表位)的嵌合多肽。
在一个可供选择的实施方案中，分离本发明的嵌合核酸(DNA)(多核苷酸)，表达盒，和本发明的多肽。所谓＂分离的＂指，例如，没有在生物体自然存在的基因组中位于感兴趣的基因序列的旁侧的基因的核酸分子。因此，该术语包括，例如，插入到，例如，载体中的重组DNA；插入到自主复制的质粒和病毒中的重组DNA；或者插入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA；或者独立于其它序列的作为独立的分子存在的DNA(例如通过PCR或者限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组DNA或cDNA片段)。还包括是编码另外的多肽序列杂合基因的一部分的重组DNA。该术语不包括基因组DNA的大节段，例如，象粘粒克隆中存在的那些，其包含旁侧连接一个或多个在自然存在的基因组中在其旁侧自然连接的其它基因的给定DNA序列。也参见这里对“分离的”定义。
核酸分子(或者多核苷酸)包括RNA和DNA，包括cDNA，基因组DNA，和合成的(例如化学合成的)DNA。单链情况下，所述核酸分子可以是有义链或反义链。因此，该术语包括，例如，插入到载体中的重组DNA；插入到自主复制的质粒和病毒中的重组DNA；或者在除了其天然位点之外的位点插入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA；或者独立于其它序列地作为单独的分子存在的重组DNA(例如通过聚合酶链式反应(PCR)产生的或者限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组DNA或cDNA片段)。还包括是编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
在本发明范围内的是编码免疫原成分(嵌合多肽，或者“融合蛋白”)的嵌合核酸(DNA)，包括表达盒中的编码序列，载体，本发明的DNA疫苗，包含具有给定的参考序列(例如结核分枝杆菌HSP70的羧基末端部分(SEQ ID NO9)，Flt-3配体(SEQ ID NO25)，GM-CSF(SEQ ID NO1)，假单胞杆菌的胞质转运结构域ETA dII(SEQ ID NO3))的核苷酸序列的链，或者具有足够高的序列相同性以便具有生物学等价的活性的链，或者，以高严谨性与具有参照序列的DNA链杂交的链，或者其片段。例如，本发明范围内的核酸包括与参照序列具有至少50％序列同一性，并且编码具有指定的生物活性的多肽的DNA，例如，假单胞杆菌ETA dII的胞质转运结构域。其它实例包括编码免疫原性成分的第一结构域的第一DNA编码的多肽的生物活性能结合到APC，第二DNA结构域编码的肽的生物活性可以是胞质转运结构域，第三DNA编码的肽的生物活性能结合到I类MHC分子。所述DNA可以具有与参照序列的至少大约75％同一性，大约85％同一性，大约90％同一性，大约95％同一性，或者大约99％同一性，或者100％同一性。
为了计算序列同一性，应用Lasergene软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)进行核苷酸和氨基酸比较。使用的MegAlign模块是Clustal V方法(Higgins等，1989，CABIOS 5(2)151-153)。使用的参数是缺口补偿10，缺口长度补偿10。
备选地，在本发明范围内的是编码在高度严谨条件下与具有参照序列(上文提到的)，或者其互补序列的DNA链杂交并且编码具有特定的生物活性的多肽的免疫原成分的嵌合核酸(DNA)。利用标准技术进行杂交，例如Ausubel等描述的方法(近代分子生物学方法(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley & Sons，1989)。＂高严谨性＂指特征在于高温和低盐浓度的核酸杂交和洗涤条件，即，洗涤条件是65℃，盐浓度是大约0.1 × SSC。＂低＂至＂中等＂严谨性指特征在于低温和高盐浓度的DNA杂交和洗涤条件，即，洗涤条件是低于65℃，盐浓度是至少1.0×SSC。例如，高严谨性条件可以包括在下面的条件下的杂交大约42℃，和大约50％甲酰胺；第一次洗涤在大约65℃，大约2× SSC，和1％SDS的条件下；接着的第二次洗涤是在大约65℃和大约0.1％× SSC的条件下。通过下面的杂交检测适合检测与参照基因或者序列有大约50％序列同一性的DNA序列的低严谨性条件大约42℃，不存在甲酰胺；第一次洗涤是在大约42℃，大约6× SSC，和1％SDS的条件下；第二次洗涤是在大约50℃，大约6× SSC，和大约1％SDS的条件下。
本发明包括通过对哺乳动物施用如上所述的编码免疫原成分的嵌合核酸，或者嵌合多肽对哺乳动物诱导对抗原的细胞毒性T细胞应答的方法。在一个实施方案中，所述成分以裸DNA施用。也可以在增强靶细胞对DNA或多肽的吸收的活性剂的存在下施用所述成分(例如DNA，多肽，载体等)，例如磷脂制剂，例如脂质体。
该方法用于对哺乳动物接种抗病原体感染。在一个实施方案中，本发明的嵌合多肽(和编码它们的嵌合核酸)包括来自所述病原体，例如病毒和细菌的抗原。该方法还用于对哺乳动物预防癌症的发生或者治疗已经存在的癌症。利用公知方法，例如基因筛选来鉴定有发生某些类型癌症的危险的哺乳动物。通过施用其中(例如第三)DNA的抗原结构域编码癌症(肿瘤)-相关抗原，例如与宫颈癌相关的HPV E7的成分治疗有发生癌症危险或者患有癌症的患者(该症状被＂缓解＂)。
本发明还提供了多核苷酸，当体内直接导入哺乳动物时，诱导编码的多肽在动物体内表达，并且接着又诱导对编码的多肽特异性的CD8+免疫应答。所述多核苷酸可以是这样的一种核酸，其包括基本调控元件(例如转录和翻译调控元件，例如启动子)，使得在导入活的脊椎动物细胞时，该细胞能产生由所述多核苷酸编码的翻译产物。例如，所述多核苷酸可以是编码热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者其组合或者片段的多脱氧核糖核酸。
编码期望对其有免疫应答的抗原性多肽的嵌合核酸(DNA)能够与转录启动子可操作地连接。在一些情况下，该多核苷酸编码的抗原正常情况下在那种动物中不存在；其只在病理症状下的该动物中存在(例如，与病毒相关的异源蛋白质)。在另外的情况下，所述抗原可以是自身多肽，例如，肿瘤-相关抗原，其在疾病状态下或者其它状态下被错误调节。所述嵌合核酸(例如DNA疫苗)编码的多肽是体内合成的(即，动物自身组织产生的)；细胞能够将表达的嵌合蛋白加工处理并且由MHC分子表达，例如，I类MHC多肽。
包括编码该抗原的嵌合核酸的多核苷酸可以连接成用于体内施用的合适的构建体，例如，对于多核苷酸接种特异性地优化的表达载体。所述嵌合多肽-编码序列与调控元件可操作地连接，例如转录启动子，增强子，免疫原表位，编码免疫增强或者免疫调控基因的另外的编码序列(例如顺反子)，其可以具有其自身的调控元件(例如，启动子，转录中止子)；所述构建体还可以包括复制的细菌起点和/或抗生素抗性基因。所述载体还可以包含表达多顺反子的mRNA的内核糖体进入位点(IRES)。转录启动子包括例如T7或SP6启动子这样的强有效的RNA聚合酶启动子。
这里描述的多核苷酸和DNA疫苗激发抗编码的抗原的保护性免疫性。例如，注射编码抗原E7的DNA表达载体导致肿瘤细胞死亡或者降低肿瘤细胞生长。接种之后产生抗肿瘤细胞的抗原特异性CTLs。
很多优点与本发明的嵌合核酸和表达系统的体内施用接种策略有关。很多已知的DNA疫苗的缺点在于它们有限的效价。与标准DNA疫苗相反，本发明的嵌合核酸(多核苷酸)和接种方法产生有效的抗原特异性免疫治疗。本发明的多核苷酸和DNA疫苗能够诱导细胞免疫应答，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，这种应答比常规DNA疫苗更有效至少大约2-倍，至少大约10-倍，至少大约20-倍，至少大约30-倍，或者至少大约40-倍，所述常规DNA疫苗是例如不包含本发明嵌合核酸的那些，例如编码一种嵌合多肽的序列，所述嵌合多肽包括包括编码热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列(或者APC-结合结构域或者胞质转运结构域)的第一多肽结构域；和包括抗原多肽的第二多肽结构域。
通过本领域公知的方法测定疫苗效价，例如，如本文所述，通过测定接种之后诱导的CD8+T细胞前体或者通过测定接种之后病原体(例如病毒)或者肿瘤的荷重的减少。尽管本发明不受任何特殊作用机理的限制，DNA疫苗中编码的多肽可以具有进入I类MHC途径并且激发细胞毒性T细胞应答的潜能。在一个实施方案中，具体设计本发明的嵌合核酸(例如DNA疫苗)，以便指导免疫原通过编码胞质转运多肽结构域(＂胞质转运体结构域＂)进入I类MHC抗原-加工处理途径。作为结果，优化细胞毒性T细胞应答的激发作用。
DNA疫苗的其它优点包括大规模生产的安全性和简单性。本发明的疫苗对于驯养动物或畜牧业动物以及对于人是安全而有用的。例如，裸质粒DNA是安全的，具有低免疫原性，并且能反复施用。DNA疫苗容易以高纯度大规模制备并且相对于蛋白质和其它生物聚合物来说是高度稳定的。参见例如美国专利Nos.5,580,859；5,589,466；5,910,488。
要导入到疫苗赋形剂中的可表达DNA或者转录的RNA的量可以根据使用的转录和翻译启动子的强度而不同。例如，免疫应答的强度取决于蛋白质表达水平和表达的基因产物的免疫原性。一般情况下，直接对机体组织，例如肌肉或真皮组织直接施用大约1ng-5mg，100ng-2.5mg DNA之间的，或者大约1微克—大约750微克DNA之间的，或者大约10微克—大约300微克的DNA之间的有效剂量范围。静脉内施用(IV)DNA的一种剂量是大约该DNA分子的106-1022个拷贝。皮下注射(SC)，皮内导入，通过皮肤压印，和施用的其它方式例如腹膜内，静脉内，或者吸入法送递也是合适的。例如，可以通过“biolistics”例如使用“基因枪”施用DNA。可以以相同的方式加强接种。参见，例如美国专利Nos6,004,287；5,753,477；5,179,022。
也可以配制DNA疫苗作为单核细胞增生利斯特氏菌的一部分使用公知方法送递，例如公开在Pan等，1995，癌症研究(Cancer Res.)55(21)4776-4779和Pan等，1995，天然药物(Nature Med.)1(5)471-7中的那些。用多核苷酸免疫原接种之后，通过施用相应的多肽免疫原也可以加强免疫应答。
所述嵌合核酸，载体或者其它多核苷酸可以是裸的，即，不结合以任何蛋白质，佐剂或者影响受者免疫系统的其它活性剂。在生理可接受溶液例如无菌盐水或者无菌缓冲盐水中施用裸的DNA。
备选地，所述DNA可以结合以脂质体，例如卵磷脂脂质体或者作为DNA-脂质体混合物。也可以使用有助于细胞吸收DNA的试剂(即，有利于转染的试剂)，例如也可以使用钙离子。用多核苷酸包衣的微轰击粒子也用作施用疫苗的工具，例如，金颗粒。小颗粒脂质体或脂质复合气溶胶化合物也可以用来送递本发明的核酸，参见，例如，美国专利No.6090407。
免疫原成分的功能元件本发明的核酸包括能被表达产生具有两个或三个或多个功能结构域的嵌合基因产物的邻接的核酸序列包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者APC-结合结构域的第一多肽结构域；和包括抗原性多肽(例如，I类MHC限制性表位)的第二多肽结构域。所述嵌合核酸进一步包括胞质转运结构域-编码序列。编码的基因产物产生有效免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。这种应答比施用嵌合基因产物更有效并且比施用一种DNA疫苗更有效，所述DNA疫苗编码一种抗原(例如，I类MHC限制性表位)，所述抗原没有热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，或者APC-结合部分；或者，如在一个实施方案中的，胞质转运部分。
赋予抗原特异性免疫应答增强的HSP70结构域根据下文实施例5的详细描述，测定结核分枝杆菌HSP70的结构域结构。鉴定了至少三个功能结构域ATP酶结构域(包含SEQ ID NO9的残基1-356)，底物结合结构域(SD；包含SEQ ID NO9的残基357-516)和羧基末端结构域(CD；包含SEQ ID NO9的残基517-625)(图16)。测定了该HSP70的每一个结构域对裸DNA疫苗效价的贡献。编码各结构域的DNA符合读框地连接，即，可操作地连接，于编码乳头瘤病毒抗原E7的DNA。测定了E7-特异性CD8 T细胞免疫应答。
结果表明当插入DNA疫苗构建体中时，编码HSP70的胞质结构域(CD)的DNA提高该DNA疫苗对该疫苗编码的靶抗原产生免疫性的效价。此外，胞质结构域导致了包含全长HSP70的DNA构建体中的抗原特异性I类MHC限制性CD8+T细胞免疫应答增强的大部分。
定义除非另有说明，这里使用的所有的技术和科学术语具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的意义。如这里使用的，除非另有说明，下面的术语具有对它们描述的意义。
这里使用的术语＂抗原＂或者＂免疫原＂指包括一种肽，多肽或蛋白质的一种化合物或组合物，其当以合适的量(“免疫有效量”)施用(或者通过施用核酸，例如DNA疫苗而体内表达)时，其是＂抗原性＂或＂免疫原性＂的，即，能激发，加强或增强细胞和/或体液免疫应答(其也可以是免疫抑制的，例如，在诱导抑制的情况下)，不管是单独的还是组合的或者连接或者融合另一种物质(其可以一次施用或者几次间隔施用)都是如此。
这里使用的术语＂表达盒＂指一种核苷酸序列，其能够影响结构基因(即蛋白质编码序列)在与该序列相容的宿主中的表达。表达盒至少包括与多肽编码序列可操作地连接的启动子；和，任选地，有其它序列，例如转录终止信号。也可以使用影响表达需要的或有帮助的另外的因子，例如，增强子。这里使用的＂可操作地连接＂指在DNA序列的上游连结启动子使得该启动子介导DNA序列的转录。因此，表达盒也包括质粒，表达载体，重组病毒，任何形式的重组＂裸DNA＂载体等。＂载体＂包括能够感染，转染，瞬时或永久转导细胞的核酸。要认识到载体可以是裸核酸，或者与蛋白质或脂质复合的核酸。所述载体任选地包括病毒或细菌核酸和/或蛋白质，和/或膜(例如细胞膜，病毒脂质被膜等)。载体包括，但不限于复制子(例如RNA复制子(参见下面的实施例6)，噬菌体)，DNA片段可以与其连接并且变得可复制。因此，载体包括，但不限于RNA，自主复制的环状或线形DNA或RNA(例如质粒，病毒等等，参见例如美国专利No.5,217,879)，并且包括表达和非表达质粒两者。当重组微生物或细胞培养物被描述为宿有＂表达载体＂，这包括染色体外环状和线形DNA或已经插入到宿主染色体中的DNA。宿主细胞保持载体，该载体或者作为自主结构在有丝分裂期间细胞可以稳定复制载体，或者载体被插入宿主基因组中。
术语＂连接＂或＂化学连接＂指两个部分的任何化学键合，例如，在本发明的一个实施方案中，ER侣伴多肽与抗原多肽化学连接。这样的化学连接包括重组或体内产生的融合蛋白的肽键合。
术语＂嵌合蛋白＂或＂融合蛋白＂指包括至少一个与第二肽或肽结构域结合的多肽或肽结构域的成分。例如，在一个实施方案中，本发明提供了编码融合蛋白(嵌合多肽)的分离的或重组的核酸分子，所述融合蛋白(嵌合多肽)包括至少两个结构域，包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列的第一多肽结构域，和包括抗原性多肽的第二多肽结构域。附加的结构域可以包括多肽，肽，多糖等等。＂融合＂可以是通过肽键，化学连接，电荷相互作用(例如静电吸引，例如盐桥，H-键等)等产生的结合。如果多肽是重组的，＂融合蛋白＂可以从普通的信使翻译来。备选地，可以通过任何化学或静电方法连接结构域成分。本发明的嵌合分子还可以包括附加的序列，例如，接头，表位标记，酶裂解识别序列，信号序列，分泌信号等等。备选地，可以简单地将肽和载体连接以有利于嵌合多肽的操作或鉴定/定位。
术语＂抗原性＂或＂免疫原＂或＂免疫原性成分＂指一种化合物或成分，其包括不管是单独的还是组合的或者与另一种物质连接或融合都是＂免疫原性的＂，即能够激发，加强或增强细胞和/或体液免疫应答的肽，多肽或蛋白质。免疫原成分可以是至少5个氨基酸的肽，长度10个氨基酸的肽，长度15个氨基酸的片段，长度20个氨基酸或者更长的片段。所述免疫原可以包括＂载体＂多肽和半抗原，例如，与另一种成分融合或连接(化学法或者其它方法)的融合蛋白或载体多肽。所述免疫原可以在免疫载体中重组表达，所述免疫载体可以是包括与启动子可操作地连接的免疫原编码序列的简单地裸的DNA，例如，简单表达盒。免疫原包括抗原决定簇，或者表位，抗体与之结合，或者当与MHC分子的肽结合位点结合时，T淋巴细胞受体(TCRs)与之结合；这些表位一般3-10个氨基酸长。
这里使用的术语＂分离的＂，当指一种分子或成分时，例如，本发明的嵌合核酸或多肽，指与至少一种其它化合物例如蛋白质，其它核酸(例如RNA)，或者体内或者其天然存在状态下与之联合的其它污染物分开的分子或成分。因此，当其与任何其它成分分离时，认为该成分是分离的，所谓其它成分是其“天然”情况下与之结合的或者因为和在细胞提取物中一样，体外或体内产生而关联的成分，例如细胞膜。但是，分离的成分也可以是基本上纯的。分离的成分可以是均一的并且可以是无水或有水溶液。例如，应用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或者高效液相色谱(HPLC)能测定纯度和同质性。因此，本发明的分离的成分不含有与它们的原位环境正常地相关的物质。即使在蛋白质被分离为同质或者优势泳带，也有痕量的与期望的成分共-纯化的污染物。
包括HPV-16 E7多肽的短语＂HPV多肽＂描述了本领域公知的多肽；例如，关于HPV-16 E7，参见，例如，GenBank登记号No.AF125673(1999年6月1日)描述了完整的HPV-16基因组和HPV-16 E7蛋白质。
术语＂多肽＂，＂蛋白质＂和＂肽＂包括本发明的成分，其也包括结构和功能基本上相应于从中衍生出变体的多肽的＂类似物＂，或者＂保守变体＂和＂模拟物＂或者＂模拟肽＂，包括，例如，热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列。
术语＂药物组合物＂指适合受试者药物应用的组合物，例如，作为疫苗。本发明的药物组合物是含有药学有效量的包括例如核酸或者载体或者本发明的细胞的成分和药学可接受载体的制剂。
