专利名称：调节参与黑色素合成的酶表达的寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型寡核苷酸序列及其衍生物。
这些新型寡核苷酸序列能够与黑色素合成的途径中的一种必需酶的编码基因或其基因产物杂交。
本发明还涉及这些新型寡核苷酸作为皮肤褪色剂或漂白剂在美容组合物或皮肤护理组合物中的用途。
对于人类来说，皮肤、毛囊或眼睛中的黑色素的合成和分布导致色素沉着。色素沉着是遗传决定的，但也受许多内部或外部因素的调节。黑色素细胞产生的黑色素及黑色素细胞的数目、他们的酪氨酸酶活性和向角质化细胞运输黑色素的能力以及含有黑色素颗粒的黑色素体的大小均影响人类皮肤的颜色，对于每个人来讲，皮肤颜色的差异主要受到或多或少的来自紫外线的辐射作用影响。换句话说，对于每个人，当受到最弱的紫外辐射时存在一个基本的肤色，相当于他最淡的皮肤颜色，当受到稍强一些的紫外辐射时，其皮肤的色素沉着也强一些，当受到持久的强紫外辐射时，比如在高山中遇到的那样，色素沉着达到最大，相当于他最深的皮肤颜色。
另外，众所周知，关于皮肤色素沉着在世界人群中存在很大的遗传多样性。因此，不同的人群，其如上所述的基本肤色都在非常淡或非常深的范围内表现得淡一些或深一些。不同的人群，其基本色素沉着时和最大色素沉着时的肤色的差别也或多或少的不同。因此，众所周知，那些具有淡肤色(基本色素沉着)的人群对紫外辐射的反应较快和/或较明显，并且因此比较容易具有深色肤色，甚至这些人并没有有意在阳光下持续暴露一定时间也如此。在下文中，这些人被称作“对紫外辐射非常敏感的人”。特别是亚洲人种或被称为混合人种的人群。
另外，人们的皮肤上特别是在脸或手上有较深的或者带颜色的部分或者斑点，使皮肤具有一定的不均匀性。这些斑点是由于表皮的角质化细胞中的黑色素的明显集中所致。
皮肤色素沉着的形成机理涉及黑色素的合成，该机理特别复杂，简要概括为下列主要步骤酪氨酸→多巴→多巴醌(Dopaquinone)→多巴色素→黑色素已知该系列反应中涉及的酶类主要是酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白(TPR-1)。这些酶特别地催化酪氨酸形成多巴的反应(二羟基苯丙氨酸)以及多巴形成多巴醌的反应，最后形成黑色素。这些酶在黑色素形成反应机制中不是单独起作用的。事实上，酪氨酸酶和TRP-1形成酶复合物(Wincler et al.(1994)Cell，Mol.Biol.Res.407-8；orlowet al.(1994)，J.of Investigative Dermatology 103196-211)。因此，这两种酶协同作用，并且，似乎一种酶不存在时另一种酶也不起作用。众所周知，当细胞中TRP-1缺乏时，也观察到酪氨酶的活性的降低(Orlow et al.(1994))；这意味着，酪氨酸酶必须在TRP-1的存在下才有活性(Zhao.et al.(1996)J.of Investigative Dermatology106744-752)。
在本文的下文中，这些黑色素合成途径中涉及的必需酶被称为“色素沉着必需酶”。
如果一个分子通过抑制表皮黑色素细胞的活性而直接作用于这些细胞和/或阻断黑色素生物合成途径中的一个步骤，则该分子被认为是有褪色作用的分子。特别是指该分子能够抑制一种参与黑色素形成的酶或者它能与黑色素合成链中的化学物质反应。
已知的有褪色作用物质特别是氢醌及其衍生物，抗坏血酸及其衍生物，胎盘提取物，曲酸，阿魏酸，熊果苷，二羟苯衍生物(WO 00/47045)，邻甲氧基苯酚衍生物(WO 00/47179)，4-(2，3-二羟苯基)环己醇(WO00/56279)，间苯二酚衍生物(WO 00/56702)和苯酚酰胺类(WO99/32077)。这些物质都有一定的不足。它们可能不稳定，需要很高的应用浓度，对于它们的作用方式缺乏特异性或者具有细胞毒性或刺激性。
在美容品或护肤品局部应用中特别希望高效、无害的褪黑物质。这些物质特别地应用在治疗黑色素细胞过度活化引起的局部的过度色素沉着，如特发性黑斑病，由于良性的黑色素细胞的过度活化和增殖引起的局部过度色素沉着，如已知的老年斑(senile lentigo老年斑)，意外的过度色素沉着，如光致敏或瘢痕性的过度色素沉着，以及某些白斑病，比如白斑。在后一病例中，使皮肤重新色变化是不可能的，因此为了使皮肤呈现比较均一的颜色，而将褪色的区域边界周围的色素沉着弱化。
褪色物质也被某些人用作皮肤漂白剂，特别是上文提到的那些人，他们对紫外辐射非常敏感，为了淡化肤色，特别是他们的脸部和手部的肤色，以致于尽可能保持白皙或均一的肤色，或者至少降低紫外线的色素沉着效果。
因此，专业人员面临的问题是设计、制造或分离用于人类皮肤、体毛、头发的新型褪色物质或者新型漂白剂，它们没有已知物质的缺点，即它们对皮肤无刺激、无毒和/或无致敏，并且在组合物中稳定。
WO 99/25819中公开了一种反义寡核苷酸在治疗由黑色素细胞机能障碍引起的疾病，特别是白斑病和其它褪色疾病中的应用。在这些病理的皮肤状态下，由于异常高的替拿素(tenascin)含量导致色素沉着不足。该文件中描述的寡核苷酸通过调节替拿素的表达来抵抗色素沉着不足。
另一方面，本发明的目的包括提供作用于黑色素生成过程的一种褪色剂，其意图首先是在基本均一的色素沉着情况下漂白皮肤、体毛或头发，也就是降低它们的色素沉着，其次是在皮肤显示非均一色素沉着时治疗皮肤的过度色素沉着。
本发明的发明者发现寡核苷酸能够与编码色素沉着必需酶的基因或其产物(比如RNAs)杂交。
因此，本发明所述的用于调节黑色素细胞中色素沉着必需酶的表达的寡核苷酸参与上文所述的黑色素生成上游反应。甚至在非常低的浓度这种活性就体现出来，这增加了这些寡核苷酸的优点。另外，本文所述的寡核苷酸无细胞毒性。
本发明所述的寡核苷酸为通常应用的物质所面对的问题提供了理想的解决方法。已知的抑制酪氨酸酶或TRP-1活性的物质(特别是氢醌及其衍生物，抗坏血酸及其衍生物，胎盘提取物，曲酸和熊果苷)，由于它们较差的特异性而引起许多不能接受的副作用。因此，本发明通过调节色素沉着必需酶的生成而不是直接抑制该酶以达到褪色的效果，从而解决了以往研究者所遇到的问题。