术语＂启动子＂是一系列指导核酸转录的核酸控制序列。如这里所使用的，启动子包括接近转录起始位点的必需的核酸序列，例如在II型聚合酶启动子情况下，是TATA元件。启动子也任选地包括位于转录起始位点远至几千个碱基对的远侧增强子或抑制子元件。＂组成型＂启动子在大多数环境和发育条件下是活性的。＂可诱导的＂启动子在环境或发育调节下是活性的。＂组织特异性＂启动子在生物体的某些组织类型中是活性的，但是在该相同生物体的其它类型组织中没有活性。术语＂可操作地连接＂指核酸表达调控序列(例如启动子，或者转录因子结合位点的列阵)和其中表达调控序列指导相应于第二序列的核酸的转录的第二核酸序列之间的功能连接。
术语＂重组＂指合成的或者以其它方式体外操作的多核苷酸(例如＂重组多核苷酸＂)，指使用细胞内或者其它生物系统内产生基因产物的重组多核苷酸的方法，或者指重组多核苷酸编码的多肽(＂重组蛋白＂)。例如，这里描述的重组核酸和多肽可以用来实施本发明方法。＂重组方法＂也包括将具有来自不同来源的不同编码区或结构域或启动子序列的核酸连接到用于表达例如在用来实施本发明的载体中的可诱导或组成型表达多肽编码序列的表达盒或表达载体中。
术语＂自主复制RNA复制子＂指以RNA病毒，例如，甲病毒基因组RNA(例如，新培斯病毒，Semliki Forest病毒，等)为基础的构建体，其已经被基因工程处理可以表达异源RNA和蛋白质。这些重组载体是自主复制的(即，它们是＂复制子＂)并且能够作为裸RNA或DNA导入细胞，这一点在下文中将详细描述。在一个实施方案中，自主复制RNA复制子包括新培斯病毒自主复制RNA载体S1Nrep5，其详细描述于美国专利No.5,217,879。
术语＂全身施用＂指以导致将组合物或药物导入循环系统的方式施用组合物或药物，例如本发明的DNA疫苗或者这里描述的嵌合核酸和多肽。术语＂区域施用＂指对特定的解剖学空间例如腹膜内，鞘内，硬膜下或者对具体器官施用组合物或药物等。例如，区域施用包括将用于对肝部位给药的组合物或药物施加给肝动脉中。术语＂局部给药＂指对局限的，有限的解剖学空间施用组合物或药物，例如肿瘤内注射到肿瘤物质中，皮下注射，肌内注射等等。本领域技术人员都明白局部施用或者区域施用都可以导致组合物或药物进入循环系统。
核酸的产生和操作如这里所述，为施用编码融合蛋白的核酸提供本发明方法。可以体内或体外合成重组融合蛋白。编码这些成分的核酸可以是“裸DNA”形式或者它们可以被插入用于体内或离体施用的质粒，载体，重组病毒(例如＂复制子＂)等中。可以制备并且体外或体内表达本发明的核酸和载体，可以利用制备和表达这些基因和载体的多种不同的方法。本领域技术人员要认识到通过调节用来实施本发明的载体中的基因和核酸(例如启动子)的表达或活性可以获得期望的基因活性。对于增强或减弱基因表达或活性或组织特异性所描述的任何公知方法可以用于本发明。本发明可以结合本领域公知的在科技和专利文献中充分描述的任何方法或方案加以实施。
一般技术可以从各种来源，一般是基因工程的，扩增的和/或重组表达的各种来源分离用于实施本发明的核酸序列，不管是RNA，cDNA，基因组DNA，载体，重组病毒或者其杂合体。可以使用任何重组表达系统，除了细菌细胞之外，包括例如哺乳动物，酵母，昆虫或者植物细胞表达系统。或者，可以通过公知的化学合成技术体外合成这些核酸，如描述于，例如，Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)105661；Belousov(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 253440-3444；Frenkel(1995)；自由基生物药物(Free Radic.Biol.Med.)19373-380；Blommers(1994)生物化学(Biochemistry)337886-7896；Narang(1979)酶学方法(Meth.Enzymol.)6890；Brown(1979)酶学方法(Meth.Enzymol.)68109；Beaucage(1981)四面体快报(Tetra.Lett.)221859；美国专利No.4,458,066。然后，通过合成互补链并且在合适的条件下将链一起退火，或者通过使用DNA聚合酶用合适的引物加入互补链，可以获得双链DNA片段。
操作核酸的技术例如在序列中产生突变，亚克隆，标记探针，测序，杂交等都详细描述于科技和专利文献中，参见，例如，Sambrook，编著，分子克隆实验手册(MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL)(第二版)，Vols.1-3，冷泉港实验室，(1989)；当代分子生物学方法(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，Ausubel，编著，John Wiley & Sons，Inc.，纽约(1997)；生物化学和分子生物学实验技术与核酸探针杂交(LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGYHYBRIDIZATIONWITH NUCLEIC ACID PROBES)，第I部分.理论和核酸制备(Theoryand Nucleic Acid Preparation)，Tijssen，编著，Elsevier，N.Y.(1993)。
通过本领域技术人员公知的任何一种一般方法可以分析和鉴定核酸，载体，壳体，多肽等。这些包括例如分析生物化学方法，例如NMR，分光光度法，放射照相法，电泳，毛细管电泳，高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)，和超扩散色谱，各种免疫学方法，例如液体或凝胶沉淀素反应，免疫扩散，免疫电泳，放射免疫测试(RIAs)，酶联免疫吸附测定(ELISAs)，免疫荧光测定，Southern分析，Northern分析，点印迹分析，凝胶电泳(例如SDS-PAGE)，RT-PCR，定量PCR，其它核酸或靶物或信号扩增方法，放射标记，闪烁计数，和亲和层析。
核酸的扩增寡核苷酸引物可以用来扩增核酸产生用来实施本发明的融合蛋白编码序列，用来监测体内施用之后疫苗的水平(例如质粒或病毒的水平)，用来证实激活的CTL的存在和表型等等。本发明技术人员可以利用已知序列选择和设计合适的寡核苷酸扩增引物，所述已知序列例如，编码热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌属外毒素A(ETAdII)的胞质转运结构域，或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)序列的那些。扩增方法也是本领域公知的，例如，聚合酶链反应，PCR(PCR方法，方法指南和应用(PCR PROTOCOLS，A GUIDE TO METHODSAND APPLICATIONS)，Innis，Academic Press出版，N.Y.(1990)和PCR策略(PCR STRATEGIES)(1995)，Innis，Academic Press出版，Inc.，N.Y.，连接酶链反应(ligase chain reaction)(LCR)(参见例如，Wu(1989)基因组(Genomics)4560；Landegren(1988)科学(Science)2411077；Barringer(1990)基因(Gene)89117)；转录扩增(例如参见，Kwoh(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 861173)；和自身保持序列复制(参见例如，Guatelli(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 871874)；Qβ复制酶扩增(参见例如，Smith(1997)临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)351477-1491)，自动β复制酶扩增测定(参见例如，Burg(1996)分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)10257-271)和其它RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；也参见Berger(1987)酶学方法(Methods Enzymol.)152307-316；Sambrook；Ausubel；美国专利Nos.4,683,195和4,683,202；Sooknanan(1995)生物技术(Biotechnology)13563-564。
表达盒的克隆和构建表达盒，包括质粒，重组病毒(例如，RNA病毒，象下面描述的复制子)和编码这里描述的融合蛋白的其它载体被用来体外和体内表达这些多肽。科技和专利文献中充分描述了通过各种常规技术表达重组核酸。参见例如，Roberts(1987)自然(Nature)328731；Schneider(1995)蛋白质实验纯化(Protein Expr.Purif.) 643510；Sambrook，Tijssen或Ausubel。质粒，载体等可以从天然来源分离，从象ATCC或GenBank库这样的来源获得，或者通过合成或重组方法制备。
用来实施本发明的核酸可以在细胞(例如附加型表达系统)中稳定或瞬时表达。可以插入选择标记对转化的细胞赋予稳定表型。例如，选择标记可以标记附加型保持和复制使得不要求整合到宿主基因组中。例如，标记物可以标记抗生素抗性(例如，氯霉素，卡那霉素，G418，博莱霉素，潮霉素)或者除草剂抗性(例如，氯磺隆和Basta)，使筛选用期望的DNA序列转化的那些细胞(参见例如，Blondelet-Rouault(1997)基因(Gene)190315-317；Aubrecht(1997)药物实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)281992-997)。
体内核酸施用在一个实施方案中，将本发明的嵌合核酸克隆到能体外，离体和/或体内转染或感染细胞(例如人或其它哺乳动物细胞)的表达盒(例如质粒或者其它载体，病毒)中。可以使用任何方法，例如以脂质或脂质体为基础的基因送递(例如参见，Mannino(1988)生物技术(Bio Techniques)6682-691；美国专利No.5,279,833)，具有期望的异源序列作为逆转录病毒基因组的一部分的复制缺陷逆转录病毒载体(参见例如，Miller(1990)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)104239；Kolberg(1992)J.NIH Res.443；Cornetta(1991)人体基因治疗(Hum.Gene Ther.)2215)。也参见例如Zhang(1996)癌症转移研究(Cancer Metastasis Rev.) 15385-401；Anderson，科学(Science)(1992)256808-813；Nabel(1993)TIBTECH 11211-217；Mitani(1993)TIBTECH 11162-166；Mulligan(1993)科学(Science)，926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11167-175；Miller(1992)自然(Nature)357455-460。
表达盒也可以来自病毒基因组。可以使用的载体包括重组修饰的有包膜或者没有包膜的DNA和RNA病毒，例如，来自杆状病毒科(baculoviridiae)，细小病毒科(parvoviridiae)，picornoviridiae，疱疹病毒科(herpesveridiae)，痘病毒科(poxviridae)，腺病毒科(adenoviridiae)，细小核糖核酸病毒科(picornnaviridiae)或者甲病毒科(alphaviridae)。也可以使用利用每一个母体载体性能的有利优点的嵌合载体(参见例如，Feng(1997)自然生物技术(Nature Biotechnology)15866-870)。可以通过重组DNA技术修饰这样的病毒基因组来包括肿瘤抑制剂基因并且可以基因工程处理为复制缺陷，条件复制或者复制有效。所述载体可以是复制缺陷或条件复制的。载体可以来自腺病毒，腺—相关病毒或者逆转录病毒基因组。逆转录病毒载体可以包括以下面为基础的那些鼠白血病病毒(MuLV)，长臂猿无尾猿白血病病毒(GaLV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，以及其组合。参见例如，Buchscher(1992)病毒学杂志(J.Virol.)66(5)2731-2739；Johann(1992)病毒学杂志(J.Virol.)66(5)1635-1640(1992)；Sommerfelt(1990)病毒学(Virol.)17658-59；Wilson(1989)病毒学杂志(J.Virol.)632374-2378；Miller(1991)病毒学杂志(J.Virol.)652220-2224。也可以使用以腺—相关病毒(AAV)为基础的载体来转导细胞，例如，用于体外产生核酸和肽，和体内和离体治疗方法。参见，Okada(1996)基因治疗(Gene Ther.)3957-964；West(1987)病毒学(Virology)16038-47；Carter(1989)美国专利No.4,797,368；Carter等WO 93/24641(1993)；Kotin(1994)人体基因治疗(Human Gene Therapy)5793-801；Muzyczka(1994)临床研究杂志(J.Clin.Invst.)941351，是关于对AAV载体的综述。
使用自主复制RNA复制子体内施用除了上述表达载体和重组病毒之外，也可以使用自主复制的RNA复制子来感染细胞或组织或整个生物体本发明融合蛋白—表达核酸。因此，本发明也包括经基因工程处理使表达异源RNA和蛋白质的RNA病毒，例如甲病毒基因组RNA(例如，新培斯病毒；Semliki Forest病毒；Venezuelan equine脑炎病毒等等)。当异源编码序列取代病毒结构基因时，实现异源序列，例如本发明的融合蛋白的高水平表达。
这些重组RNA是自主复制的(即它们是＂复制子＂)并且可以作为裸RNA或DNA被导入细胞。但是，它们要求包装反互补并且作为感染病毒体颗粒从细胞释放出。缺陷辅助RNA包含复制所要求的顺—作用序列以及驱动多肽-编码的可读框表达的RNA启动子。在复制子和缺陷辅助RNA共同转染的细胞中，从复制子RNA翻译的病毒非结构蛋白质使得复制和转录缺陷辅助RNA，产生病毒体结构蛋白。参见例如，Bredenbeek(1993)病毒学杂志(J.Virol.)676439-6446。
RNA复制子疫苗可以来自甲病毒载体，例如新培斯病毒(披盖病毒科家族)(参见例如，Xiong(1989)科学(Science)2431188-1191)，SemlikiForest病毒(参见例如，Ying(1999)天然药物(Nat.Med.)5823-827)或者Venezuelan equine脑炎病毒(参见例如，Pushko(1997)病毒学(Virology)239389-401)载体。这些疫苗是自主复制的和自主限制的，并且可以作为RNA或DNA施用，其然后被转录到被转染的细胞中的RNA复制子中或者体内转录到RNA复制子中(参见例如，Berglund(1998)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)16562-565)。自主复制RNA感染不同范围的细胞类型并且使高水平表达感兴趣的抗原(参见例如，Huang(1996)当代生物技术论坛(Curr.Opin.Biotechnol.)7531-535)。另外，自主复制RNA最后引起被转染细胞的裂解，因为病毒复制对于感染的宿主细胞是有毒性的(参见例如，Frolov(1996)病毒学杂志(J.Virol.)701182-1190)。因此，这些载体不会引起与裸DNA疫苗整合到宿主基因组中相关的忧虑。这对于疫苗产生有致癌基因潜力的靶蛋白例如腺病毒E7蛋白特别重要。
在一个实施方案中，自主复制RNA复制子包括新培斯病毒自主复制RNA载体SINrepS，如详细描述于例如Bredenbeek(1993)病毒学杂志(J.Virol.)676439-6446；也参见，例如，Herrmann(1998)生物化学生物物理通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun)253524-531。
药物组合物的配制和施用在本发明的各实施方案中，多肽，核酸，表达盒，细胞，和颗粒作为药物成分以足以产生个体抗原特异性免疫应答(例如CTL应答)的量施加给个体。
用于核酸，肽和多肽的药学可接受载体和制剂是本领域技术人员公知的，并且在科技和专利文献中有详细描述，参见例如，最后一版的Remington′s制药科学(Remington′s Pharmaceutical Science)，Maack出版公司，Easton，PA(＂Remington′s＂)；Banga；Putney(1998)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)16153-157；Patton(1998)生物技术(Biotechniques)16141-143；Edwards(1997)科学(Science)2761868-1871；美国专利No.5780431；5770201)。
本发明方法中使用的核酸和多肽可以通过本领域公知的任何方法单独送递或者作为药物组合物送递，例如全身，部位和局部；通过动脉内，鞘内(IT)，静脉内(IV)，肠胃外，胸膜腔内，局部，口服或者局部施用，如皮下，气管内(例如通过气雾剂)或者跨膜(例如口腔，膀胱，阴道，子宫，直肠，鼻粘膜)。送递组合物的实际方法是本领域技术人员公知的或显而易见的，并且详细描述于科技和专利文献中，参见例如，Remington′s。
根据施用的方法和途径和频率，是否施用其它药物，个体应答等，可以通过任何方式并且以任何单位剂量形式施用本发明的药物组合物。典型核酸，肽和多肽药物组合物的剂量是本领域技术人员公知的。这样的剂量一般自然提议并且根据各种因素调节，例如，最初的反应(例如，产生的抗原特异性CTL量，肿瘤收缩等等)，具体的治疗方案，患者健康和耐药性。适合产生期望的反应的药物组合物的量定义为＂治疗有效剂量＂。用于该应用的剂量安排和有效量，即＂给药法＂将取决于各种各样的因素，包括，例如，通过免疫要治疗或预防的疾病或症状，患者健康的一般状态，患者身体状况，年龄，药物剂型和药物组合物的浓度等等。给药方案也要考虑药物动力学，即，药物组合物的吸收速度，生物利用度，代谢，清除率等等，参见例如Remington。可以凭经验确定剂量，例如，通过评价症状的减轻或改善，或者通过客观标准，例如，测定抗原特异性CTL水平。如上所述以根据需要的剂量和频率和患者的耐受性为基础，可以一次施用或者多次施用。可以单独地或者与其它治疗性处理相结合，或者作为预防性免疫来施用本发明的药物组合物。
试剂盒本发明提供含有如上所述实施本发明方法的本发明药物组合物的试剂盒。在一个可供选择的实施方案中，所述试剂盒可以含有本发明的重组和合成的嵌合多肽；或者，编码它们的核酸，例如，以裸DNA(例如质粒)，病毒(例如甲病毒-衍生的“复制子”，包括新培斯病毒复制子)等等的形式。试剂盒可以含有教导方法的说明材料，例如，施用用来实施本发明的组合物的方法，用本发明的核酸或多肽注射或感染细胞或患者或动物的方法，监测得到的免疫应答(例如CTL应答)的方法，以及对个体对施用的成分的反应的评价等等。
要明白这里描述的实施例和实施方案只是为了举例说明的目的，对本领域技术人员将提示各种修饰或改变，并且包括在本申请和后面的权利要求书的精神和范围内。
实施例提供下面的实施例举例说明，但不限制要求保护的的本发明的范围。
实施例1在体内抗原基因与HSP70基因的连接对DNA疫苗效价的增强和对肿瘤的治疗下面的实施例描述了证实本发明的成分和方法对于体内增强抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和治疗肿瘤是有效的这样的研究。
使用HPV-16 E7作为模型抗原，这里描述的数据指明含有编码具有热激蛋白，胞质转运部分，和I类MHC表位形式的抗原的嵌合多肽的多核苷酸的DNA疫苗导致对该表位的特异性的有效免疫性。评价了键联结核分枝杆菌热激蛋白70(HSP70)对裸DNA疫苗产生的抗原特异性免疫性的效价的影响。
结核分枝杆菌HSP70大大增强了HPV-16 E7-表达DNA疫苗的效价。具有与HPV-16 E7融合的HSP70的DNA疫苗激发强的E7-特异性细胞免疫性(E7-特异性CD8+T细胞前体频率至少增加30-倍)并且产生抗HPV-16 E7-表达鼠肿瘤的显著的CD8+T细胞-依赖性预防和治疗作用。
数据表明HSP70优先增强E7 DNA疫苗的CD8+T细胞应答。相反，HSP70连接没有可检测地增强CD4+T细胞应答。不能诱导通过流式细胞仪分析的可检测的IFN-γ-表达CD4+T细胞和不能诱导E7-特异性抗体证实了这一点。编码E7-HSP70融合基因的DNA疫苗将E7-特异性CD8+T细胞的频率相对于含有野生型E7基因的疫苗(没有HSP70基因序列存在下)提高了40-倍。更重要的是，对常规DNA疫苗(例如，编码单一抗原的疫苗)加入HSP70基因序列将效果较差的疫苗转化为具有显著抗已发生的E7-表达肿瘤的效价的疫苗。令人惊奇地，E7-HSP70融合疫苗专一地瞄向CD8+T细胞；免疫作用和抗肿瘤作用完全不依赖CD4。这些结果表明HSP70与抗原基因的融合通过CD8依赖途径大大增强了DNA疫苗的效价。
选择人乳头瘤病毒(HPV)-衍生的抗原，因为HPV，特别是HPV-16，与大多数宫颈癌相关。HPV致癌基因蛋白质，E6和E7，在大多数包含HPV的宫颈癌中在细胞转化的诱导和保持和共同表达中是重要的。瞄向E7和/或E6蛋白质的疫苗或免疫治疗能够预防和治疗HPV-相关的子宫颈恶性肿瘤。数据表明编码抗原的多核苷酸，例如全长E7-编码序列，连接到HSP-编码序列提高DNA疫苗的效价。对包含野生型HPV-16 E7的DNA疫苗和包含与结核分枝杆菌HSP70融合的全长E7的DNA疫苗评价它们的免疫应答产生和它们保护动物抗HPV-16 E7表达鼠肿瘤的能力。编码E7的DNA与编码HSP70的DNA的连接大大增加了E7-特异性CD8+T细胞的扩展和激活，完全忽略CD4臂。这种增强的CD8应答导致抗已发生的肿瘤的有效的抗肿瘤免疫性。
利用下面的材料和方法产生下述数据。
质粒DNA构建体和制备编码结核分枝杆菌HSP70的DNA片段是本领域公知的(GENBANK登记号No.Z95324 AL123456；核苷酸10633-12510编码HSP70)。
表1HSP70的氨基酸序列MARAVGIDLGTTNSVVSVLEGGDPVWANSEGSRTTPSIVAFARNGEVLVGQPAKNQAVTNVDRTVRSVKRHMGSDWSIEIDGKKYTAPEISARILMKLKRDAEAYLGEDITDAVITTPAYFNDAQRQATKDAGQIAGLNVLRIVNEPTAAALAYGLDKGEKEQRILVFDLGGGTFDVSLLEIGEGVVEVRATSGDNHLGGDDWDQRVVDWLVDKFKGTSGIDLTKDKMAMQRLREAAEKAKIELSSSQSTSINLPYITVDADKNPLFLDEQLTRAEFQRITQDLLDRTRKPFQSVIADTGISVSEIDHVVLVGGSTRMPAVTDLVKELTGGKEPNKGVNPDEVVAVGAALQAGVLKGEVKDVLLLDVTPLSLGIETKGGVMTRLIERNTTIPTKRSETFTTADDNQPSVQIQVYQGERELAAHNKLLGSFELTGIPPAPRGIPQIEVTFDIDANGIVHVTAKDKGTGKENTIRIQEGSGLSKEDIDRMIDAEAHAEEDRKRREEADVRNQAETLVYQTEKFVKEQREAEGGSKVPEDTLNKVDAAVAEAKAALGGSDISAIKSAMEKLGQESQALGQAIYEAAQAASQATGAAHPGGEPGGAHPGSADDVVDAEVVDDGREAK(SEQ ID NO9)，GENBANK Z95324 AL123456；结核分枝杆菌基因组的核苷酸10633-12510编码/表2编码HSP70的核苷酸序列atggctcg tgcggtcggg atcgacctcg ggaccaccaa ctccgtcgtc tcggttctgg aaggtggcgacccggtcgtc gtcgccaact ccgagggctc caggaccacc ccgtcaattg tcgcgttcgc ccgcaacggt gaggtgctggtcggccagcc cgccaagaac caggcagtga ccaacgtcga tcgcaccgtg cgctcggtca agcgacacat gggcagcgactggtccatag agattgacgg caagaaatac accgcgccgg agatcagcgc ccgcattctg atgaagctga agcgcgacgccgaggcctac ctcggtgagg acattaccga cgcggttatc acgacgcccg cctacttcaa tgacgcccag cgtcaggccaccaaggacgc cggccagatc gccggcctca acgtgctgcg gatcgtcaac gagccgaccg cggccgcgct ggcctacggcctcgacaagg gcgagaagga gcagcgaatc ctggtcttcg acttgggtgg tggcactttc gacgtttccc tgctggagatcggcgagggt gtggttgagg tccgtgccac ttcgggtgac aaccacctcg gcggcgacga ctgggaccag cgggtcgtcgattggctggt ggacaagttc aagggcacca gcggcatcga tctgaccaag gacaagatgg cgatgcagcg gctgcgggaagccgccgaga aggcaaagat cgagctgagt tcgagtcagt ccacctcgat caacctgccc tacatcaccg tcgacgccgacaagaacccg ttgttcttag acgagcagct gacccgcgcg gagttccaac ggatcactca ggacctgctg gaccgcactcgcaagccgtt ccagtcggtg atcgctgaca ccggcatttc ggtgtcggag atcgatcacg ttgtgctcgt gggtggttcgacccggatgc ccgcggtgac cgatctggtc aaggaactca ccggcggcaa ggaacccaac aagggcgtca accccgatgaggttgtcgcg gtgggagccg ctctgcaggc cggcgtcctc aagggcgagg tgaaagacgt tctgctgctt gatgttaccccgctgagcct gggtatcgag accaagggcg gggtgatgac caggctcatc gagcgcaaca ccacgatccc caccaagcggtcggagactt tcaccaccgc cgacgacaac caaccgtcgg tgcagatcca ggtctatcag ggggagcgtg agatcgccgcgcacaacaag ttgctcgggt ccttcgagct gaccggcatc ccgccggcgc cgcgggggat tccgcagatc gaggtcactttcgacatcga cgccaacggc attgtgcacg tcaccgccaa ggacaagggc accggcaagg agaacacgat ccgaatccaggaaggctcgg gcctgtccaa ggaagacatt gaccgcatga tcaaggacgc cgaagcgcac gccgaggaggatcgcaagcg tcgcgaggag gccgatgttc gtaatcaagc cgagacattg gtctaccaga cggagaagtt cgtcaaagaacagcgtgagg ccgagggtgg ttcgaaggta cctgaagaca cgctgaacaa ggttgatgcc gcggtggcgg aagcgaaggcggcacttggc ggatcggata tttcggccat caagtcggcg atggagaagc tgggccagga gtcgcaggct ctggggcaagcgatctacga agcagctcag gctgcgtcac aggccactgg cgctgcccac cccggcggcg agccgggcgg tgcccaccccggctcggctg atgacgttgt ggacgcggag gtggtcgacg acggccggga ggccaagtga(SEQ ID NO10)；GENBANK登记号No.Z95324 AL123456的核苷酸10633-12510。
为了产生HSP-表达质粒(pcDNA3-HSP)，将HSP70-编码DNA从pKS70亚克隆到巨细胞病毒启动子下游pcDNA3.1(-)表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)的独特BamHI和HindIII克隆位点中。为了产生HPV-16 E7-表达质粒(pcDNA3-E7)，利用设计的引物通过PCR扩增E7 DNA，分别在扩增的片段的5′和3′端产生BamHI和HindIII限制性位点。然后将扩增的E7 DNA克隆到pcDNA3.1的独特的BamHI和HindIII克隆位点。为了产生E7-HSP70嵌合体(pcDNA-E7-HSP70)，利用设计的引物通过PCR扩增E7 DNA，在扩增的片段的5′和3′端产生BamHI限制性位点。然后将E7 DNA亚克隆到pcDNA3-HSP的5′端。通过DNA测序证实这些构建体的精确性。将携带HSP，E7或E7-HSP70基因插入物的质粒DNA和＂空白＂质粒载体转染到亚克隆有效的DH5(TM细胞；Life Technologies，USA)中。然后扩增DNA并且利用两次CsCl纯化进行纯化(BioServeBiotechnologies，Laurel，Maryland)。在每一次制备中利用1％琼脂糖凝胶电泳检查DNA的完整性以及不存在大肠埃希氏杆菌DNA或RNA。通过在260nm下测定光密度来测定DNA浓度。通过限制性酶消化和凝胶电泳证实存在插入的E7片段。reticulum和calreticulum多肽(和编码它们的多核苷酸)是本发明免疫原组合物中HSP成分的有用的替代物。
表3HPV16 E7抗原的氨基酸序列MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO7)，GENBANK登记号No.AAD33353。
表4编码HPV E7的核苷酸序列atgcatgga gatacaccta cattgcatga atatatgtta gatttgcaac cagagacaac tgatctctac tgttatgagcaaaaaatga cagctcagag gaggaggatg aaatagatgg tccagctgga caagcagaac cggacagagc ccattacaatattgtaacct tttgttgcaa gtgtgactct acgcttcggt tgtgcgtacaaagcacacac gtagacattc gtactttggaagacctgtta atgggcacac taggaattgt gtgccccatc tgttctcaga aaccataa(SEQ ID NO8)；GENBANK登记号No.AF125673的核苷酸562-858。
DNA接种根据标准方法，使用氦-驱动基因枪(Bio-Rad，Hercules，CA)进行基因枪颗粒-介导的DNA接种。简要地说，通过将25mg 1.6μm金微载体(Bio-rad，Hercules，CA)和100微升0.05M亚精胺(Sigma，St，Louis，MO)混合制备DNA包被的金颗粒。接着在涡旋混合的同时依次向该微载体加入质粒DNA(50微克)和1.0M CaCl2(100微升)。使该混合物在室温(RT)下沉淀10分钟。然后将微载体/DNA悬浮物离心(10,000r.p.m.，5秒)并且在再次悬浮于3毫升聚乙烯吡咯烷酮(0.1mg/ml)(Bio-rad，Hercules，CA)的无水乙醇溶液中之前用新鲜无水乙醇洗涤3次。然后将溶液装入管中使静置4分钟。小心去除乙醇并且通过旋转管使微载体/DNA悬浮物均衡地接触管的内侧表面。然后通入每分钟0.4升的流动的氮气干燥管。然后将包被有微载体/DNA的干燥的管切成0.5-英寸的筒，并且在4℃下保存在有盖的干燥瓶中。作为结果，每一个筒含有1微克的质粒DNA和0.5mg的金。将DNA包被的金颗粒(1微克DNA/粒)使用氦-驱动基因枪(Bio-rad，Hercules，CA)送递到小鼠的修剪过的腹部区，基因枪的排放压为400p.s.I。
ELISPOT测试应用标准的ELISPOT测试来检测HPV-16 E7特异性CD8+T细胞。用50微升磷酸盐缓冲盐水中10微克/毫升大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(克隆R4-6A2，Pharmingen，San Diego，CA)包被96-孔滤板(Millipore，Bedford，MA)。4℃下培养过夜之后，洗涤孔并且用含有10％胎牛血清的培养基封闭。将来自各个接种小鼠组的新鲜分离的不同浓度的脾细胞，从1×106/孔开始，和15U/ml白细胞介素-2一起加给各孔。细胞在有或没有1微克/毫升E7特异性H-2Db CTL表位(E7，残基49-57；SEQ ID NO5)情况下在37℃下培养24小时。培养之后洗涤平板，然后将细胞与50微升PBS中的5微克/毫升生物素化的IFN-γ抗体(克隆XMG1.2，Pharmingen)在4℃下培养过夜。洗涤6次之后，加入50微升PBS中1.25微克/毫升抗生物素蛋白减性磷酸酶(Sigma，St.Louis，MO)，并且在室温下培养2小时。洗涤之后，通过加入50微升BCIP/NBT溶液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)显现斑点，并且在室温下温育1小时。使用解剖显微镜计数点数。
胞质内细胞因子染色和流式细胞仪分析来自天然的或者接种组小鼠的脾细胞或者与包含I类MHC表位的E7肽(残基4957；SEQ ID NO5)或者与包含II类MHC肽的E7肽(残基30-67；SEQ ID NO6)一起温育。测定其蛋白质和多肽残基代表I类MHC抗原表位的方法是本领域公知的。以2微克/毫升的浓度加入E7肽。为了检测E7-特异性CD8+T细胞前体和E7-特异性CD4+T辅助细胞应答，分别使用CD8+CTL表位残基49-57和残基30-67。在从培养物中收集细胞之前6小时加入GolgistopTM(Pharmigen，San Diego，CA)。然后细胞在FACSCAN缓冲液中洗涤一次并且用藻红蛋白(PE)-缀合的单克隆大鼠抗-小鼠CD8或CD4抗体(Pharmingen，San Diego，CA)染色。使用Cytofix/Cytoperm TM(Pharmingen)试剂盒根据厂商说明对细胞进行胞内细胞因子染色。FITC-缀合的抗-IFN-γ或者抗-IL-4抗体和免疫球蛋白同种型对照抗体(大鼠IgG1)都购自Pharmingen。在Becton-DickensonFACScanTM上使用CELLQuestTM软件(Becton Dickson ImmunocytometrySystem，Mountain View，CA)进行分析。
细胞因子的ELISA最后接种之后2星期收集脾细胞(4×106)并且与10微克/毫升的E7蛋白质一起在总体积2毫升的补充有10％(vol/vol)胎牛血清，50单位/ml青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，2mM非基本氨基酸的RPMI 1640中在24-孔组织培养平板中培养72小时。收集上清夜并且使用ELISA试剂盒(Endogen)根据厂商说明测试IFN-γ和IL-4的存在。
抗-E7 ELISA通过标准的直接ELISA测定血清中的抗-HPV 16 E7抗体。用100微升10微克/毫升细菌产生的HPV-16 E7蛋白质包被96微孔板并且在4℃下培养过夜。然后用含有20％胎牛血清的PBS将孔封闭。在免疫之后第14天从小鼠制备血清，用PBS系列稀释，加给ELISA孔，并且在37℃下培养2小时。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤之后，室温下该平板与1/2000稀释度的过氧化物酶-缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Zymed，San Francisco，CA)培养1小时。该平板洗涤6次，并且用TMB(Pierce，Rockford，IL)促生长，并且用1M H2SO4终止。用标准ELISA读数仪在450nm下对ELISA平板读数。