因为，该必需酶是以复合物的形式协同起作用。因此，为了解决存在的问题，发明者描述了抑制酶复合物中一种或另一种酶的新型寡核苷酸。
本发明所述的寡核苷酸本身是新的，作为医用产品也是新的。
本发明涉及一种寡核苷酸，其包含7-25个核苷酸，优选地9-25个，12-25个，15-25个或18-25个，并更优选地包含20个核苷酸，该寡核苷酸能与编码色素沉着必需酶之一的基因或其产物杂交。特别是，所述的寡核苷酸能与编码酪氨酸酶或TRP-1的基因或其产物杂交。
本发明更具体地涉及一种如上所述的寡核苷酸，并且该寡核苷酸能够特异性地与编码酪氨酸酶或TRP-1的基因或其产物杂交。
特别是，它是一种序列选自如下所示的序列SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11的寡核苷酸-SEQ ID NO.15’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.25’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3’-SEQ ID NO.35’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.45’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.55’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’-SEQ ID NO.65’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’-SEQ ID NO.75’-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3’-SEQ ID NO.85’-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3’-SEQ ID NO.95’-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3’-SEQ ID NO.10 5’-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3’-SEQ ID NO.11 5’-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3’
本发明的主题还包括一种寡核苷酸用作一种新产品，该寡核苷酸的序列是如上所述的序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11中的一种。
在本发明的上下文中，“编码酪氨酸酶的基因”是指酪氨酸酶基因的基因组序列。类似的，“编码TRP-1的基因”是指TRP-1基因的基因组序列。
酪氨酸酶和TRP-1在黑色素形成中的关键作用是已知的。针对编码一种酶或蛋白的信使RNA的寡核苷酸在调节该酶或蛋白质表达中的用途也是已知的。但是，本发明的发明者所开发的技术从未作为一种褪色手段被应用过。
本发明所述的寡核苷酸设计成能够与信使RNA或基因直接杂交。因此，他们便对由所述基因产生的酪氨酸酶或TRP-1的含量实施最终的调节成为可能。
在本申请文件中，术语“杂交”是指在通常位于两条核酸链上的互补碱基之间形成氢链，也被认为Watson-crick配对，从而形成双螺旋形式的双链体。
相同长度的两条核酸序列之间的互补程度由比对之后将第一条序列与第二条序列的互补序列进行比较而确定。通过确定比较的两条序列间核苷酸相同的相同位点数目，除以总的位点数，乘以100就得到两条序列间的互补程度。
术语“特异杂交”特别是指存在一定程度的互补性，从而在希望发生特异性结合的条件下足以避免寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合。可以理解为达到特异性杂交，寡核苷酸无需与靶核酸序列具有100％互补性。特别是，具有至少大约80％的互补程度的寡核苷酸能够与选定的靶核酸序列特异性杂交。
本发明所述的寡核苷酸优选地与编码色素沉着必需酶的基因或其产物特异性杂交。特别地，本发明的寡核苷酸能够或者与编码酪氨酸酶或TRP-1的基因DNA杂交，或者是可以与一种或另一种这些基因衍生的mRNA杂交。本发明所述的寡核苷酸包含一定数目的核苷酸，其在同一性及数目上足以进行特异杂交。这种性质通常被称为“反义”。
因此本发明的一个主题是能够与相关基因的上游，或编码区，或与该基因的翻译起始密码区特异杂交的寡核苷酸。
本发明的主题还是能与一种色素沉着必需酶，特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码DNA或信使RNA特异杂交的寡核苷酸。
本发明的主题还是能够与一种色素沉着必需酶，特别是酪氨酸酶或TRP-1编码基因或mRNA的5′非编码区、起始密码区、编码区或者3′非编码区特异杂交的寡核苷酸。
在本发明的上下文中，“编码酪氨酸酶的DNA”或“编码TRP-1的DNA”是指外显子和内含子，特别是指外显子。
具体说明如下▲本发明中具有序列SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，和SEQ ID NO.4的寡核苷酸与编码TRP-1的基因或mRNA的5′非编码区特异杂交。
▲本发明中具有序列SEQ ID NO.5的寡核苷酸与编码TRP-1的基因或mRNA的起始密码子区特异杂交。
▲本发明中具有序列SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的寡核苷酸与编码酪氨酸酶的基因或mRNA的5′非编码区特异杂交。
▲本发明中具有序列SEQ ID NO.9的寡核苷酸与编码酪氨酸酶的基因或mRNA的编码区特异地杂交。
▲本发明中具有序列SEQ ID NO.10的寡核苷酸与编码酪氨酸酶的基因或mRNA的起始密码子区特异地杂交。