鼠肿瘤细胞系应用标准组织培养方法培养和保持鼠肿瘤细胞系TC-1。肿瘤细胞系的生长和小鼠中转化的细胞的肿瘤的形成是本领域认可的人类癌症的模型。HPV-16 E6，E7和ras致癌基因被用来转化原代C57BL/6小鼠肺上皮细胞。在补充有10％(vol/vol)胎牛血清，50单位/ml青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，2mM非基本氨基酸和0.4mg/ml G418的RPMI 1640中在37℃下在5％CO2中培养细胞。在肿瘤攻击的这一天，通过胰蛋白酶作用收获TC-1细胞，用1× Hanks缓冲盐溶液洗涤两次并且最后再次悬浮于设计为注射浓度的1× Hanks缓冲盐溶液中。
小鼠从国家癌症研究中心(the National Cancer Institute)(Frederick，Maryland)购得6至8周龄雄性C57BL/6小鼠。
体内肿瘤保护通过基因枪用2微克的HSP DNA，E7 DNA，E7-HSP70 DNA，或者没有插入物的空白质粒对小鼠接种(每组5只)。一周之后，用和第一次接种相同的给药法对小鼠加强免疫。另一组小鼠(每组5只)接种一次(没有进一步加强)。最后接种之后一周，用5×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞对小鼠右腿皮下攻击，并且每周两次监测。
体内肿瘤治疗如上所述制备肿瘤细胞和DNA疫苗。用2×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞对小鼠右腿皮下攻击。用TC-1肿瘤细胞攻击之后3天，通过基因枪对小鼠施用2微克的HSP DNA，E7 DNA，E7-HSP70 DNA，或者没有插入物的空白质粒。一周之后，用和第一次接种相同的给药法对小鼠加强免疫。另一组小鼠(每组5只)接种一次，肿瘤攻击之后没有进一步加强。每周两次监测。
体内抗体耗竭利用标准方法进行体内抗体耗竭(depletion)。通过基因枪用2微克的E7-HSP70 DNA接种C57BL/6小鼠，一周之后加强免疫，并且用5×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞攻击。抗体耗竭在肿瘤攻击之前一周就开始了。对于CD4耗竭，使用CD4-特异性单克隆抗体，例如，MAbGK1.5；对于CD8耗竭，使用CD8-特异性抗体，例如MAb 2.43，对于NK1.1耗竭，使用与NK细胞结合的抗体，例如，MAb PK136。流式细胞仪分析表明耗竭了95％以上的合适的淋巴细胞亚群，而其它亚群的水平正常。肿瘤攻击之后第40天抗体耗竭终止。
用E7-HSP70融合DNA接种增强E7-特异性CD8+T细胞介导的免疫应答CD8+T淋巴细胞是抗肿瘤效应子中最重要的成分。为了测定E7-HSP70 DNA疫苗产生的E7-特异性CD8+T细胞前体频率，利用酶联免疫斑点(ELISPOT)测试和胞内细胞因子染色。ELISPOT测试和胞内细胞因子染色都是用来测定单细胞水平的IFN-γ产生的敏感功能测试，它们因此被用来定量测定抗原-特异性CD8+T细胞。如图1A所示，对来自E7HSP70 DNA接种小鼠的每106个脾细胞检测对免疫显性Db-限制性E7(49-57；SEQ ID NO5)肽特异性的435 IFN-γ斑点形成CD8+T细胞，并且与来自E7 DNA接种小鼠的仅14 E7(49-57)-特异性IFN-γ斑点-形成CD8+T细胞/106脾细胞相比较。减去从只有pcDNA-3载体产生的背景(3点/106脾细胞)，对于E7和E7-HSP70 DNA疫苗分别得到11和432E7(49-57)-特异性IFN-γ斑点-形成CD8+T细胞。类似地，利用对CD8和胞内IFN-γ双染色通过流式细胞仪分析也可以定量测定E7(49-57)-特异性CD8+T细胞前体的量。从该项测试得到的值(图1B)与图1A中给出的ELISPOT结果密切相关。如图1B所示，通过流式细胞仪分析得知用E7-HSP70 DNA接种的小鼠产生最大数值的E7-特异性IFN-γ+CD8+T细胞前体(大约726/106脾细胞)，而用E7 DNA接种的小鼠没有给出高于载体接种的对照物的信号。这些数据表明编码E7的I类MHC限制性表位的DNA可操作地连接于编码HSP70的DNA或者其片段，导致E7-特异性CD8+T细胞前体频率提高至少30-倍。
用E7-HSP70融合DNA接种不增强E7-特异性CD4+T细胞介导的免疫应答为了测定E7-HSP70 DNA疫苗产生的E7-特异性CD4+T前体细胞和细胞因子分布，对来自免疫小鼠的脾细胞上的CD4表面标记物和胞内IFN-γ或IL-4进行双染色，接着进行流式细胞仪分析。体外将来自免疫小鼠的脾细胞与E7肽(残基30-67；SEQ ID NO6)一起培养过夜并且对CD4和胞内IFN-γ染色。E7肽(残基30-67；SEQ ID NO6)在HPV-16的E7可读框蛋白质中包含主要T辅助表位。利用流式细胞仪分析IFN-γ分泌CD4+T细胞百分比。如图2所示，与单独用野生型E7 DNA或载体接种的小鼠相比，用E7-HSP70 DNA接种的小鼠产生类似数量的CD4+IFN-γ+双阳性细胞。用与HSP70质粒混合的E7 DNA接种的小鼠产生稍高一些的CD4+IFN-γ+双阳性细胞，但是在各接种组之间在CD4+IFN-γ+双阳性细胞数目方面没有统计学意义差异。
作为检测E7-特异性CD4+T的CD4对胞内IFN-γ染色的能力的阳性对照，对用表达Sig/E7/LAMP-1(其将E7靶向II类MHC隔室)的DNA疫苗接种的小鼠的分析，证明相对于用E7 DNA或对照质粒接种的小鼠来说，CD4+IFN-γ+双阳性细胞增加3倍。也分析了用各种DNA疫苗接种的小鼠的IL-4分泌E7-特异性CD4+T细胞。在接受E7-HSP70 DNA，混合HSP70DNA的E7DNA，野生型E7 DNA，空白质粒DNA，或者没有接种的小鼠没有鉴定明显的CD4+IL-4+双阳性细胞。利用MICK-2IL-4分泌细胞(Pharmingen，San Diego，CA)作为阳性对照来保证用于该项研究的胞质内IL-4染色的成功。这些数据表明本发明的含有编码热激蛋白的全部或部分的DNA的DNA疫苗诱导独立于CD4+免疫应答的对该疫苗编码的表位的CD8+免疫应答。
用E7-HSP70融合DNA接种不产生E7-特异性抗体最后接种之后2周通过直接酶联免疫吸附测试(ELISA)测定接种的小鼠的血清中抗-HPV 16E7抗体的量。所有的接种小鼠组的小鼠血清中没有测定到抗-E7抗体(Fig.3)。使用商售抗-E7单克隆抗体(Zymed，San Francisco，CA)和来自用包含Sig/E7/LAMP-1嵌合体的疫苗接种的血清作为阳性对照来保证抗-E7 ELISA成功地用于该项研究。该结果与完全不存在E7 DNA或E7-HSP70 DNA疫苗的明显的E7特异性CD4刺激相符合。
用E7-HSP70融合DNA接种增强抗肿瘤生长的保护作用为了测定用E7-HSP70 DNA构建体接种是否保护小鼠抗E7-表达肿瘤，使用不同剂量的DNA疫苗进行两次体内肿瘤保护实验。关于第一次实验，通过基因枪用2微克裸DNA/小鼠对小鼠接种并且在一周之后用相同剂量加强。关于第二次实验，通过基因枪用2微克裸DNA/小鼠对小鼠接种，没有进一步加强免疫。最后接种之后天用5×104TC-1/小鼠在右腿皮下对小鼠攻击。对于接受加强接种的小鼠，接受E7-HSP70 DNA接种的那些小鼠100％在TC-1攻击之后60天没有肿瘤，而只有40％接受E7DNA(不存在HSP-编码DNA)接种的小鼠没有肿瘤。相反，肿瘤攻击之后15天之内，所有的没有接种的小鼠和接受空白质粒或HSP DNA的小鼠出现肿瘤生长(图4A)。关于接受一次接种没有加强的小鼠，100％的接受E7-HSP70 DNA接种的小鼠在TC-1攻击之后60天保持没有肿瘤，而所有的没有接种的小鼠和接受空白质粒，HSP70 DNA或E7 DNA的小鼠在肿瘤攻击之后15天内发生肿瘤生长(图4B)。
为了测定E7-HSP70 DNA产生的抗肿瘤作用是否持久，用5×104TC-1/小鼠在左腿皮下对没有肿瘤的动物再次攻击。在肿瘤攻击之后多达30天没有发现肿瘤生长(图4A-B)。总之，这些结果表明与编码HSP多肽DNA可操作地连接的编码I类MHC限制性抗原表位的DNA构建体，例如，E7-HSP70融合DNA，显著增强抗表达I类限制性表位的肿瘤，例如TC-1肿瘤的生长的抗肿瘤免疫性。即使当在更严格条件下(没有施用加强疫苗)试验时也发现有抗肿瘤作用。E7-HSP70 DNA构建体产生的抗肿瘤免疫性是持久的。
用E7-HSP70融合DNA治疗性接种治愈发生的E7-表达肿瘤小鼠为了试验DNA疫苗在根除确诊的TC-1肿瘤中的效力，使用不同剂量的DNA疫苗进行体内肿瘤治疗实验。首先以2×104细胞/小鼠的剂量将TC-1细胞皮下注入右腿。三天之后，通过基因枪皮内用2微克的对照质粒DNA，HSP70 DNA，野生型E7DNA，或E7-HSP70 DNA治疗每一只小鼠。关于第一次实验，引发之后7天，用相同疫苗剂量对小鼠加强免疫。关于第二次实验，接触抗原之后没有对小鼠进一步加强免疫。如图5A所示，对于接受加强的DNA接种的小鼠，80％的接受E7-HSP70DNA接种的小鼠消除了TC-1肿瘤，而100％没有接种的小鼠和接受空白质粒，HSP DNA或E7 DNA的小鼠在肿瘤攻击之后20天内出现肿瘤生长。关于接受一次接种没有加强的小鼠，60％的接受E7-HSP70 DNA接种的小鼠在TC-1攻击之后70天保持没有肿瘤，而所有的没有接种的小鼠和接受空白质粒，HSP70 DNA或E7 DNA的小鼠在肿瘤攻击之后20天内发生肿瘤生长(图5B)。总之，这些结果表明用野生型E7 DNA接种(不存在编码HSP多肽的DNA)不能消除小鼠预先接种的E7-表达肿瘤，而用与编码HSP多肽的DNA可操作地连接的编码E7的DNA，例如，E7-HSP70 DNA，根除了已发生的E7-表达肿瘤。这些数据表明E7-HSP70DNA显著增强抗肿瘤免疫性，而与常规DNA疫苗(即没有编码HSP多肽的DNA)产生的免疫性水平相比，DNA疫苗构建体中编码HSP多肽的DNA的存在增强了该DNA疫苗产生的抗肿瘤免疫性。
产生抗肿瘤免疫性要求编码抗原性表位的DNA与HSP70-编码序列融合为了测定抗肿瘤免疫性是否要求E7与HSP70的融合，将E7-HSP70DNA与混合有HSP70 DNA的E7-DNA相比较，并且测定产生抗肿瘤免疫性的能力。为了保证对相同的细胞送递E7 DNA和HSP70 DNA，在弹丸制备之前将E7 DNA与HSP70 DNA混合。因此，一粒弹丸会含有E7 DNA和HSP70 DNA。如上所述进行免疫学测试和肿瘤保护实验(没有加强接种)。数据表明只有E7-HSP70 DNA增强E7-特异性CD8+T细胞介导的免疫应答。HSP70 DNA与E7 DNA混合不增强CD8+T细胞介导的免疫应答。关于肿瘤保护实验，所有的接种E7-HSP70 DNA的小鼠在肿瘤攻击之后60天保持没有肿瘤。相反，所有的没有接种或者接种与HSP70 DNA混合的E7 DNA的小鼠在肿瘤攻击之后15天之内发生肿瘤生长(图6)。E7 DNA与HSP70 DNA的融合对于产生抗肿瘤免疫性是必需的。这些结果表明编码I类MHC限制性抗原表位的DNA必须与编码APC-结合表位的DNA和/或编码胞质转运多肽的DNA可操作地连接。
是CD8+T细胞而不是CD4+T细胞或者NK细胞对于由具有与HSP70融合的E7的DNA疫苗产生的抗肿瘤作用是必需的为了测定对排斥E7-阳性肿瘤细胞是重要的淋巴细胞亚型，进行体内抗体耗竭实验。抗体耗竭在肿瘤攻击之前一周开始并且在肿瘤攻击之后第40天终止。如图7所示，所有的原初小鼠和所有的耗竭CD8+T细胞的小鼠在肿瘤攻击之后14天内长出肿瘤。相反，所有的没有耗竭的小鼠和所有的耗竭CD4+T细胞或者NK1.1细胞的小鼠在肿瘤攻击之后50天保持没有肿瘤。这些结果表明DNA疫苗以CD4-非依赖方式激活CD8+T细胞，并且这些CD8+T细胞对于E7-HSP70 DNA疫苗产生的抗肿瘤免疫性是必需的。
HSP在刺激CD8+T细胞中的作用尽管本发明不受任何特殊机理的限制，本发明的嵌合核酸和DNA疫苗的HSP70结构域可以作为抗原的“陪伴分子”而起作用，例如，其可以是陪伴分子以便移动抗原多肽到合适的细胞类型来优化CD8+T细胞的诱导作用。弹道DNA递送直接印入DNA到皮肤前体。E7-HSP70 DNA-转染的树状细胞(DCs)表达HSP70。HSP70是胞质HSP，其在蛋白质折叠，运送和降解中起者多种作用。其涉及I类MHC限制性抗原处理。因此，DNA疫苗编码的HSP融合产物可以更有效地靶向蛋白酶体处理。
CD8+T细胞可以是基因枪-介导的E7-HPS70 DNA接种中的关键成员。这里描述的数据表明CD8+T细胞在抗肿瘤免疫性的效应子期中需要。相反，耗竭CD4+或者NK1.1+细胞不降低E7-HSP70 DNA产生的抗肿瘤免疫性。该发现与使用蛋白质-基础的HSP疫苗的方法的结果相反，后者证明在使用来自肿瘤细胞的gp96制剂的抗肿瘤免疫性的效应子期中需要CD4+和CD8+T细胞和NK细胞。
将HSP-相关的肽导入MHC-1抗原呈递途径中涉及专门的APC对HSP复合体的吸收。只有激活的B细胞和单核细胞可以吸收HSP70，而激活的T细胞可以不转运HSP70。尽管受体-介导的HSP吸收对于HSP/肽复合体蛋白质疫苗是重要的，但是其不大可能在基因枪介导的E7-HSP70 DNA疫苗中起作用。DNA疫苗编码的重组E7-HSP70融合基因通过基因枪被直接送给DCs，绕过了对受体介导的胞吞作用的需要。也可以发生APC的交叉引发，因为可能从其它细胞类型例如角质细胞(也可以通过基因枪接种转染)释放E7-HSP70，并且然后通过受体介导的胞吞作用进入DCs。
对E7与HSP70融合的要求提示E7变得更具免疫原性，可能因为HSP70 T细胞表位的加入。用HSP70 DNA接种扩大了个体中可能存在的HSP70-反应性T细胞的集合(由于先前接触病原体)。这些HSP70-反应性T细胞可能产生与偶联的肽反应的强的辅助作用；这可能是这样的机理，即通过ELISPOT测试和通过胞内细胞因子染色在用E7-HSP70融合基因接种的小鼠中观察检测到该机理导致E7-特异性CD8+T细胞前体频率提高，但是在用混合有HSP70质粒的E7质粒接种的小鼠则没有发现。
HSP可以通过不依赖于抗原的机理体内和体外直接激活T细胞。不存在抗原肽的情况下，HSP能够诱导抗原特异性CTL克隆的TNF-α和IFN-γ的分泌。人HSP-60能够作为天然免疫系统的危险信号而起作用，并且能够诱导T辅助1(TH1)促炎症应答。但是，单独接种HSP70DNA或者接种混合有HSP70质粒的E7质粒的小鼠没有观察到E7-特异性CD4+T细胞数目的显著增加。DNA疫苗的HSP成分刺激的γδT细胞也可以参与E7-HSP70 DNA疫苗产生的抗肿瘤作用。
尽管E7-HSP70通过增强的I类MHC呈递产生有效的CD8+T细胞应答，将抗原靶向于II类MHC呈递途径的其它构建体可以提供增强的CD4+T细胞应答。可以共同施用直接增强I类MHC和II类MHC限制性途径的疫苗的给药。例如，其中第二DNA编码用于增强E7的II类MHC呈递途径的LAMP-1内体/溶酶体靶向信号的DNA构建体，例如嵌合Sig/E7/LAMP-1 DNA疫苗能够和本发明的核酸和疫苗共同施用来刺激抗原-特异性CD4+T细胞。这里描述的与II类MHC-靶向疫苗，例如Sig/E7/LAMP-1联合的E7-HSP70疫苗可以以协同方式激活免疫系统的多个臂，导致显著增强的CD4+和CD8+T细胞应答和有效的抗肿瘤作用。
这些结果证明呈弹道施用的DNA疫苗的形式的本发明举例的嵌合核酸(编码HSP70和HPV-16 E7融合蛋白的DNA融合构建体)能够产生比单独的编码抗原E7的DNA疫苗更强的E7-特异性CD8+T细胞-介导的免疫应答和抗HPV-16 E7-表达鼠肿瘤的抗肿瘤作用。因此，这些结果证明HSP70序列(和，如这里所述的，羧基-末端HSP结构域的融合体)与抗原基因(或者其片段)的融合大大提高了DNA疫苗的效价。该策略被用来预防和治疗疾病，例如，传染性疾病，和肿瘤和癌症体系，特别是带有已知的肿瘤-特异性抗原的那些。
实施例2通过编码GM-CSF的DNA序列和假单孢杆菌外毒素A的转运结构域与抗原基因的连接提高DNA疫苗效价下面的实施例描述了本发明的成分和方法有效用于体内增强抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和治疗肿瘤的研究。
构建了编码免疫原“融合蛋白”成分的嵌合核酸，其中编码GM-CSF(或者其片段)的DNA(可操作地连接)于抗原-编码序列的结构域。尽管本发明不受任何特殊机理的限制，得到的融合蛋白可以已经增强了其中包含的抗原对表达GM-CSF受体，例如专门的APC及其前体的靶向性。编码ETA多肽的DNA的存在，例如假单孢杆菌外毒素A 的II结构域(ETA(dII)(SEQ ID NO3)的存在，可以介导抗原自内体/溶酶体区室到胞质中的转运来增强I类MHC呈递。
通过将编码GM-CSF和ETA(dII)的DNA序列与模型抗原E7的基因融合来制备DNA嵌合体(GM-ETA(dII)-E7)。使用本领域公认的人癌症的小鼠模型来评价该构建体激发的免疫原性和抗肿瘤活性。通过肌内或皮内注射使用GM-ETA(dII)-E7嵌合体DNA疫苗对小鼠免疫增强E7-特异性CD8+和CD4+T细胞免疫应答和抗E7-表达鼠肿瘤细胞系(TC-1)的有效抗肿瘤保护和治疗。在编码其它构建体，特别是GM-E7，ETA(dII)-E7，或GM-ETA(dII)的DNA疫苗中没有发现这种显著的抗肿瘤作用。这里描述的DNA接种策略用于针对癌症和病原体微生物的感染的抗原特异性免疫治疗。
改进外源抗原的I类MHC呈递作用是提高DNA疫苗效价的策略，这一点可以用假单孢杆菌外毒素A的H结构域(ETA(dII))检验ETA是阻断蛋白质合成的来自铜绿假单孢杆菌属(Pseudomonasaeruginosa)细菌的毒素。II结构域，或者ETA(dII)，使得从内体/溶酶体区室转运到胞质，这导致外源抗原I类MHC呈递作用的增强。因为I结构域负责LDL-结合，并且III结构域具有与ADP-核糖基转移酶结合的毒性能力，这些不期望的ETA的部分被替代或者缺失。使用DNA嵌合体(GM-ETA(dII)-E7)产生下述数据。HPV-16 E7被用作模型抗原，因为其是HPV-相关恶性肿瘤中广泛表达和充分表征的临床相关致癌基因蛋白质。GM-CSF DNA可以插入到各种APC中，诱导树状细胞(DC)成熟的增强。通过与抗原连接，GM-CSF也可以增强抗原对表达GM-CSF受体(GM-CSF-R)，例如专门的APCs和它们的前体的靶向性。以DNA形式连接抗原的ETA(dII)也可以将抗原从内体/溶酶体区室转运到胞质，导致I类MHC增强的呈递作用。用根据GM-ETA(dII)-E7实施例涉及的嵌合DNA构建体接种提供激活I类和II类MHC限制途径所需的效力，导致增强的E7-特异性免疫应答和抗肿瘤作用。