▲本发明中具有序列SEQ ID NO.11的寡核苷酸与编码TRP-1的基因或mRNA的5′非编码区特异地杂交。
本发明的一个主题还是在糖组分、核碱基组分或核苷酸间主链上含有一个或多个化学修饰的寡核苷酸。这些修饰使本发明的寡核苷酸具有所需的物化特性，如增加的生物可利用性，与靶序列的亲和性的提高，细胞内在化的提高，或者更好的生物稳定性，或者在细胞内核酸酶的存在下的稳定性的提高。
举例来说，可赋予这些特性的修饰为核苷糖组分上的2′-O-烷基和2′-O-氟代衍生物，以及核苷酸间主链内的硫代磷酸酯衍生物或甲基膦酸酯衍生物。
本申请文件中，术语“寡核苷酸”是指由天然核碱基和呋喃五碳糖基团制成的多核苷酸，它们构成核苷，核苷通过磷酸二酯键彼此相连。因此，术语“寡核苷酸”是指由天然亚基或它的密切同源物质构成的天然物质或合成物质。
术语“寡核苷酸”也可指与天然寡核苷酸具有相似的功能但可能含有非天然部分的组分。该寡核苷酸可能含有修饰的糖组分，修饰的核碱基组分或修饰的核苷酸间连键。在可能的修饰中，优选的修饰为糖组分上的2′-O-烷基衍生物，特别是2′-O-乙氧基-甲基或2′-O-甲基衍生物，或者核苷酸间主链上是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。
在本发明优选的修饰中包括嵌合的寡核苷酸。该寡核苷酸包含至少两个化学上不同的区域，每一个区域至少包含一个核苷酸。特别是包括一个或多个含有修饰的核苷酸的区域，该修饰核苷酸使其具有一个或多个有益的特性，比如更好的生物学稳定性、增加了的生物可利用性、细胞内在化提高、或者与靶RNA的亲和性间主链提高。
优选地，核苷酸间主链可以全部或部分地由磷酸二酯、硫代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者磷酸二酯和/或硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯键的组合所组成。
因此，本发明的寡核苷酸的特征在于它的核苷酸间主链的一些磷酸二酯基团被硫代磷酸酯基团和/或甲基膦酸酯基团取代。
或者，本发明的寡核苷酸的特征在于所有的磷酸二酯基团被硫代磷酸酯基团或甲基膦酸酯基团取代。
或者，磷酸二酯基团全部或部分被硫代磷酸酯基团和/或甲基膦酸酯基取代。
术语“寡核苷酸”还可以指其上连接有环状质粒类载体或线性核酸类或肽类载体的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸作为医用产品是新的。
本发明的一个主题还是一种美容品或护肤品组合物，其含有至少一种如上所述的寡核苷酸和美容上或护肤上可接受的介质。这种组合物可能含有一种或多种活性剂以加强所希望的效果。
本发明的一个主题还是至少一种针对色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因的转录产物的寡核苷酸序列在制备美容或护肤组合物中的用途，该组合物可以褪色或漂白人类皮肤、体毛或头发，或去除或弱化人类皮肤的色斑。
本发明还涉及能够与色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因或其产物特异地杂交的一种寡核苷酸序列，作为美容剂，特别是用于褪色或漂白人类皮肤、体毛、或头发和弱化人类皮肤色斑中的用途。
本发明的主题还是至少一种针对色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因的转录产物的寡核苷酸序列作为黑色素合成的抑制剂用以制造美容或护肤组合物中的用途。
本发明还涉及至少一种上述寡核苷酸制造用于经局部途径治疗或预防由酪氨酸酶和/或TRP-1过量表达导致的疾病的医用产品中的用途。该医用产品可能用于抑制黑色素的合成，特别是皮肤的褪色或漂白，但还可用于疗病或预防黑色素细胞过度活化引起的局部过度色素沉着，如特发性黑斑病，由良性的黑色素细胞过度活化和增殖引起的局部过度色素沉着，如老年斑(着色斑)，和意外的过度色素沉着，如光致敏或损伤后疤痕，以及治疗某些白斑病，如白斑。
本发明的主题还是至少一种能针对色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因的转录产物的寡核苷酸在用于人类皮肤的褪色或漂白美容组合物中的用途。
本发明还涉及上述的寡核苷酸在调节色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的表达中的用途。
本发明的主题还是至少一种针对色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因的转录产物的寡核苷酸序列在制备用于人类皮肤的褪色或漂白皮肤组合物中的用途。
本发明还涉及一种褪色或漂白人类皮肤的美容或皮肤护理治疗方法，包括将包含至少一种针对色素沉着必需酶之一、特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因的转录产物的寡核苷酸的美容组合物应用于色素沉着的皮肤。
本发明的主题还是一种褪色组合物，其特征在于，它在美容或皮肤护理可接受的介质中包含至少一种针对色素沉着必需酶之一，特别是酪氨酸酶或TRP-1的编码基因的转录产物的寡核苷酸。
根据本发明如上所述的组合物、用途和治疗方法优选的实施方案，寡核苷酸的序列为如下所示的序列中的一种-SEQ ID NO.15’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.25’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3’-SEQ ID NO.35’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.45’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.55’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’-SEQ ID NO.65’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’本发明所述的美容或皮肤护理组合物适于局部应用，因此其含有美容上或皮肤护理上可接受的介质，也就是可与皮肤相容的介质。本发明中的寡核苷酸序列可占组合物总重量的0.00001％到10％，优选地占0.0003％到3％。