使用下面的材料和方法产生下述数据。
DNA构建体和制备使用5′端引物，5′-GGGGAGATCTGGATGTGGCTGCAGAATTTA-3′(SEQ ID NO11)和3′端引物(EcoRI)，5′-GGGAGAATTCTTTTGGACTGGTTTTTTGCAT-3′(SEQ ID NO12)通过PCR获得编码鼠GM CSF的DNA片段。使用从GM-CSF-转导的B-16黑素瘤细胞产生的cDNA作为PCR的模板。
表5鼠GM-CSF的氨基酸序列MWLQNLLFLGIVVYSLSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPVQK(SEQ ID NO1)；(SEQ ID NO1)；GENBANK登记号No.X02333。
表6鼠GM-CSF的cDNA序列gagctcagca agcgctctcc cccaattccc ttagccaaag tggacgccac cgaacagaca 61gacctaggct aagaggtttg atgtctctgg ctacccgact ttgaaaattt tccgcaaagg 121aaggcctttt gactacaatggcccacgaga gaaaggctaa ggtcctgagg aggatgtggc 181tgcagaattt acttttcctg ggcattgtgg tctacagcct ctcagcaccc acccgctcac 241ccatcactgt cacccggcct tggaagcatg tagaggccat caaagaagcc ctgaacctcc 301tggatgacat gcctgtcaca ttgaatgaag aggtagaagt cgtctctaac gagttctcct 361tcaagaagct aacatgtgtg cagacccgcc tgaagatatt cgagcagggt ctacggggca 421atttcaccaa actcaagggc gccttgaaca tgacagccag ctactaccag acatactgcc 481ccccaactcc ggaaacggac tgtgaaacac aagttaccac ctatgcggat ttcatagaca 541gccttaaaac ctttctgact gatatcccct ttgaatgcaa aaaaccagtc caaaaatgag 601gaagcccagg ccagctctga atccagcttc tcagactgct gcttttgtgc ctgcgtaatg 661agccaggaac tcggaatttc tgccttaaag ggaccaagag atgtggcaca gccacagttg 721
gagggcagta tagccctctg aaacgctga ctcagcttgg acagcggcaa gacaaacgag 781agatattttc tactgatagg gaccattata tttatttata tatttatatt ttttaaatat 841ttatttattt atttatttaa ttttgcaact ctatttattg agaatgtctt accagataat 901aaattattaa aacttt (SEQ ID NO2)；(SEQ ID NO2)；GENBANK登记号No.X05906；＂atg＂起始位点下有下划线。
接着将扩增的产物亚克隆到pSP73载体(Promega)的BgIII和EcoRI位点产生pSP73-GM。利用相同的策略使用人GM-CSF序列(GENBANK登记号M11220)制备DNA构建体。或者，第一DNA编码Flt-3配体(FL)，CTLA-4，4-1BB，CD40配体，或者TNF受体的全部或者APC-结合片段。本领域技术人员容易获得这些蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列。测定给定的多肽或蛋白质片段是否结合抗原呈递细胞(APC)(例如巨噬细胞或DC)也是本领域公知的。例如，用可检测标记物标记多肽(以及已知不结合APC的对照多肽)并且与APC温育。洗涤细胞之后，APC之上或之中标记物的检测(与对照物相比较)表明该多肽具有APC结合结构域或序列。
用5′端引物，5′-GGGAGAATTCTCGCCTGTCACTTTCCCGAG-3′(SEQ ID NO13)和3′端引物，5□-GGAAGGATCCAGTTCTGCGTGCCGCGGG-3’(SEQ ID NO14)应用PCR产生包含ETA的II结构域的DNA片段。
表7ETA的氨基酸序列MHLIPHWIPLVASLGLLAGGSSASAAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQTQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANADVVSLTCPVAAGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLK(SEQ ID NO3)；GENBANK登记号No.K01397 M23348；残基1-25＝信号肽；成熟肽起点下划线＂A＂；转运结构域跨越残基247-417。
表8编码ETA的cDNActgcagctgg tcaggccgtt tccgcaacgc ttgaagtcct ggccgatata ccggcagggc 61cagccatcgt tcgacgaata aagccacctc agccatgatg ccctttccat ccccagcgga 121accccgacat ggacgccaaa gccctgctcc tcggcagcct ctgcctggcc gccccattcg 181ccgacgcggc gacgctcgac aatgctctct ccgcctgcct cgccgcccgg ctcggtgcac 241cgcacacggc ggagggccag ttgcacctgc cactcaccct tgaggcccgg cgctccaccg 301gcgaatgcgg ctgtacctcg gcgctggtgc gatatcggct gctggccagg ggcgccagcg 361ccgacagcct cgtgcttcaa gagggctgct cgatagtcgc caggacacgc cgcgcacgct 421gaccctggcg gcggacgccg gcttggcgag cggccgcgaa ctggtcgtca ccctgggttg 481tcaggcgcct gactgacagg ccgggctgcc accaccaggc cgagatggac gccctgcatg 541tatcctccga tcggcaagcc tcccgttcgc acattcacca ctctgcaatc cagttcataa 601atcccataaa agccctcttc cgctccccgc cagcctcccc gcatcccgca ccctagacgc 661cccgccgctc tccgccggct cgcccgacaa gaaaaaccaa ccgctcgatc agcctcatcc 721ttcacccatc acaggagcca tcgcgatgca cctgataccc cattggatcc ccctggtcgc 781cagcctcggc ctgctcgccg gcggctcgtc cgcgtccgcc gccgaggaag ccttcgacct 841ctggaacgaa tgcgccaaag cctgcgtgct cgacctcaag gacggcgtgc gttccagccg 901catgagcgtc gacccggcca tcgccgacac caacggccag ggcgtgctgc actactccat 961ggtcctggag ggcggcaacg acgcgctcaa gctggccatc gacaacgccc tcagcatcac 1021
agcgacggc ctgaccatcc gcctcgaagg cggcgtcgag ccgaacaagc cggtgcgcta 1081cagctacacg cgccaggcgc gcggcagttg gtcgctgaac tggctggtac cgatcggcca 1141gagaagccc tcgaacatca aggtgttcat ccacgaactg aacgccggca accagctcag 1201ccacatgtcg ccgatctaca ccatcgagatgggcgacgag ttgctggcga agctggcgcg 1261cgatgccacc ttcttcgtca gggcgcacga gagcaacgag atgcagccga cgctcgccat 1321cagccatgcc ggggtcagcg tggtcatggc ccagacccag ccgcgccggg aaaagcgctg 1381agcgaatgg gccagcggca aggtgttgtg cctgctcgac ccgctggacg gggtctacaa 1441ctacctcgcc cagcaacgct gcaacctcga cgatacctgg gaaggcaaga tctaccgggt 1501gctcgccggc aacccggcga agcatgacct ggacatcaaa cccacggtca tcagtcatcg 1561cctgcacttt cccgagggcg gcagcctggc cgcgctgacc gcgcaccagg cttgccacct 1621gccgctggag actttcaccc gtcatcgcca gccgcgcggc tgggaacaac tggagcagtg 1681cggctatccg gtgcagcggc tggtcgccct ctacctggcg gcgcggctgt cgtggaacca 1741ggtcgaccag gtgatccgca acgccctggc cagccccggc agcggcggcg acctgggcga 1801gcgatccgc gagcagccgg agcaggcccg tctggccctg accctggccg ccgccgagag 1861cgagcgcttc gtccggcagg gcaccggcaa cgacgaggcc ggcgcggcca acgccgacgt 1921gtgagcctg acctgcccgg tcgccgccgg tgaatgcgcg ggcccggcgg acagcggcga 1981cgccctgctg gagcgcaact atcccactgg cgcggagttc ctcggcgacg gcggcgacgt 2041cagcttcagc acccgcggca cgcagaactg gacggtggag cggctgctcc aggcgcaccg 2101caactggag gagcgcggct atgtgttcgt cggctaccac ggcaccttcc tcgaagcggc 2161gcaaagcatc gtcttcggcg gggtgcgcgc gcgcagccag gacctcgacg cgatctggcg 2221cggtttctat atcgccggcg atccggcgct ggcctacggctacgcccagg accaggaacc 2281cgacgcacgc ggccggatcc gcaacggtgc cctgctgcgg gtctatgtgc cgcgctcgag 2341ctgccgggc ttctaccgca ccagcctgac cctggccgcg ccggaggcgg cgggcgaggt 2401cgaacggctg atcggccatc cgctgccgct gcgcctggac gccatcaccg gccccgagga 2461gaaggcggg cgcctggaga ccattctcgg ctggccgctg gccgagcgca ccgtggtgat 2521tccctcggcg atccccaccg acccgcgcaa cgtcggcggc gacctcgacc cgtccagcat 2581cccgacaag gaacaggcga tcagcgccct gccggactac gccagccagc ccggcaaacc 2641gccgcgcgag gacctgaagt aactgccgcg accggccggc tcccttcgca ggagccggcc 2701tctcggggc ctggccatac atcaggtttt cctgatgcca gcccaatcga atatgaattc(SEQ ID NO4)；GENBANK登记号No.K01397 M23348。
接着将扩增产物亚克隆到pSP73-GM的EcoRI和BamHI位点产生pSP73-GM-ETA(dII)。用5′端引物，5′-GGGAGGATCCTCATGCATGGAGATACACCT-3′(SEQ ID NO15)和3′端引物，5′-GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG-3′(SEQ ID NO16)通过PCR合成包含HPV-16 E7的DNA片段。使用质粒pCMVneoBamHI-E7作为PCR反应的模板。将扩增的产物进一步克隆到pSP73-GM-ETA(dII)的BamHI和HindIII位点产生pSP73-GM-ETA(dII)-E7。通过DNA测序证实GM-ETA(dII)-E7的序列。通过BglII和HindII限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7获得pcDNA3.1-GM-ETA(dII)-E7并且将分离的GM-ETA(dII)-E7片段克隆到巨细胞病毒启动子下游pcDNA3.1(-)表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)的独特的BamHI和HindIII克隆位点。通过BglII和BamHI限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7产生pcDNA3.1-GM-ETA(dII)并且将分离的GM-ETA(dII)片段克隆到pcDNA3.1(-)的独特BamHI克隆位点。通过用EcoRI和HindIII限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7获得pcDNA3.1-ETA(dII)-E7并且将分离的ETA(dII)-E7片段克隆到pcDNA3.1(-)的独特EcoRI和HindIII克隆位点。通过BglII和BamHI限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7产生pcDNA3.1-GM并且将分离的GM-CSF片段克隆到pcDNA3.1(-)的独特BamHI克隆位点。通过用EcoRI和BamHI限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7获得pcDNA3.1-ETA(dII)并且将分离的ETA(dII)片段克隆到pcDNA3.1(-)的独特EcoRI和BamHI克隆位点。通过用BamHI和HindIII限制酶消化pSP73-GM-ETA(dII)-E7获得pcDNA3.1-E7并且将分离的E7片段克隆到pcDNA3.1(-)的独特BamHI和HindIII克隆位点。为了产生pcDNA3.1-GM-E7，使用5′端引物，5′-CCCAGATCTAATCATGCATG-3′(SEQ ID NO17)和3′端引物，5′-GGGGAAGCTTATCCTGAGAACAGATGGGG-3′
(SEQ ID NO18)通过PCR合成合成E7片段。用BglII和HindIII消化扩增的E7产物并且进一步克隆到pSP73-GM的BamHI和HindIII位点。通过BglII和HindIII消化，从pSP73-GM-E7分离GM-E7片段并且克隆到pcDNA3.1(-)的BamHI和HindII位点。
通过DNA测序证明这些构建体的精确性。将携带GM，ETA(dII)，E7，GM-ETA(dII)，ETA(DII)-E7，GM-E7或GM-ETA(DII)-E7基因插入物的质粒DNA和＂空白＂质粒载体转染到亚克隆有效DH5(TM细胞(LifeTechnologies，USA)中。然后扩增DNA并且用双CsCl纯化(BioServeBiotechnologies，Laurel，Maryland)。在各个制备中利用1％琼脂糖凝胶电泳检查质粒DNA的整合性和不存在大肠埃希氏杆菌DNA或RNA。通过在260nm下测定光密度测定DNA浓度。通过限制酶消化和凝胶电泳证实插入的E7片段的存在。
DNA接种使用氦-驱动基因枪(Bio-Rad，Hercules，CA)，根据标准方法并且如上所述进行基因枪颗粒-介导的DNA接种。
胞质内细胞因子染色和流式细胞仪分析来自原初的或者接种组小鼠的脾细胞或者与包含I类MHC表位的E7肽(残基49-57；SEQ ID NO5)或者与包含II类MHC肽的E7肽(残基30-67；SEQ ID NO6)一起温育。以2微克/毫升的浓度加入E7肽20小时。为了检测E7-特异性CD8+T细胞前体和E7-特异性CD4+T辅助细胞应答，分别使用CD8+CTL表位残基49-57和残基30-67。在从培养物中收集细胞之前6小时加入Golgistop(Pharmigen，San Diego，CA)。然后细胞在FACSCAN缓冲液中洗涤一次并且用藻红蛋白(PE)-缀合的单克隆大鼠抗-小鼠CD8或CD4抗体(Pharmingen，San Diego，CA)染色。使用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)试剂盒根据厂商说明对细胞进行胞内细胞因子染色。FITC-缀合的抗-IFN-γ或者抗-IL-4抗体和免疫球蛋白同种型对照抗体(大鼠IgG1)都购自Pharmingen。在Becton-DickensonFACScan上使用CELLQuest软件(Becton Dickson ImmunocytometrySystem，Mountain View，CA)进行分析。
小鼠和鼠肿瘤细胞
上面实施例1描述了小鼠和肿瘤细胞例如TC-1细胞的制备和保持。
体内肿瘤保护关于肿瘤保护实验，通过基因枪用2微克的携带GM，ETA(dII)，E7，GM-ETA(dII)，ETA(DII)-E7，GM-E7或GM-ETA(DII)-E7基因插入物的质粒DNA和空白质粒载体对小鼠接种(每组5只)。一周之后，用和第一次接种相同的给药法对小鼠加强免疫。另一组小鼠(每组5只)接种一次(没有进一步加强)。最后接种之后一周，用5×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞对小鼠右腿皮下攻击，并且每周两次监测。
体内抗体耗竭体内抗体耗竭的方法如上所述。简要地说，通过基因枪用2微克的MG-ETADII-E7 DNA接种C57BL/6小鼠，一周之后加强免疫，并且用5×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞攻击。抗体耗竭在肿瘤攻击之前一周就开始了。对于CD4耗竭，使用MAb GK1.5；对于CD8耗竭，使用MAb 2.43，对于NK1.1耗竭，使用MAb PK136。流式细胞仪分析表明耗竭了95％以上的合适的淋巴细胞亚群，而其它亚群的水平正常。肿瘤攻击之后第40天耗竭终止。
GM-ETA(dII)-E7融合DNA疫苗的产生和表征图8中证明GM-ETA(dII)-E7，GM-ETA(dII)，ETA(dII)-E7，GM-E7，GM-CSF，ETA(dII)和E7的构建体的示意图。
用GM-ETA(dII)-E7融合DNA接种增强E7-特异性CD8+T细胞介导的免疫应答CD8+T淋巴细胞是抗肿瘤效应子中最重要的成分。为了测定GM-ETA(dII)-E7DNA疫苗产生的E7-特异性CD8+T细胞前体频率，利用胞内细胞因子染色。利用对CD8和胞内IFN-γ双染色通过流式细胞仪分析定量测定E7(49-57)-特异性CD8+T细胞前体。从该项测试得到的值与ELISPOT结果密切相关。如图9所示，通过流式细胞仪分析得知用GM-ETA(dII)-E7DNA接种的小鼠产生最大数值的E7-特异性IFN-γ+CD8+T细胞前体，而用E7，GM-CSF，ETA(dII)，GM-ETA(dII)，GM-E7或ETA-E7DNA接种的小鼠没有给出高于载体接种的对照物的信号。
用GM-ETA(dII)-E7融合DNA接种也增强E7-特异性CD4+T细胞介导的免疫应答为了测定GM-ETA(dII)-E7 DNA疫苗产生的E7-特异性CD4+T前体细胞和细胞因子分布，对来自免疫小鼠的脾细胞上的CD4表面标记物和胞内IFN-γ进行双染色，接着进行流式细胞仪分析。体外将来自免疫小鼠的脾细胞与E7肽(残基30-67；SEQ ID NO7)一起培养过夜并且对CD4和胞内IFN-γ染色。E7肽(残基30-67；SEQ ID NO7)在HPV-16的E7可读框蛋白质中包含主要T辅助表位。测定蛋白质或肽的多肽序列内T辅助细胞表位的方法是本领域公知的。
利用流式细胞仪分析IFN-γ分泌CD4+T细胞百分比。如图10所示，与用E7 DNA，GM-CSF，ETA(dII)，GM-ETA(dII)，ETA-E7 DNA或单独载体接种的小鼠相比，用GM-ETA(dII)-E7 DNA接种的小鼠产生更大数量的CD4+IFN-γ+双阳性细胞。用GM-ETA(dII)-E7 DNA接种的小鼠产生类似水平的E7-特异性CD4+IFN-γ+双阳性细胞。这些结果证明在接种的小鼠中GM-CSF在增强IFN-γ分泌E7-特异性CD4+T细胞中起着重要作用。这些结果还证明包含与编码靶抗原的DNA可操作地连接的GM-CSF-编码序列的DNA疫苗比只包含抗原-编码序列的那些更有效。
用GM-ETA(dII)-E7融合DNA接种增强小鼠抗TC-1肿瘤生长的保护作用为了测定用GM-ETA(dII)-E7 DNA构建体接种是否保护小鼠抗E7-表达肿瘤，使用各种DNA疫苗进行体内肿瘤保护实验。通过基因枪用2微克裸DNA/小鼠对小鼠接种并且在一周之后用相同剂量加强。最后接种之后7天用5×104TC-1/小鼠在右腿皮下对小鼠攻击。接受GM-ETA(dII)-E7 DNA接种的那些小鼠100％在TC-1攻击之后30天保持没有肿瘤，而所有的没有接种的小鼠和接受E7 GM-CSF，ETA(dII)，GM-ETA(dII)，GM-E7，ETA-E7 DNA或空白质粒的小鼠在肿瘤攻击之后15天内发生肿瘤生长(图11)。为了测定GM-ETA(dII)-E7DNA产生的抗肿瘤作用是否持久，用5×104TC-1/小鼠在左腿皮下对没有肿瘤的动物再次攻击。在肿瘤攻击之后达30天没有发现肿瘤生长。这些结果表明GM-ETA(dII)-E7融合DNA显著增强抗TC-1肿瘤的生长的抗肿瘤免疫性，并且GM-ETA(dII)-E7DNA产生的抗肿瘤免疫性是持久的。
CD8+T细胞对于GM-ETA(dII)-E7DNA疫苗产生的抗肿瘤作用是必需的为了测定对排斥E7-阳性肿瘤细胞是重要的淋巴细胞亚型，进行体内抗体耗竭实验。抗体耗竭在肿瘤攻击之前一周开始并且在肿瘤攻击之后图12所示的天数终止。如图12所示，所有的原初状态小鼠和所有的耗竭CD8+T细胞的小鼠在肿瘤攻击之后14天内长出肿瘤。相反，所有的没有耗竭的小鼠和所有的耗竭CD4+T细胞或者NK1.1细胞的小鼠在肿瘤攻击之后数天保持没有肿瘤。这些结果表明CD8+T细胞对于GM-ETA(dII)-E7DNA疫苗产生的抗肿瘤免疫性是必需的。
这里描述的数据证明编码携带APC-结合结构域，胞质转运结构域和抗原性表位的本发明的嵌合核酸，DNA构建体，诱导对编码的抗原性表位特异性的有效免疫应答。结果表明，在小鼠肿瘤中，嵌合体中GM-CSF(GM)基因，ETA(dII)基因，和HPV-16 E7基因的融合产生增强的E7-特异性CD8+和CD4+T细胞-介导的免疫应答和抗HPV-16 E7-表达鼠肿瘤的抗肿瘤作用。
通过肌内或皮内注射使用GM-ETA(dII)-E7嵌合体对小鼠接种能介导E7-特异性免疫应答和抗E7-表达鼠肿瘤细胞系(TC-1)的有效抗肿瘤保护作用和治疗。而在编码其它构建体，特别是GM-E7，ETA(dII)-E7，或GM-ETA(dII)DNA疫苗中没有发现这种显著的抗肿瘤作用。此外，与接受其它构建体的小鼠相比，对接受GM-ETA(dII)-E7的小鼠发现更大的CD8+和CD4+T细胞应答，这些结果表明GM-ETA(dII)-E7嵌合DNA代表对于选择的抗原，例如癌症免疫治疗中的癌抗原，或者，抗病原体的抗原的增强细胞介导的应答的新的策略，用于治疗或预防与那种病原体相关的病症。结果还证明该疫苗的成分在产生有效的E7-特异性免疫应答和抗肿瘤作用中是重要的。
结果表明GM-CSF基因是GM-ETA(dII)-E7融合蛋白中的重要成分，这一点由GM-ETA(dII)-E7和ETA(dII)-E7 DNA构建体的比较证明。ETA(dII)-E7构建体没有GM-ETA(dII)-E7的GM-CSF成分，这可以导致没有增强的E7-特异性CD8+或CD4+T细胞介导的免疫应答和抗肿瘤作用。
GM-CSF诱导粒细胞和APC的产生并且作为树状细胞(DCs)的免疫刺激信号起作用。此外，GM-CSF靶向专门的APCs并且促进它们的分化，因为APCs具有GM-CSF受体。尽管本发明不局限于任何特殊机理，GM-ETA(dII)-E7融合蛋白由于存在GM-CSF结构域而可以诱导MHC和DCs和其它APCs上的共同刺激分子表达中的变化，导致在ETA(dII)-E7中没有发现的增强的体液和细胞介导的免疫应答。这些发现表明树状细胞上GM-CSF结构域的免疫增强作用是GM-ETA(dII)-E7融合蛋白产生免疫应答和抗肿瘤作用的关键成分。
尽管本发明不局限于任何特殊机理，本发明的抗原-特异性免疫治疗方法可以靶向DC的表面分子，其使得抗原直接进入DC进行加工和呈递。可以用作免疫原成分的APC-结合组分的其它多肽包括Flt-3配体(FL)，CD40配体，TNFα，和41BB。编码这样的多肽的DNA被用作本发明的免疫原成分或DNA疫苗的第一DNA组分。Flt3配体(Flt3-1或FL)可以体内增强树状细胞的功能和量。Flt3(fms-样酪氨酸激酶3)是本领域公知的鼠酪氨酸激酶受体，并且Flt3已经被用来鉴定和接着克隆相应的配体，Flt3-L(Hannum等，1994，自然(Nature).368643-648；Maraskovsky等，实验药物杂志(J.of Experimental Med.)，(1996)1841953-1962；199638)。CD40配体(CD154)也是有用的；它可以由于其对DC上的作用而提高疫苗效价。TNF-α代表提高疫苗效价的另一种策略；TNF-α可以促进DC迁移到淋巴样组织并且分化并且发育朗氏细胞。提高疫苗效价的另一种策略是使用4-1BBL，结合4-1BB(CD137)的肿瘤坏死因子家族的细胞因子。DC上4-1BBL表达之后与4-1BB相互作用提供了引发增殖的T细胞的第二共同刺激信号，其独立于通过CD28受体的信号传导。这些提高疫苗效价的策略以类似于GM-ETA(dII)-E7中GM-CSF的方式使用DC表面分子，使得抗原靶向DC并且接着诱导DC分化并且增强抗原加工和呈递。
白喉，梭状芽孢杆菌属，Botulinum(tetanus)，芽孢杆菌属，耶尔森氏菌属，霍乱弧菌(霍乱)，或者百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)毒素代表可以具有治疗应用的来自细菌的分子。这样的分子可以以类似于本发明DNA疫苗编码的融合多肽中ETA结构域的方式发挥功能。这些结构域可以引起通过抗原从内体/溶酶体区室转运到胞质的转运作用增强I类MHC呈递作用(特别是如果编码该毒素的基因的毒性结构域被突变或缺失的话)。
下面测定一种给定的多肽或蛋白质片段是否具有胞质转运活性，并且因此在本发明的范围内作为本发明融合蛋白中的一个结构域。炭疽毒素致死因子(LF)已经被证明将外来蛋白质转运到真核生物细胞的胞质溶胶中，类似白喉毒素的机理。耶尔森氏菌属(Yersiniae)细胞毒素YopE和YopH用作转运结构域并且用于抗原跨越宿主细胞膜进入巨噬细胞胞质溶胶中的内在化作用。百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)腺苷酸毒素(CyaA)通过细胞膜直接转运到胞质中，因此增强I类MHC抗原操作。因此，本发明的融合蛋白和疫苗(例如，GM-ETA(dII)-E7融合蛋白中ETA(dII)结构域)利用的疫苗效价增强策略可能类似于这些细菌毒素的转运结构域的生物机理。这些结构域可以使抗原从内体/溶酶体区室逃脱到胞质溶胶中，导致I类MHC呈递作用的增强。
实施例3通过连接编码假单孢杆菌属外毒素A的转运结构域的DNA到抗原基因对DNA疫苗效价的增强下面的实施例描述证明本发明的成分和方法对于体内增强抗原-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和治疗肿瘤是有效的这样的研究。
本发明不受任何特殊机理的限制，编码包括ETA结构域和HPV-16E7抗原的融合蛋白的DNA疫苗可以导致与没有编码ETA的序列的疫苗相比，E7分布给更大数目的抗原呈递细胞(APCs)，特别是对于通过基因枪皮内施用的核酸。多肽结构域ETA(dII)可以释放蛋白质给其它细胞吸收。
免疫测试表明用与ETA(dII)融合的E7接种导致E7-特异性CD8+T细胞前体频率增加30-倍，没有显著的E7-特异性CD4或抗体增强。体外研究表明转染ETA(dII)-E7 DNA的细胞以比转染野生型E7 DNA的细胞更有效的方式通过I类MHC途径呈递E7抗原。此外，ETA融合蛋白脉冲的来自骨髓的树状细胞以比野生型E7蛋白质脉冲的树状细胞更有效的方式通过I类MHC途径呈递E7抗原。令人吃惊地增强CD8+T细胞介导的免疫性导致有效的皮下肿瘤保护和肺转移的治疗。这些数据表明本发明的成分和方法通过增加表达的抗原的扩散而提高抗原特异性DNA疫苗效价。例如，施用编码ETA-抗原融合蛋白或嵌合体的DNA疫苗，可以加强胞内扩散该融合蛋白中表达的抗原(相对编码包括抗原但是缺少ETA结构域的多肽的类似DNA疫苗而言)。
实施例4抗原编码序列与FL(Flt-3配体)序列的连接提高DNA疫苗效价下面的实施例描述证明本发明的成分和方法对于体内增强抗原-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和治疗肿瘤是有效的这样的研究。
Flt-3配体(FL)在专门的抗原呈递细胞，特别是树状细胞的产生中是重要的细胞因子。尽管本发明不受任何特殊机理的限制，其中Flt-3配体结构域连接期望对其有免疫性的抗原的重组分子(包括FL和抗原的融合蛋白)可以使抗原靶向APC，例如树状细胞。
使用HPV-16 E7作为抗原，评价Flt3-配体(FL)-抗原构建体(图19)对裸DNA疫苗产生的抗原特异性免疫性的效力的影响。SEQ ID NO25的残基1-189是FL-衍生的，残基190-287是E7-衍生的(SEQ ID NO25的288位点中的＂Z＂表示一个终止)。通过基因枪皮内施用编码FL-E7融合多肽的DNA构建体。发现相对于在没有FL-编码序列存在下包含野生型E7基因的疫苗来说，包含嵌合FL/E7融合基因的疫苗大大提高E7-特异性CD8+T细胞的频率。
体外研究表明转染FL/E7 DNA的细胞以比转染野生型E7 DNA的细胞更有效的方式通过I类MHC途径呈递E7抗原。此外，FL/E7融合蛋白脉冲的来自骨髓的树状细胞以比野生型E7蛋白质脉冲的树状细胞更有效的方式通过I类MHC途径呈递E7抗原。更重要的是，该融合将效力很小的疫苗转化为具有显著的抗已发生的E7-表达转移肿瘤的效力的疫苗。另人感兴趣的是，FL/E7融合疫苗主要靶向CD8+T细胞并且抗肿瘤作用完全是CD4-独立的。这些数据表明Flt3-配体DNA与抗原-编码序列的融合通过CD8-依赖途径提高DNA疫苗的效价。
实施例5赋予抗原-特异性免疫应答的增强的HSP70的结构域下面的实施例描述证明本发明的嵌合核酸对于体内增强抗原-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和治疗肿瘤是有效的这样的研究，所述本发明嵌合核酸编码包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段的第一多肽结构域的嵌合多肽。
测定结核分枝杆菌HSP70的结构域结构。鉴定了至少三个功能结构域ATP酶结构域(包含SEQ ID NO9的残基1-356)，底物结合结构域(SD；包含SEQ ID NO9的残基357-516)和羧基末端结构域(CD；包含SEQ ID NO9的残基517-625)(图16)。测定了该HSP70的每一个结构域对裸DNA疫苗效价的贡献。编码各结构域的DNA符合读框地连接，即，可操作地连接，于编码乳头瘤病毒抗原E7的DNA。测定了E7-特异性CD8T细胞免疫应答。
利用标准基因枪DNA递送方法皮内用包含下面基因的DNA疫苗对C57BL/6小鼠接种(i)HSP70基因；(ii)野生型HPV-16 E7基因；(iii)与HSP70(E7-ATP)的ATP酶结构域融合的HPV-16 E7基因；(iv)与HSP70(E7-SD)的底物结合结构域(SD)融合的HPV-16 E7基因；或者(v)与HSP70(E7-CD)的胞质结构域(CD)融合的IIPV-16 E7。将所有的嵌合E7/热激蛋白构建体克隆到巨细胞病毒启动子下游pcDNA3.1(-)表达载体的多个克隆位点(图17)。通过胞内细胞因子染色使用E7-特异性I类MHC肽(RAHYNIVTF；SEQ ID NO7的氨基酸49-57)分析体内抗肿瘤免疫应答来评价E7-特异性CD8+T细胞-介导的免疫性。
图18A是说明E7-特异性CD8+T细胞前体频率的代表性FASCAN。来自接种小鼠的脾细胞体外与E7肽(SEQ ID NO7的氨基酸49-57)培养过夜，并且对CD8+表达和胞内IFN-γ染色。利用流式细胞仪分析用各种DNA构建体(E7-HSP70，E7-ATP，E7-SD，E7-CD，或单独的E7)免疫的小鼠的IFN-γ筛选CD8+T细胞前体的数目。用E7-HSP70 DNA接种的小鼠产生最高数目的E7-特异性CD8+前体。E7-CD产生第二高数量的E7-特异性CD8+前体，可与单独的E7-HSP70相比较(并且大于E7-SD，E7-ATP，和野生型E7)。
图18B说明IFN-γ-产生E7-特异性CD8+T细胞的平均数目。通过流式细胞仪测定在存在(实心直方图)和不存在(空心直方图)E7抗原肽(SEQ ID NO7的残基49-57)的存在下细胞的数目。数据表示为CD8+IFN-γ+细胞/3×105脾细胞的平均值+SEM。结果表明当插入到DNA疫苗构建体中时，编码HSP70的胞质结构域的DNA提高该DNA疫苗产生对该疫苗编码的靶抗原的免疫性的效力。此外，胞质结构域负责包含全长HSP70的DNA疫苗中的抗原特异性I类MHC限制性CD8+T细胞免疫增强的大部分。
例如，用融合全长HSP70的E7接种导致E7-特异性CD8+T细胞前体频率提高30-倍(每3×105个脾细胞大约365)(图18A-B)。用融合HSP70的ATP结构域的E7接种导致E7-特异性CD8+T细胞前体频率稍微提高(每3×105个脾细胞大约58)。类似地，用融合HSP70的SD结构域的E7接种产生每3×105个脾细胞大约85个E7-特异性CD8+T细胞前体。相反，用融合HSP70的CD结构域的E7接种产生每3×105个脾细胞大约296个E7-特异性CD8+T细胞前体，这个量类似于用融合到全长HSP70的E7接种的小鼠获得的量。这些结果表明HSP70的CD结构域在DNA疫苗中带来大部分增强的抗原特异性I类MHC限制性CD8+T细胞免疫应答。
这些数据证明编码抗原性肽(例如HPV-16 E7)和全长HSP70或HSP70的CD结构域的融合体的DNA(没有编码HSP70的其它部分的DNA)大大增强了对该抗原的抗原特异性CD8+T细胞免疫应答。在缺少据认为在刺激CTL应答中重要的ATP酶结构域中的更多的N-末端序列(SEQ ID NO9的残基161-370)的构建体中观察到免疫应答的增强。数据表明即使不存在其它HSP序列，包含编码HSP的CD结构域的构建体的DNA疫苗也增强对该DNA疫苗编码的靶抗原的抗原-特异性I类MHC限制性CD8+T细胞免疫应答。
实施例6施用表达本发明的融合蛋白的自主复制RNA病毒增强抗原特异性细胞毒素T淋巴细胞(CTL)应答的产生在一个实施方案中，本发明提供了能够表达本发明的嵌合蛋白的自主复制RNA复制子，该嵌合蛋白是包括包括热激蛋白的第一多肽结构域和包括至少一种抗原肽的第二多肽结构域的蛋白质。下面的实施例描述证明使用本发明的方法，这些构建体对于体内增强抗原-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答是有效的这样的研究。作为模型系统，在新培斯病毒自主复制RNA载体，SINrep5中体内表达包括HPV-16 E7和结核分枝杆菌HSP70的融合蛋白。测定该载体产生的抗原特异性免疫性的效力。这些结果还证明在新培斯病毒自主复制RNA载体中体内表达的包括热激蛋白多肽和抗原肽的融合蛋白对于体内增强抗原-特异性CTL应答是有效的。