本发明的组合物可以是适于局部应用的习惯上常用的药物形式，特别是含水、水-醇或油的溶液，水包油、油包水或多相乳状液形式，水或油性凝胶形式，液体的、糊状的或固体无水的产品，聚合颗粒的分散溶液，如在水相或油相中的小球或小胶囊，或者如美国专利4,508,703中描述的离子型或非离子型的脂囊泡分散体。
该组合物可以是或多或少流动性的，并且可以是白色或彩色霜状、软膏状、奶状、凝胶状、洗液状、液状、糊状或摩丝状外观。它可以任选把以气溶胶的形式应用于皮肤上。它也可以是固体形式，可是或不是粉状的，例如唇膏或粉饼状，也可以贴片状、笔状、刷状以及涂敷器具状，以便于面部或手部斑点的局部应用。它可以被用做护理用品或用作化妆用品。
习惯上，本发明的组合物也可以包含在美容上和皮肤护理中常见的佐剂，如亲水的或亲油的胶凝剂、亲水的或亲油的活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、防晒剂、色素、香味吸收剂和着色剂。各种佐剂的含量为该领域的常规用量。根据这些佐剂的性质，它们分别被加到脂相、水相、脂囊泡或小颗粒中。
当该美容或皮肤护理用组合物为乳剂时，脂相的比例通常可以为组合物总重量的5-80％重量百分比，优选地为5-50％重量百分比。在乳剂形式的组合物中所用的油，乳化剂和共乳化剂选自该领域常用的物质。组合物中乳化剂和共乳化剂的比例通常为组合物总重量的0.3％-30％重量百分比，优选地为0.5％到20％重量百分比。
可以与本发明中的寡核苷酸联合使用的油有矿物油(液体凡士林)、植物来源的油(鳄梨油、大豆油)、来源于动物的油(羊毛脂)、合成油(全氢化角鲨烯)、硅油(环(二)甲基硅酮)以及氟化油(全氟聚醚)。脂肪醇(十六(烷)醇)、脂肪酸以及蜡(巴西棕榈蜡，地蜡)也可用作脂肪物质。
可与本发明的寡核苷酸联合使用的乳化剂和共乳化剂有，例如聚乙二醇的脂肪酸酯，如PEG-20硬脂酸酯，以及甘油的脂肪酸酯，如硬脂酸甘油酯。
可与本发明的寡核苷酸联合使用的亲水性胶凝剂有，特别是羧基乙烯基聚合物(丙烯酸聚合物)，丙烯类共聚物，如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖、天然树胶和粘土。作为亲脂性胶凝剂，可提及的有修饰的粘土如皂土，脂肪酸的金属盐，疏水硅石以及聚乙烯。
本发明的一个主题是含有至少一种如上所述的寡核苷酸及一种或多种其它活性剂的美容或皮肤护理组合物。
本发明还涉及至少一种如上所述的寡核苷酸在制备医用产品中的用途，该医用产品旨在同时或分别或以随时间扩散的方式与一种或多种活性剂联合使用。
所述的可与本发明的寡核苷酸联合使用的并以纯物质使用或来源于含有这些分子的提取物的活性剂，特别是以下化合物鞣花酸及其衍生物；对苯二酚；熊果苷；间苯二酚及其衍生物；维生素C及其衍生物；泛酸磺酸酯及其衍生物；曲酸；胎盘提取物；可直接或间接干扰α-促黑素(α-MSH)或其受体或促肾上脉皮质激素(ACTH)的分子；多羟基化合物，如甘油、乙二醇或丙二醇；维生素；溶角蛋白剂或脱皮剂，如水杨酸及其衍生物；α-醇酸，如乳酸或苹果酸，可以是单独的或接枝的；抗坏血酸及其衍生物；视黄酸；视黄醛；视黄醇及其衍生物，如棕榈酸酯、丙酸酯或乙酸酯，其可以或不以脂质体制剂形式存在；antiglycation剂或抗氧化剂，其单独或联合使用，如维生素E(生育酚)及其衍生物，硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、维生素B6(吡哆醇)、三磷酸腺苷；抗炎剂，如甘草亭酸十八烷基酯；润肤剂及其混合物，化学的或物理的防晒剂，如微粉化氧化锌，氧化钛，丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷和甲氧基肉桂酸辛酯；以及脱氧核糖核酸和核酸。如果不相容时，这些其它的活性剂和/或本发明的寡核苷酸可能掺入小球，特别是美国专利4,508,703所述的由离子或非离子型两亲脂质构成的小泡，或小颗粒。
下面的实施例用于说明本发明而不是限制。
考虑到在体外培养基中的稳定性及与普通实践的一致性，实施例2到4利用硫代磷酸酯衍生物，实施例5到12同样利用硫代磷酸酯或膦酸二酯衍生物制备。
下面的实施例中，除另有说明外，所有的百分比均为重量百分比。实施例1寡核苷酸的合成举例来说，寡核苷酸按照操作手册，采用标准的亚磷酰胺衍生化学法利用自动合成仪(Perseptive Biosystems Expedite Model 8909)合成。β-氰乙基二异丙基亚磷酰胺由Perseptive Biosystems公司提供。对于磷酸二酯寡核苷酸，亚磷酸的氧化步骤在碘溶液中完成。对于硫代磷酸酯寡核苷酸，亚磷酸的氧化步骤在含有0.05M的3H-1，2-苯并二硫-3-酮1，1-二氧化物的无水乙腈溶液中完成。从柱子(Controlled PoreGlass，Perspective Biosystems)上裂解下后，用33％的氨水溶液55℃处理18小时进行序列的脱保护。寡核苷酸在乙酸钠存在下经乙醇沉淀法纯化。利用氯化钠梯度洗脱的离子交换层析和乙酸三乙铵存在下的乙腈梯度洗脱的C18反相层析进行高压液相层析检验。
合成的寡核苷酸如表1所述的前11个序列，序号为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.11。下面实施例研究的主题是它们的脱色活性。
在表1中，每个序列末尾处的数字是指该寡核苷酸在原始序列中的位置。
这些序列分别来源于称为“HUMTYRA”的人酪氨酸酶cDNA序列，(Shibahara等人发表于/Tohoku J.Exp.Med.1988，156403(Genbank进入号为M27160))，称为“HSTYRRP”的人TRP-1 cDNA序列(Cohen等人发表于Nucl.Acides Res.1990，182807(Genbank进入号为X51420))以及来源于称为“AF 001295”的另一个TRP-1序列(Box等人发表于Mamm.Genome 1998，950(Genbank进入号为AF 001295))。
另外，为了进行比较以证实本发明的寡核苷酸相对于编码酪氨酸酶或TRP-1的基因或其产物的特异性，在本发明的序列SEQ ID NO.2的基础上合成两条寡核苷酸，命名为*“正义对照”(sense control)序列，如表1中SEQ ID NO.12所示，与序列SEQ ID NO.2的碱基序列相反。
*“混淆对照”(scrambled control)序列，如表1中SEQ ID NO.13所示，与序列SEQ ID NO.2具有相同种类和数目的碱基，但顺序随意放置。
表1
实施例2本发明的寡核苷酸对正常人黑色素细胞(NHMs)的褪色效果。
就实施例1表1中的本发明的寡核苷酸(SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11)对黑色素生成的作用，以及对黑色素细胞生成黑色素的调节能力进行了研究。作为对照，同时对“正义对照”(SEQ ID NO.12)和“混淆对照”(SEQ IN NO.13)寡核苷酸的这种作用进行了研究。
回忆一下，在黑色素生成反应机制中，酪氨酸酶和TRP-1形成酶促复合物，催化L-多巴形成多巴醌，再形成多巴色素。这两个酶协同作用，并且似乎一个酶需要另一个酶存在下起作用。事实上，当用针对TRP-1的反义寡核苷酸使细胞中TRP-1缺乏时，观察到酪氨酸酶(也称作“多巴氧化酶”)的活性也降低。酪氨酸酶因其多功能性质也被称为“多巴氧化酶”；事实上，它在酪氨酸形成多巴的氧化过程中发挥多巴氧化酶的功能。
本检测方法的原理是测量多巴氧化酶将反应底物L-多巴转化成多巴色素的反应速率。通过在一定时间间隔测量光密度来定量生成的多巴色素，从而有可能针对检测中作用的每种寡核苷酸及对照实验计算多巴氧化酶的反应速率。进而根据获得的结果有可能评价检测的寡核苷酸对黑色素生成的作用。与对照实验相比反应速率的下降对应于酶活性的下降，因而对应于黑色素的形成减少及褪色效果。黑色素细胞培养物的制备及用寡核苷酸的处理黑色素细胞从白种人的儿童包皮中获得。将皮肤碎片用PBS(Gibco，Paisley，GB)冲洗，然后用70％乙醇冲洗。最后用PBS冲洗后，将皮肤切成含有最少真皮的1mm的细条。将皮肤细条在0.25％的胰蛋白酶溶液(Gibco，Paisley，GB)中4℃温育过夜，分离真皮和表皮。温育后，用手术刀刮下表皮的细胞以回收表皮细胞。将细胞置于含有10％(V/V)胎牛血清(Gibco，Paisley，GB)的E-199培养基(Gibco，Paisley，GB)中终止胰蛋白酶的反应。匀浆并去除表面漂浮的角质细胞后，将细胞悬液过滤并离心，将沉淀置于贴壁培养基中(培养基1)，培养基的组成如下表所示，其中EGF指表皮生长因子。
细胞计数后，以200000/cm2的比例接种于培养瓶中，于37℃、饱和湿度、5％CO2培养细胞。细胞贴壁后，将贴壁培养基换成KSFM培养基(Gibco，Paisley，GB)，每48小时换液一次。
这样培养的表皮细胞可以获得角质细胞-黑色素细胞的共培养物，当其培养物达到大约70％的铺满率时，用选择培养基(培养基2)替换KSFM培养基，该选择培养基可以刺激黑色素细胞的生长，其组成如下表所示，其中IBMX代表3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，PMA代表12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇。
48至72小时后，用0.1％胰蛋白酶和0.05％EDTA混合溶液(Gibco，Paisley，GB)室温处理细胞1-2分钟，将细胞从培养瓶上消化下来。将细胞悬液离心后重悬于选择培养基中。24-48小时后，重新用胰蛋白酶-EDTA混合液(0.1％-0.05％)室温处理细胞1-2分钟，然后重新接种于特异适于黑色素细胞的增殖培养基中(培养基3)。
培养基3由10％的培养基2和90％的培养基A组成，培养基A是角质细胞培养基SFM(Gibco，17005-034)。
此时，获得了纯的、专门由正常人黑色素细胞(NHMs)组成的细胞群。
在研究前，将NHMs细胞置于不含有强代谢刺激物的培养基中一周，如佛波醇酯或IBMX(培养基4)。
培养基4由10％的培养基B和90％的上述培养基A组成。培养基B的组成如下表所示。
将NHMs接种于96-孔细胞培养板中(Falcon，Franklin Lakes，NJ，USA)，每孔含200μl培养基4,10,000个细胞。
在研究的培养基中临时配制要检测的寡核苷酸，浓度分别为10nM、100nM、250nM、500nM和1μM。各种寡核苷酸的处理每天做一次，持续7天，每个浓度做3个实验。代表多巴氧化酶活性的反应速率的测量在7天处理的结束时，测量酪氨酸酶或“多巴氧化酶”的活性。
用PBS冲洗细胞，然后每孔加入50μl裂解缓冲液(含0.5％TritonX100(Sigma，T-9284)的PBS(Gibco，14190-0947))，并且在4℃振荡平板1小时。在每孔中加入50μl底物(10mM L-多巴，Sigma)启动反应。每隔2分钟在450nM检测产生的多巴色素，在常规振荡下，用340 ATTC(SLT-Labinstrument，Grdig/Salzburg，Austria)型平板光密度读数仪37℃下检测1小时。计算反应速率，表述为10-4OD单位/分钟(10-4OD units/min)。
经过寡核苷酸处理的培养物和对照培养物(未经处理)的检测结果如表2所示(δ标准偏差)。
表2
从表2结果很明显地看出，用本发明的寡核苷酸(SEQ ID NO.1-SEQID NO.11)处理黑色素细胞引起代表多巴氧化酶活性的反应速率下降。经寡核苷酸SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6处理的下降尤为明显。