这些实验证明包含E7/HSP70融合基因的RNA复制子疫苗在接种的小鼠中产生显著高于包含野生型E7基因的疫苗的E7-特异性T细胞介导的免疫应答。此外，体外研究证明来自E7/HSP70 RNA复制子转染的编程性细胞死亡细胞的E7抗原可以被骨髓衍生的树状细胞吸收，并且通过I类MHC途径比野生型E7 RNA复制子转染的编程性细胞死亡细胞更有效地呈递。更重要的是，HSP70与E7的融合将效力小的疫苗转化为具有显著抗E7-表达肿瘤的效价的疫苗。这种抗肿瘤作用依赖NK细胞和CD8+T细胞。这些结果表明HSP70与抗原基因的结合大大提高了自主复制RNA疫苗的效价。这些结果证明E7和HSP70连接的新培斯RNA疫苗大大提高了E7-特异性CD8+T细胞和NK细胞的扩展作用和活性，完全回避CD4臂并且获得抗E7表达肿瘤的有效抗肿瘤免疫性。
进一步研究了新培斯RNA疫苗促进抗肿瘤作用的机理。发现新培斯E7/HSP70RNA疫苗能够诱导宿主细胞的编程性细胞死亡并且促进树状细胞吞噬这些细胞，大大提高了E7-特异性CD8+T细胞的扩展作用和活性。这种增强的CD8应答导致抗E7-表达肿瘤细胞系的有效抗肿瘤免疫性。
选择HPV-16E7作为疫苗开发的模型疫苗，因为如上文讨论的，HPV，特别是HPV-16，与大多数宫颈癌相关。
质粒DNA构建体和制备根据上文Chen(2000)所述制备载体pcDNA3-HSP70，pcDNA3-E7和pcDNA3-E7/HSP70。例如Bredenbeek(1993)病毒学杂志(J.Virol)676439-6446描述过新培斯病毒RNA复制子载体，SINrep5。通过分别用XbaI和PmeI限制酶酶切pcDNA3-HSP70，pcDNA3-E7和pcDNA3-E7/HSP70通过分离编码结核分枝杆菌HSP70，HPV-16E7和嵌合的E7/HSP70制备载体SINrep5-HSP70，SINrep5-E7和SINrep5-E7/HSP70。使用凝胶分离消化的产物。这些分离的DNA片段进一步克隆到SINrep5载体中的相应的XabI和PmlI位点产生SINrepS-HSP70，SINrep5-E7，和SINrepS-E7/HSP70构建体。DNA测序证明这些构建体的精确性。
体外RNA制备应用Mandl(1998)自然药物(Nature Med)41438-1440描述的方法进行从SINrp5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70和SINrep5产生RNA转录物。使用SpeI将DNA模板线性化用于从SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70和SINrep5合成RNA复制子。体外转录RNA疫苗并且根据vendor′指南使用SP6RNA聚合酶和来自标准体外转录试剂盒(LifeTechnologies，Rockville，MD)的封端类似物封端。合成之后，通过用DNA酶I消化去除DNA。使用变性甲醛琼脂糖凝胶(参见例如，Mandl(1998)上文)对合成的RNA定量测定和分析。将纯化的RNA分为等份用于对动物接种并且用于转染BHK21细胞系。通过利用电穿孔将RNA转染到BHK21细胞中来评价转录物的蛋白质表达。
细胞系从ATCC(Rockville，MD)获得小仓鼠肾细胞(BHK21)并且在补充有5％FBS，10％胰蛋白朊磷酸肉汤，2mM谷氨酰胺和抗生素的Glasgow MEM中培养。细胞保持在37℃湿润的5％CO2大气下并且每2天传代。根据Lin(1996)癌症研究(Cancer Res.)5621-26所述进行TC-1细胞的制备和保持。在肿瘤攻击的这一天，通过受胰蛋白酶作用收获TC-1细胞，用1× Hanks缓冲盐溶液(HBSS)洗涤两次，最后再次悬浮于1× HBSS至设计的用于注射的浓度。
用于SINrep5 RNA疫苗的E7蛋白质表达的ELISA通过间接ELISA方法测定E7蛋白质自SINrep5-E7和SINrep5-E7/HSP70 RNA的表达。使用来自SIN5rep E7或-E7/HSP70转染的BHK21的细胞溶胞产物测定E7蛋白质的量。简要地说，根据Liljestrom(1991)病毒学杂志(J.Virol.)654107-4113所述通过电穿孔分别用4微克的SINrep5，SINrep5-E7，SINrep5-HSP70或SINrep5-E7/HSP70 RNA转录物转染千万个BHK21细胞。电穿孔之后16-20小时收集转染的BHK21细胞。用终体积100微升的各种SINrep5RNA转染的BHK21细胞溶胞产物包被96-微孔板，并且在4℃下培养过夜。用细菌产生的HPV-16 E7蛋白质作为阳性对照。然后用含有20％胎牛血清的PBS封闭孔。向ELISA孔加入稀释的抗-E7Ab(Zymed，San Francisco，CA)，并且在37℃下培养2小时。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤之后，室温下该平板与1/2000稀释度的过氧化物酶-缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Zymed，San Francisco，CA)培养1小时。洗涤该平板，并且用TMB(Pierce，Rockford，IL)促生长，并且用1M H2SO4终止。用标准ELISA读数仪在450nm下对ELISA平板读数。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤之后，室温下该平板与1/2000稀释度的过氧化物酶-缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Zymed，San Francisco，CA)培养1小时。该平板洗涤6次，并且用1-Step Turbo TMB-ELISA(Pierce，Rockford，IL)促生长，并且用1M H2SO4终止。用标准ELISA读数仪在450nm下对ELISA平板读数。然后通过与标准化E7蛋白质比较计算和测定细胞溶胞产物的E7蛋白质的量小鼠从国家癌症研究中心(the National Cancer Institute)(Frederick，Maryland)购得6至8周龄雌性C57BL/6小鼠，并且保持在Johns Hopkins医院(Baltimore，MD)的肿瘤学动物中心。根据现有方法并且根据对正确使用和护理实验动物的的说明进行所有的动物程序。
RNA接种如上所述利用体外转录产生所有的SINrep5 RNA疫苗。通过在260nm下测定光密度测定DNA浓度。利用变性凝胶电泳进一步检查RNA转录物的整合性和量。用10微克各种SINrep5 RNA在右后褪对小鼠肌内接种，SINrep5-E7/HSP70除外，其以0.1，1和10微克的量施用。
E7抗体的ELISA根据Wu(1995)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9211671-1165所述，通过直接ELISA测定血清中的抗-HPV 16 E7抗体。用100微升5微克/毫升细菌产生的HPV-16 E7蛋白质包被96微孔板并且在4℃下培养过夜。然后用含有20％胎牛血清的PBS将孔封闭。在免疫之后第14天从小鼠制备血清，用PBS系列稀释，加给ELISA孔，并且在37℃下培养2小时。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤之后，室温下该平板与1/2000稀释度的过氧化物酶-缀合的兔抗小鼠IgG抗体(Zymed，San Francisco，CA)培养1小时。洗涤该平板，并且用1-Step Turbo TMB-ELISA(Pierce，Rockford，IL)促生长，并且用1M H2SO4终止。用标准ELISA读数仪在450nm下对ELISA平板读数。
INF-γ的酶联免疫吸附测试(ELISA)接种之后2星期收集脾细胞，并且与包含I类MHC表位的E7肽(aa49-57)(参见例如Feltkamp(1993)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)232242-2249)或者包含II类MHC表位的E7肽(aa30-67)(参见例如Tindle(1991)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)885887-5891)一起在总体积2毫升的补充有10％(vol/vol)胎牛血清，50单位/ml青霉素和链霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，2mM非基本氨基酸的RPMI 1640中在24-孔组织培养平板中培养6天。收集上清夜并且使用ELISA试剂盒(Endogen，Woburn，MA)根据厂商说明测试IFN-γ的存在。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测试根据Corr(1999)免疫学杂志(J.Immunol.)1634721-4727所述96孔圆底平板中进行CTL测试。通过乳酸盐脱氢酶(LDH)的定量测定来测定细胞溶解(参见例如Corr(1999)上文)。RNA接种之后周收集脾细胞，并且与E7肽(aa49-57)一起在总体积2毫升的补充有10％(vol/vol)胎牛血清，50单位/ml青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，2mM非基本氨基酸的RPMI 1640中在24-孔组织培养平板中培养6天作为效应子细胞。TC-1肿瘤细胞用作靶细胞。TC-1细胞与各种效应子/靶物(E/T)之比的脾细胞混合。在37℃下温育5小时之后，收集50微升培养基，根据CytoTox测试试剂盒(Promega，Madison，WI)根据生产商说明，来评价培养基中LDH的量。从下面的等式计算溶胞百分比100 ×(A-B)/(C-D)，其中A实验-效应子信号值的读数，B是效应子自发背景信号值，C是来自靶细胞的最大信号值，D是靶自发背景信号值。
胞质内细胞因子染色和流式细胞仪分析来自自然状态的或者接种组小鼠的脾细胞与包含II类MHC肽的E7肽(aa30-67)一起温育(Tindle(1999)上文)用于测定E7-特异性CD4+T辅助细胞前体。以10微克/毫升的浓度加入E7肽20小时。在从培养物中收集细胞之前6小时加入GolgistopTM(Pharmigen，San Diego，CA)。然后细胞在FACSCANTM缓冲液中洗涤一次并且用藻红蛋白(PE)-缀合的单克隆大鼠抗-小鼠CD4抗体(Pharmingen，San Diego，CA)染色。使用Cytofix/CytopermTM试剂盒(Pharmingen)根据厂商说明对细胞进行胞内细胞因子染色。FITC-缀合的抗-IFN-γ和免疫球蛋白同种型对照抗体(大鼠IgG1)都购自Pharmingen。在Becton-Dickenson FACScanTM上使用CELLQuestTM软件(Becton Dickson Immunocytometry System，Mountain View，CA)进行分析。
体内肿瘤保护实验关于肿瘤保护实验，用不同剂量的SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5-E7/HSP70，和空白SINrep5 RNA疫苗肌内(IM)对小鼠免疫(每组5只)。免疫14天之后，用1×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞在尾静脉对小鼠静脉内注射。三星期之后，对小鼠实施安死术。通过不知情方式的实验计数评价并且每一只小鼠的肺重量和肺小结数目。
体内抗体耗竭实验先前例如Lin(1996)上文；Wu(1995)实验药物杂志(J.Exp.Med.)1821415-1421描述了体内抗体耗竭的方法。简要地说，用1微克的自主复制SINrep5-E7/HSP70 RNA对小鼠肌内接种，并且用1×104细胞/小鼠TC-1肿瘤细胞通过尾静脉注射攻击。抗体耗竭在肿瘤攻击之前一周就开始了。对于CD4耗竭，使用MAb GK1.5(Dialynas(1983)免疫学杂志(J.Immunol.)1312445)；对于CD8耗竭，使用MAb2.43(Sarmiento(1 980)免疫学杂志(J.Immunol.)1252665)，对于NK1.1耗竭，使用MAb PK136(Koo(1986)免疫学杂志(J.Immunol.)1373742)。流式细胞仪分析表明耗竭了95％以上的合适的淋巴细胞亚群，而具有正常水平的其它亚群。肿瘤攻击之后第2 1天耗竭终止。
细胞表面标记物染色和流式细胞仪分析根据Ji(1999)人体基因治疗(Human Gene Therapy)102727-2740所述，用细胞表面标记物染色立即对来自自然状态的或者接种组小鼠的脾细胞染色。细胞在FACSCANTM缓冲液中洗涤一次并且用PE-缀合的单克隆大鼠抗-小鼠NK1.1抗体和FITC-缀合的单克隆大鼠抗-小鼠CD3抗体(Pharmingen，SanDiego，CA)染色。NK细胞集落用抗NK1.1抗体染色而不用抗CD3抗体染色。利用流式细胞仪分析用各种自身复制RNA疫苗免疫的小鼠NK细胞的百分比。
来自骨髓的树状细胞(DCs)的产生和培养根据Lu(2000)实验药物杂志(J.Exp.Med.)191541-550所述，在GM-CSF存在下培养骨髓细胞产生DCs。简要地说，从小鼠的胫骨收集骨髓。将红细胞溶解，并且使残留的细胞通过尼龙筛去除小的骨碎屑。收集细胞并且将1×106细胞/毫升置于24-孔板上在补充有5％FCS，2mM-巯基乙醇，1％非基本氨基酸，100U/ml青霉素和100g/ml链霉素(Life Technologies，Rockville，MD)，和100U/ml GM-CSF(PharMingen，San Diego，CA)的RMPI 1640中培养。每2天置换三分之二的培养基，在第7天收集没有附着的细胞。通过对DC标记物的流式细胞仪分析(FACS)表征收集的细胞。
E7-特异性CD8+T细胞系的产生通过腹膜内注射Sig/E7/LAMP-1疫苗免疫雌性C57BL/6(H-2b)小鼠产生E7-特异性CD8+细胞系。在第8天收集脾细胞。关于开始体外刺激，用浓度为20U/ml的IL-2和1μM E7肽(氨基酸49-57)对脾细胞脉冲6天。通过将(2ml/孔)的1×106包含E7特异性CTLs的脾细胞与3×106照射过的脾细胞混合并且用浓度为20U/ml的IL-2和1μM E7肽(氨基酸49-57)脉冲，在24-孔板中进行E7-特异性CTL细胞系增殖。该程序每6天重复一次。通过CTL测试表征E7 CTL细胞系的特异性。进行流式细胞仪分析来证明CD8标记物的表达。
体外细胞死亡分析如上文所述，用4微克的SINrep5，SINrep5-E7，SINrep5-HSP70或SINrep5-E7/HSP70 RNA转录物转染千万个BHK21细胞。使用天然BHK21细胞或没有SINrep5RNA的电穿孔的BHK21细胞作为对照物。每24小时收集BHK21细胞并且评价，直到72小时。使用膜联蛋白V编程性细胞死亡检测试剂盒(PharMingen，San Diego，CA)根据生产商说明，并且接着进行流式细胞仪分析，分析编程性细胞死亡和坏死BHK21细胞百分比。
使用编程性细胞死亡细胞脉冲的DC作为靶细胞的CTL测试利用类似于Albert(1998)自然(Nature)39286-89；Albert(1998)实验药物杂志(J.Exp.Med.)1881359-1368所述的方法进行使用编程性细胞死亡细胞脉冲的DC作为靶细胞的CTL测试；有一些修改。简要地说，使用4微克的各种自主复制SINrep5 RNA通过电穿孔转染千万个BHK21细胞。电穿孔之后16-20小时收集BHK21细胞。根据ELISA测定，用SINrep5-E7，或SINrep5-E7/HSP70 RNA转录物转染的BHK21细胞中表达的E7蛋白质水平类似。然后在37℃下3×105转染的BHK21细胞与1×105个骨髓衍生的DCs共同培养48小时。然后将这些制备的DCs用作靶细胞，并且Db-限制性E7-特异性CD8+T细胞用作效应子细胞。用以各种比例(1∶1，3∶1，9∶1，和27∶1)混合的最终体积是200升的效应子细胞和靶细胞(1×104/孔)进行CTL测试。37℃下温育5小时之后，收集50微升培养基评价培养基中LDH的量，如上所述。与没有转染的BHK21细胞共同温育的DC，单独的转染的BHK21细胞，单独的没有处理的DCs，和单独的CD8+T细胞系用作阴性对照。
自主复制RNA构建体的构建和表征如上所述进行质粒DNA构建体的产生的下面的自主复制SINrep5 RNA构建体的制备。SINrep5载体包含编码新陪斯病毒RNA复制酶的基因和SP6启动子(参见例如，Bredenbeek(1993)上文)。图20A给出了SINrep5，SINrep5-HSP70，SINrep5-E7，SINrep5 E7/HSP70 DNA构建体的示意图。另外，图20B给出了使用SP6 RNA聚合酶从这些DNA构建体衍生的RNA转录物的示意图。甲基化M7G＂帽＂位于mRNA的5′端，接着是负责自主复制的序列(复制酶)，感兴趣的基因(即I类MHC肽表位，E7，HSP70，E7/HSP70，等等)，和聚腺苷酸化尾部(AAAA)。进行ELISA证明各种自主复制RNA构建体转染的BHK21细胞对E7蛋白质的表达。SINrep5-E7和SINrep5-E7/HSP70表达类似量的E7蛋白质。
用自主复制SINrep5-E7/HSP70 RNA接种增强E7-特异性细胞毒性免疫应答CD8+T淋巴细胞是诱导抗肿瘤免疫性最重要的效应子。为了测定SINrepS-E7/HSP70 RNA疫苗产生的E7-特异性CD8+T细胞应答的量，利用CTL测试。通过肌内注射用各种SINrep5自主复制RNA疫苗免疫小鼠。14天之后收集脾细胞和血清样品。为了进行细胞毒性测定，将来自各种自主复制SINrep5RNA疫苗的脾细胞与包含I类MHC表位的E7肽(aa 49-57)一起培6天作为效应子细胞。TC-1肿瘤细胞作为靶细胞。TC-1细胞与脾细胞以各种E/T(效应子/靶物之比)混合。通过定量测定LDH测定细胞溶解。这里所示的CTL测试是进行的两个实验中的一个代表。
与其它RNA疫苗相比，自主复制RNA E7/HSP70疫苗产生大得多的特异性裂解百分比(*P＜0.001，单向(one-way)ANOVA)。与其它SINrep5 RNA疫苗接种的小鼠相比，自主复制SINrep5-E7/HSP70产生大得多的特异性裂解百分比(*P＜0.001，单向ANOVA)。发现SINrep5-E7/HSP70 RNA产生特异性裂解的能力大约是自主复制SINrep5-E7 RNA的4倍(32.7％对8.8％，E/T之比45/1，P＜0.001)。