另一方面，发现用与寡核苷酸SEQ ID NO.2对比的，命名为“正义对照”SEQ ID NO.12和“混淆对照”SEQ ID NO.13的寡核苷酸在每一浓度处理后，代表多巴氧化酶活性的反应速率有所提高。例如，100nM浓度下，“正义对照”和“混淆对照”的反应速率分别增加2.2％和11.7％，而应用本发明的反义寡核苷酸SEQ ID NO2时，下降28.8％。
从后一结果可以推断，本发明的寡核苷酸降低代表多巴氧化酶活性的反应速率的活性是由于该寡核苷酸与编码酪氨酸酶或TRP-1的靶信使RNA的特异性杂交的结果。
因此，这种寡核苷酸/mRNA相互作用可阻止靶信使RNA携带的信息的翻译，因此导致酪氨酸酶或TRP-1的细胞内表达的下降(这取决于所应用的反义序列)。换句话说，这种相互作用将降低酪氨酸酶或TRP-1的新合成。由于这些酶的天然再生，导致了细胞中酪氨酸酶和TRP-1的量的下降，从而引起这些酶在维持黑色素合成的活性上的下降。实际上，本发明的寡核苷酸通过降低酪氨酸酶和TRP-1的再生起作用，而不是作用于黑色素细胞中已经存在的酪氨酸酶。
对黑色素细胞的这种作用的结果是这些细胞合成黑色素的能力降低，因此，根据具体情况以及涉及的个体，将产生漂白或褪色效果。实施例3本发明的寡核苷酸对来源于黑白混血成年供体的正常黑色素细胞的褪色效果。
这里所用的黑色素细胞取自黑白混血成年供体的大腿皮肤。皮肤碎片用PBS(Gibco，Paisley，GB)冲洗，然后用在PBS中稀释成50％的70％(V/V)乙醇冲洗。PBS冲洗后，用角膜刮刀刮皮肤碎片。刮下来的碎片用0.05％的胰蛋白酶(Difco Laboratories，West Molesy，GB)37℃处理1小时以便其离散。表皮细胞然后用含10％胎牛血清(FCS，Gibco，Paisley，GB)的E-199培养基回收。匀浆及去除漂在表面的角质层部分后，将细胞悬液过滤并离心。将获得的细胞沉淀置于实施例2所述的培养基1中。细胞计数，并在Thoma小室上用苔酚兰排出实验检测细胞活力。最后将表皮细胞以80000个/cm2的比例接种于培养瓶的培养基1中，在37℃饱和湿度、5％CO2条件下培养。
用培养基6代替培养基1，培养基6的组成如下表所示，其中B-FGF代表一种碱性成纤维细胞生长因子，PdBu代表12，13-二丁酸佛波醇酯。
该培养基每48小时更换一次，持续1-2周。
黑色素细胞经过筛选之后，用培养基7代替培养基6刺激NHM的增殖。
培养基7由10％的培养基C和90％的上述的培养基A组成。补加的PdBu(Sigma，P-1269)在培养基的最终浓度为0.25ug/ml。
此时，获得的细胞是只含有NHMs的纯细胞群。
将NHMs细胞接种于96-孔细胞培养板的培养基6中(Falcon，Franklin Lakes，NT，USA)。24小时后，用培养基8代替培养基6，在该研究的以后全部过程中都将应用培养基8。培养基8的组成如下所示。
寡核苷酸SEQ ID NO.2临时加到研究的培养基中，浓度为50nM，100nM，250nM，500nM和1μM。这种处理每天进行一次，持续7天。每个浓度做6次实验。代表多巴氧化酶活性的反应速率的测量在每次7天处理结束，测量多巴氧化酶的活性。测量方法同实施例2中的相同，计算反应速率，表示为10-4OD units/min。
经过寡核苷酸SEQ ID NO2处理的培养物和未经处理的对照培养物的结果如表3所示(δ标准偏差)。
表3
从以上结果可以看出，从较低浓度的寡核苷酸(100nM)到高于这个浓度，代表多巴氧化酶活性的反应速率明显降低。
因此，就象在实施例2的结论中陈述的那样，本发明的所述寡核苷酸可以降低黑色素细胞合成黑色素的能力。本实验证明这种降低与所涉及的人的遗传特性无关。
在本实施例中，由于涉及的黑白混血供者具有与深色肤色相应的基础色素沉着，因此本发明的寡核苷酸的使用会引起漂白效应，也就是使肤色变淡。实施例4本发明所述寡核苷酸对于紫外线诱导的正常人黑色素细胞中的黑色素形成的抑制作用的研究。
继以上实施例的结果之后，本实验的目的是证实本发明的寡核苷酸对由刺激而活化的黑色素细胞是否也有作用，本实验中的刺激为UVB紫外线辐射(280-320nM)。换句话说，是为证实寡核苷酸对受到黑色素生成刺激的黑色素细胞中的多巴氧化酶活性的独立的降低能力。
为此，本实验涉及的黑色素细胞来源白种成年人供体。此处所用的黑色素细胞取自乳房整形术的皮肤。获得这些黑色素细胞的技术方法与实施例3中应用和描述的相同。
在35mm的平皿中进行实验。在每个35mm平皿(Falcon，FranklinLakes，NJ，USA)中接种250000个黑色素细胞和2ml培养基8。培养基8的组成如实施例3所述。细胞接种24小时后用寡核苷酸SEQ ID NO.2处理和8mJ/cm2UVB辐射(Bio-Energie，Vilbert-Lourmect，marne-la-Vallée，France)。
在每次UVB辐射前，将NHMs放入PBS(2ml/平皿)中。照射后，细胞重新置于2ml的培养基8中，培养基8中可含有或不含有寡核苷酸SEQID NO.2。
将寡核苷酸SEQ ID NO.2临时加入研究培养基(实施例3中的培养7)中，浓度为100nM、250nM和500nM。
每天用寡核苷酸处理，持续9天。照射每天一次，除了第5天和第6天。每个浓度做3次实验。代表多巴氧化酶活性的反应速率的测量处理结束，也就是9天的寡核苷酸处理和7轮的照射后，测量多巴氧化酶的活性。
为此，用500μl 0.1％胰蛋白酶-0.5％EDTA将NHMs从平皿上消化下来，置于1.5ml不含酚红的E-199培养基(Gibco)中，并且补加10％的胎牛血清。一等份细胞悬液用以细胞计数，另一等份离心，将获得的黑色素细胞沉淀置于50μl裂解缓冲液中，按实施例2所述方法测量代表多巴氧化酶活性的反应速率。
计算代表多巴氧化酶活性的反应速率，表示为10-4OD units/min/106NHMs，结果如表4所示(δ标准偏差)。
表4
以上结果清楚表明，本发明的寡核苷酸可以明显降低代表受到UVB辐射作用刺激的黑色素细胞中多巴氧化酶活性的反应速率。
因此，本发明的寡核苷酸不但可以降低基础活性状态下的黑色素细胞的合成黑色素的能力，如以前实施例所证明，也可以降低活化状态下的黑色素细胞的能力。因此，这些寡核苷酸可以用来特别是预防或弱化因暴露阳光中受到紫外线照射刺激引起的色素沉着。实施例5淡化面部肤色的粉剂微纤维素20.00％月桂基磺基乙酸钠15.00％寡核苷酸(SEQ ID NO.5)(磷酸二酯) 1.00％香料、着色剂、防腐剂适量滑石补足为100％这种粉剂有双重功能。它可以清洁皮肤，另外，经常使用一段时间后，它可以使肤色变淡。每天可在面部使用1-2次。实施例6H用面部褪色乳剂-凝胶甘油 5.00％辛酸/癸酸/琥珀酸甘油三酯 5.00％甲氧基肉桂酸辛酯 1.00％聚二甲基硅氧烷共聚醇 0.50％丙烯酸酯/C10-30丙烯酸烷基酯交联共聚物0.50％寡核苷酸SEQ ID NO.3(磷酸二酯)0.01％中和剂 适量防腐剂、香料、着色剂 适量水 补足为100％某些遇到强度或多或少的日光照射或者阳光直接照射的人，希望保持淡一些的肤色并避免出现色斑，上述的乳剂-凝胶可以达到此目的。该组合物通常在早晨用到面部，具有预防和治疗色素沉着的双重作用，这种色素沉着可以是面部的，甚至不是面部的。实施例7SPF30的预防色斑的防护液挥发性的五环甲基硅酮(pentacyclomethicone)49.00％二氧化钛 15.00％甲氧基肉桂酸辛酯 7.50％甘油 5.00％苯基三甲基硅酮(phenyltrimethicone)5.00％聚二甲基硅氧烷共聚醇 3.00％聚甲基丙烯酸甲酯 2.50％丁基甲氧基二苯甲酰甲烷1.00％寡核苷酸SEQ ID NO.2(磷酸二酯) 0.1％中和剂、香料、防腐剂、抗氧化剂 适量水补足为100％该组合物用于在受到阳光强辐射前预防色斑的出现。应注意的是高浓度的防晒成分可以补偿因黑色素水平下降导致的天然防护功能的下降。实施例8褪色润肤霜甘油硬脂酸酯+PEG-100硬脂酸酯 5.00％氢化聚异丁烯 4.00％抗坏血酸磷酸镁 3.30％甘油三辛酸酯/癸酸酯3.00％角鲨烷 3.00％甘油 2.00％蜂蜡 1.50％十六芳基辛酸酯(Cetearyl octanoate) 1.50％鲸蜡醇 1.00％
十八烷醇 1.00％聚二甲基硅氧烷1.00％黄原酸胶 0.30％乙二胺四乙酸 0.20％柠檬酸0.10％柠檬酸钠 0.10％寡核苷酸SEQ ID NO.6(磷酸二酯) 0.10％中和剂、香料、防腐剂 适量水补足为100％这种霜可以通过弱化或清除老年斑或光照引起的色斑治疗皮肤不规则色素沉着，使肤色均一或淡化。实施例9淡化肤色用润面露乙醇 30.00％PEG-3肉豆蔻醚 5.00％甘油 2.00％丙烯酸聚合物(carbomer) 0.20％聚山梨酸酯20 0.20％寡核苷酸SEQ ID NO.4(硫代磷酸酯)0.01％中和剂、香料、防腐剂 适量水 补足为100％这种淡化肤色用润面露在卸妆及皮肤清洁后使用。实施例10淡化肤色用润肤液水 补足为100％甘油2％乙二胺四乙酸四钠)柠檬酸) 适量使pH＝6
柠檬酸三钠)黄原酸胶 0.25％聚丙烯酰胺、C13/C14异链烷烃、laureth-7 0.5％聚二甲基硅氧烷共聚醇 0.25％寡核苷酸SEQ ID NO.2(磷酸二酯) 0.1％香料、着色剂、防腐剂 适量通常在使用润肤霜前在脸上使用一滴该浓缩液。通常使用该润肤液处理1至2周以达到或维持皮肤的淡化。实施例11淡化头发用的发露水 补足为100％酒精 50％泛酰基乙基醚 0.5％乙酸DL-α-生育酚酯 0.2％聚山梨酸酯60 1％寡核苷酸SEQ ID NO.1(硫代磷酸酯)0.01％香料 0.2％甘油 0.5％着色剂 适量这种发露早晨和晚上用于头发上，持续足够长时间以使头发逐步淡化。这段时间通常为几周。实施例12润手霜(抗斑凝胶-霜)辛酸/癸酸二甘油琥珀酸酯6％辛酸辛酯 2.5％甲氧基肉桂酸辛酯 6％寡核苷酸SEQ ID NO.5(磷酸二酯) 0.001％苯基三甲基硅酮 2.5％苯酮- 30.5％透明质酸钠0.05％汉生胶0.2％丙烯酸酯/C10-C30丙烯酸烷基酯共聚物 0.5％甘油 2％PEG 150 3％中和剂、着色剂、香料、防腐剂 适量纯化水补足为100％这种霜应直接用于手部的老年斑上使其着色弱化。
序列表序列表<110>LVMH研究所<120>寡核苷酸作为褪色剂在调节酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1的表达中的用途<130>343 810<150>FR 00/01730<151>2000-02-11<150>PCT/FR01/00398<151>2001-02-09<160>13<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶相关蛋白基因的cDNA 111-92位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(TRP-Genbank位置号HSTYRRP)<400>1gcaaaacaaa gacctggttt 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶相关蛋白基因的cDNA 102-83位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(TRP-Genbank位置号HSTYRRP)<400>2agacctggtt tgcagctctt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶相关蛋白基因的cDNA 127-108位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(TRP-Genbank位置号HSTYRRP)<400>3tgcttgaaat aagagtgcaa20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶相关蛋白基因的cDNA 