用自主复制SINrep5-E7/HSP70 RNA接种增强E7-特异性CD8+T细胞分泌高水平的INF-γ为了测定自主复制SINrep5-E7/HSP70 RNA产生E7-特异性CD8+T细胞的免疫应答的程度，利用ELISA检测培养的脾细胞的上清液中的INF-γ的浓度。14天之后收集脾细胞和血清样品。将来自各种自主复制RNA疫苗的脾细胞与包含I类MHC表位的E7肽(aa 49-57)(或者没有任何肽)一起体外培养6天。作为阴性对照，也进行没有肽的ELISA。收集培养基中的上清液利用ELISA检测INF-γ的浓度。
与其它RNA疫苗相比，用E7肽(aa 49-57)刺激的自主复制E7/HSP70RNA组的脾细胞分泌最大浓度的INF-γ(P＜0.001，单向ANOVA)。这些也结果表明HSP70与E7的融合显著增强INF-γ-分泌E7-特异性CD8+T细胞活性。因此，E7的I类MHC表位可诱导CD8+T细胞。注释与其它RNA疫苗相比，用E7肽(aa 49-57)刺激的自主复制E7/HSP70 RNA组的脾细胞分泌最大浓度的INF-γ(*P＜0.001，单向ANOVA)。
用自主复制SINrep5-E7/HSP70 RNA接种不产生显著的E7-特异性CD4+T细胞介导的免疫应答为了测定这些RNA疫苗产生的E7-特异性CD4+T前体细胞和细胞因子分布，对来自免疫小鼠的脾细胞上的CD4表面标记物和胞内IFN-γ进行双染色，接着进行流式细胞仪分析。体外将脾细胞与E7肽(aa30-67)一起培养过夜并且对CD4和胞内IFN-γ染色。E7肽(aa30-67)在HPV-16的E7可读框蛋白质中包含主要T辅助表位(参见例如Tindle(1991)上文)。利用流式细胞仪分析IFN-γ分泌CD4+T细胞百分比。
与用SINrep5-E7 RNA(15/3×105脾细胞对12/3×105脾细胞，p＞0.05)或者其它RNA组接种的小鼠相比，用SINrep5-E7/HSP70 RNA接种的小鼠组产生类似数目的CD4+IFN-γ+双阳性细胞。对天然状态小鼠和用空白质粒，E7，HSP70，或E7/HSP70 RNA接种的小鼠之间利用流式细胞仪没有发现E7-特异性CD4+IFN-γ+细胞数目的显著差异。使用来自Sig/E7/LAMP-1 DNA接种小鼠(Ji(1999)上文)的脾细胞作为阳性对照用于胞内IFN-γ染色用于该项研究。
接种之后2周利用各种稀释度(1∶100，1∶500，1∶1000)的直接酶联免疫测试(ELISA)测定接种小鼠血清中抗-HPV 16 E7抗体的量。与其它RNA疫苗构建体产生的相比，SINrep5-E7/HSP70在接种小鼠血清中不产生更高滴度的E7-特异性抗体。
用自主复制SINrep5-E7/HSP70 RNA接种保护小鼠抗TC-1肿瘤的生长为了测定用自主复制SINrepS-E7/HSP70 RNA接种是否保护小鼠抗E7-表达肿瘤，使用不同剂量的SINrep5-E7/HSP70RNA在右后腿肌内施用进行体内肿瘤保护实验。类似地，用10微克自主复制SINrep5，SINrep5-HSP70，和SINrep5-E7 RNA接种小鼠。也对小鼠注射包括0.1微克，1微克和10微克地不同剂量的自主复制SINrep5，SINrep5-HSP70 RNA。接种之后一周，通过以2×104细胞/小鼠的剂量静脉内尾静脉注射用TC-1肿瘤细胞攻击小鼠。每周两次监测小鼠并且肿瘤攻击之后21天杀死小鼠。肿瘤攻击之后21天评价肺小结。用空白SINrep5(10微克)，SINrep5-HSP70(10微克)，SINrep5-E7(10微克)，和SINrep5-E7/HSP70 RNA(0.1微克，1微克，和10微克)接种之后35天对肺切片。肺病灶平均数用作各种RNA疫苗在控制HPV-16 E7-表达肿瘤生长中的效力的量度。
用自主复制E7/HSP70 RNA疫苗(0.1微克，1微克，和10微克)接种的小鼠的平均肺小结(nodule)数与用其它RNA疫苗接种的小鼠相比小得多(P＜0.001，单向ANOVA)。这些结果证明自主复制RNA SINrep5-E7/HSP70疫苗即使在0.1微克这样低的剂量下也保护小鼠不受静脉内肿瘤攻击，而用来自10微克没有插入物的SINrep5，10微克SINrep5-E7，或10微克SINrepS-HSP70的RNA接种的小鼠在TC-1肿瘤攻击之后长出数个肺小结。
CD8+T细胞和NK细胞对于用SINrep5-E7/HSP70 RNA疫苗接种产生的抗肿瘤作用是重要的为了测定对抗E7-表达肿瘤细胞的保护作用是重要的淋巴细胞的类型，进行体内抗体耗竭实验(CD8+T细胞和NK细胞的)(来自用自主复制RNA疫苗免疫的小鼠的脾细胞的NK细胞百分比高于没有免疫的，并且各种自主复制RNA疫苗之间的NK细胞百分比没有显著差异)。在肿瘤攻击之前一周开始抗体耗竭并且在肿瘤攻击之后第21天终止。
耗竭CD8+T细胞和NK1.1细胞的小鼠的平均肺小结数显著高于没有耗竭组的那些。此外，NK1.1细胞的耗竭导致比CD8+耗竭小鼠更高的肿瘤肺小结的平均数。
比较中，CD4+T细胞耗竭小鼠的平均肺小结数类似于没有耗竭小鼠的结果，表明CD4+T细胞在产生该作用中不是关键的。这些结果表明CD8+T细胞对于SINrep5-E7/HSP70 RNA疫苗产生的抗原特异性抗肿瘤免疫性是必需的，而NK细胞，尽管不局限于E7/HSP70 RNA疫苗，也起着重要作用。
还研究了NK细胞作用是否限于E7/HSP70疫苗或者其是否是使用的载体的结果。对CD3(-)，NK1.1(+)细胞的流式细胞仪分析表明相对于原初小鼠来说，在所有的构建体(E7/HSP70，E7，HSP70，和对照质粒)中它们的存在大大增加，表明NK细胞是不局限于E7/HSP70疫苗的抗肿瘤作用的重要的效应子。
自主复制RNA疫苗诱导编程性细胞死亡通过电穿孔将体外从各种质粒SINrep5 RNA疫苗转录的RNA转染到BHK21细胞中。将没有RNA的电穿孔BHK 21细胞和没有处理的BHK21细胞用作对照物。通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭染色接着流式细胞仪分析测定编程性细胞死亡和坏死BHK21细胞百分比。
当用SINrep5 RNA疫苗转染时，24小时至72小时之后，编程性细胞死亡的BHK21细胞的百分比表现出统计学减少(代表性的是SIN5-E7/HSP70 70.3±3.6％，24hr，49.3±4.2％，48hr，18.0±3.1％，72hr，P＜0.001，单向ANOVA)。与另外两个对照组相比，用SINrep5 RNA疫苗转染的BHK21细胞在24，48和72小时之后产生更高的百分比。发现各种SINrep5 RNA疫苗的编程性细胞死亡百分比没有统计学差异。
用SINrep5-E7/HSP70 RNA转染的细胞脉冲的树状细胞中E7通过I类MHC途径的呈递增强体内增强的E7-特异性CD8+T细胞免疫应答的可能的机理是通过摄取来自表达各种E7构建体的编程性细胞死亡体(apoptotic bodies)E7通过I类MHC途径的呈递作用，也称之为“交叉引发(cross-priming)”。进行交叉引发实验来表征来自各种自主复制RNA转染的BHK21细胞的编程性细胞死亡体脉冲的树状细胞中E7的I类MHC呈递。如先前所述，已经证明BHK21细胞具有稳定的高转染效率，并且用不同的E7-包含自主复制RNA转染的细胞有类似的E7表达。转染的BHK21细胞与来自骨髓的DC一起培养。DCs被用作靶细胞，而E7-特异性CD8+T细胞作为效应子细胞。使用各种E/T之比进行CTL测试。
与和用SINrep5-E7 RNA转染的BHK21细胞共同培养的DC相比，和用SINrepS E7/HSP70RNA转染的BHK21细胞共同培养的DC靶细胞产生显著更高的特异性裂解百分比(P＜0.001)。这些结果提示用包含E7/HSP70融合蛋白的编程性细胞死亡体脉冲的树状细胞通过I类MHC途径呈递E7抗原比用包含野生型E7蛋白质的编程性细胞死亡体脉冲的树状细胞更有效。因此，HSP70与E7的融合增强E7-特异性CD8+T细胞免疫应答；并且，尽管本发明不局限于任何特殊机理，这种增强可能是通过＂交叉引发＂。
已经描述了本发明的一些实施方案。但是，要明白不脱离本发明的精神和范围可以进行各种改进。因此，其它实施方案在下面的权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种编码嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽包括第一多肽结构域，包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)，或者粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)序列，和第二多肽结构域，包括抗原性多肽。
2.权利要求1的核酸，其中所述编码第一多肽结构域的核酸是在编码第二多肽结构域的核酸的5’端。
3.权利要求1的核酸，其中所述编码第二多肽结构域的核酸是在编码第一多肽结构域的核酸的5’端。
4.权利要求1的核酸，其中所述热激蛋白(HSP)的羧基末端片段具有陪伴分子活性。
5.权利要求1的核酸，其中所述热激蛋白(HSP)包括热激蛋白70(HSP70)。
6.权利要求1的核酸，其中所述热激蛋白70(HSP70)来自结核分枝杆菌。
7.权利要求1的核酸，其中所述热激蛋白(HSP)包括SEQ ID NO9的残基312-625给出的序列。
8.权利要求1的核酸，其中所述热激蛋白(HSP)包括SEQ ID NO9的大约残基517至大约残基625给出的序列。
9.权利要求1的核酸，其中所述Flt-3配体多肽包括SEQ ID NO25的大约残基1至大约残基189给出的序列。
10. 权利要求1的核酸，其中所述假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)包括SEQ ID NO3的大约残基247至大约残基417给出的序列。
11.权利要求1的核酸，其中所述假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)包括SEQ ID NO3的大约残基253至大约残基364给出的序列。
12.权利要求1的核酸，其中所述GM-CSF序列是包含二硫键的GM-CSF片段。
13.权利要求1的核酸，其中所述GM-CSF片段包括SEQ ID NO1的大约残基18至大约残基22，或者大约残基34至大约残基41，或者大约残基38至大约残基48，或者大约残基52至大约残基61，或者大约残基94至大约残基115，或者大约残基95至大约残基111给出的序列。
14.权利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽包括I类MHC-结合肽表位。
15.权利要求14的核酸，其中所述I类MHC-结合肽表位长度在大约8个氨基酸残基和大约11个氨基酸残基之间。
16.权利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽来自病毒。
17.权利要求16的核酸，其中所述病毒是人乳多空病毒。
18.权利要求16的核酸，其中所述病毒是人乳头瘤病毒(HPV)。
19.权利要求18的核酸，其中所述病毒是人乳头瘤病毒-16(HPV-16)。
20.权利要求18的核酸，其中所述抗原性多肽包括人乳头瘤病毒E6多肽或人乳头瘤病毒E7多肽。
21.权利要求16的核酸，其中所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
22.权利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽是肿瘤-特异性的或者肿瘤-相关的多肽。
23.权利要求22的核酸，其中所述肿瘤-特异性的或者肿瘤-相关的多肽包括在肿瘤细胞表面上表达的抗原。
24.权利要求22的核酸，其中所述肿瘤-特异性的或者肿瘤-相关的多肽是突变体p53，MAGE-1或MAGE-3。
25.权利要求1的核酸，其中所述抗原性多肽来自病原体。
26.权利要求25的核酸，其中所述病原体是疟疾，HIV-1，牛病毒性腹泻病毒，巨细胞病毒，脑炎病毒，肝炎病毒，单纯疱疹病毒或者流感病毒。
27.权利要求1的核酸，其中所述嵌合多肽进一步包括第三多肽结构域，其包括胞质转运多肽结构域。
28.权利要求27的核酸，其中所述胞质转运多肽结构域包括假单胞杆菌属外毒素A(ETA)的胞质转运结构域。
29.权利要求28的核酸，其中所述假单胞杆菌属外毒素A(ETA)的胞质转运结构域包括SEQ ID NO3的大约残基253至大约残基364给出的序列。
30.权利要求27的核酸，其中所述胞质转运多肽结构域包括来自白喉，梭状芽孢杆菌属，Botulinum，芽孢杆菌属，耶尔森氏菌属，霍乱弧菌，或者百日咳博德特氏杆菌的毒素的胞质转运结构域。
31.权利要求27的核酸，其中所述编码第三多肽结构域的核酸位于编码第一或第二结构域的核酸的5’端，或者位于编码第一或第二结构域的核酸之间，或者位于编码第一或第二结构域的核酸的3’端。
32.权利要求1的核酸，进一步包括调控核酸序列。
33.权利要求32的核酸，其中所述调控核酸序列包括转录调控序列。
34.一种包括编码一种嵌合多肽的核酸的表达盒，所述嵌合多肽包括一种包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)的第一多肽结构域，和一种包括抗原性多肽的第二多肽结构域。
35.权利要求34的表达盒，包括表达载体或质粒。
36.权利要求34的表达盒，包括自主复制RNA复制子。
37.权利要求36的表达盒，其中所述自主复制RNA复制子包括新培斯病毒自主复制RNA载体。
38.权利要求37的表达盒，其中所述自主复制RNA复制子包括新培斯病毒自主复制RNA载体SINrep5。
39.一种包括编码一种嵌合多肽的核酸的转化的细胞，所述嵌合多肽包括一种包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)的第一多肽结构域，和一种包括抗原性多肽的第二多肽结构域。
40.一种嵌合多肽，包括一种包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域的(ETA dII)第一多肽结构域，和，一种包括抗原性多肽的第二多肽结构域。
41.权利要求40的嵌合多肽，其中所述第一多肽结构域与第二多肽结构域非共价连接。
42.权利要求40的嵌合多肽，其中所述第一多肽结构域与第二多肽结构域共价连接。
43.权利要求42的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽是重组多肽。
44.一种含有下面成分的药物组合物编码嵌合多肽的核酸，包括编码嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域；和，药学可接受赋形剂。
45.权利要求44的组合物，其中用组合物用磷脂配制成脂质体。
46.一种含有下面成分的DNA疫苗编码嵌合多肽的核酸，包括编码嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域；和，药学可接受赋形剂。
47.一种包含编码嵌合多肽的核酸或者包括编码嵌合多肽的核酸的载体的颗粒，其中嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域。
48.权利要求47的颗粒，其中所述颗粒包括适合颗粒轰击的材料。
49.权利要求48的颗粒，其中所述材料包括金。
50.一种诱导免疫应答的方法，该方法包括施用有效量的包括下面成分的一种组合物编码嵌合多肽的核酸，包括编码嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括抗原性多肽的第二多肽结构域，或者一种包括所述核酸，所述载体，所述嵌合多肽或者其组合的DNA疫苗，其中施用有效量的组合物诱导免疫应答。
51.权利要求50的方法，其中所述诱导的免疫应答包括细胞毒性T细胞应答。
52.权利要求50的方法，其中所述编码所述嵌合多肽的核酸或者载体作为裸DNA被施用。
53.权利要求52的方法，其中通过基因枪或等价物施用所述裸DNA。
54.权利要求50的方法，其中所述组合物作为脂质体制剂被施用。
55.权利要求50的方法，其中皮内施用所述组合物。
56.一种对哺乳动物接种抗病原体感染的方法，该方法包括施用有效量的一种组合物，所述组合物含有编码嵌合多肽的核酸，包括编码嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括来自病原体的抗原多肽的第二多肽结构域，或者一种包括所述核酸，所述载体，所述嵌合多肽或者其组合的DNA疫苗，其中施用有效量的组合物诱导对该病原体的免疫应答。
57.一种对哺乳动物接种抗肿瘤抗原的方法，该方法包括施用有效量的一种组合物，所述组合物含有编码嵌合多肽的核酸，包括编码嵌合多肽的核酸的载体，或者嵌合多肽，其中嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括肿瘤抗原的第二多肽结构域，或者一种包括所述核酸，所述载体，所述嵌合多肽或者其组合的DNA疫苗，其中施用有效量的组合物诱导对该肿瘤抗原的免疫应答。
58.一种成分用于制备用于对哺乳动物接种抗一种抗原的药物制剂的用途，其中所述药物制剂含有编码一种嵌合多肽的核酸，包括编码一种嵌合多肽的核酸的载体，嵌合多肽，或者它们的组合，其中所述嵌合多肽包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt-3配体(FL)，或假单孢杆菌属外毒素A的胞质转运结构域(ETA dII)；和，包括肿瘤抗原的第二多肽结构域，和药学可接受赋形剂。
全文摘要
本发明提供新的编码嵌合多肽的嵌合核酸，体外和体内表达这些多肽的构建体，分离的嵌合多肽，药物组合物和制备和使用这些组合物的方法。这些组合物和方法特别有用于刺激或增强选择的抗原的免疫原性或者刺激或增强对该抗原特异性的细胞免疫应答。本发明的核酸包括包括热激蛋白(HSP)的羧基末端片段，Flt－3配体(FL)，假单孢杆菌外毒素A(ETA dII)的胞质转运结构域，或者粒细胞—巨噬细胞—集落刺激因子(GM－CSF)序列的第一多肽结构域，和包括抗原性多肽的第二多肽结构域。
文档编号A61K47/24GK1411512SQ00817456
公开日2003年4月16日 申请日期2000年10月20日 优先权日1999年10月20日
发明者吴泽柱, 黄建富 申请人:约翰霍普金斯大学医学院