53-54位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(TRP-Genbank位置号HSTYRRP)<400>4aaaatccagc tcacaatcct 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶相关蛋白基因的cDNA 141-122位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(TRP-Genbank位置号HSTYRRP)<400>5aggagcactc attctgcttg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶基因的cDNA 475-457位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(Genbank位置号HUMTYRA)<400>6aggaactggc taattggagt 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶基因的cDNA 485-466位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(Genbank位置号HUMTYRA)<400>7caaggtctgc aggaactggc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶基因的cDNA 490-471位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(Genbank位置号HUMTYRA)<400>8cctcacaagg tctgcaggaa 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶基因的cDNA 1332-1313位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(Genbank位置号HUMTYRA)<400>9ctacagacaa tctgccaaga 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶基因的cDNA 506-487位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(Genbank位置号HUMTYRA)<400>10gcattcttcc tctagtcctc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>与编码人酪氨酸酶相关蛋白的DNA 5875-5856位的核苷酸序列互补的反义寡核苷酸(TRP1-Genbank位置号AF001295)<400>11ttccagtacc tcacaatcct 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列ID No.2的反义对照<400>12ttctcgacgtttggtccaga 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>序列ID No.2的随机组合<400>13acgtttctcg cctagtgatg 20
权利要求
1.一种寡核苷酸，其包括7至25个核苷酸，优选地包括20个核苷酸，能与黑色素合成途径中的一种必需酶的编码基因或其产物杂交，其特征在于所述酶选自酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)。
2.权利要求1所述的寡核苷酸，特征在于它能与酪氨酸酶的编码基因或其产物特异地杂交。
3.权利要求1或2所述的寡核苷酸，其能与编码酪氨酸酶的DNA或mRNA特异地杂交。
4.权利要求1所述的寡核苷酸，特征在于它能与TRP-1的编码基因或其产物特异地杂交。
5.权利要求1或3所述的寡核苷酸，其能与编码TRP-1的DNA或mRNA特异地杂交。
6.权利要求1到3之一所述的寡核苷酸，其能与编码酪氨酸酶的基因或mRNA的起始密码子区特异地杂交。
7.权利要求1到3之一所述的寡核苷酸，其能与编码酪氨酸酶的基因或mRNA的编码区特异地杂交。
8.权利要求1到3之一所述的寡核苷酸，基能与编码酪氨酸酶的基因或mRNA的3′非编码区特异地杂交。
9.权利要求1、4或5之一所述的寡核苷酸，其能与编码TRP-1的基因或mRNA的5′非编码区特异地杂交。
10.权利要求1、4或5之一所述的寡核苷酸，其能与编码TRP-1的基因或mRNA的起始密码子区特异地杂交。
11.权利要求1，4或5之一所述的寡核苷酸，其能与编码TRP-1的基因或mRNA的编码区特异地杂交。
12.权利要求1、4或5之一所述的寡核苷酸，其能与编码TRP-1的基因或mRNA的3′非编码区特异地杂交。
13.权利要求6所述的寡核苷酸，其序列为下面序列SEQ ID NO.6至SE QID NO.8中所示的一种-SEQ ID NO.65’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’-SEQ ID NO.75’-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3’-SEQ ID NO.85’-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3’
14.权利要求7所述的寡核苷酸，其序列为下列序列SEQ ID NO.10所示-SEQ ID NO.105’-GCATTCTTCCTCTAGTCCTC-3’
15.权利要求8所述的寡核苷酸，其序列为下列序列5SEQ ID NO.9所示-SEQ ID NO.95’-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3’
16.权利要求10所述的寡核苷酸，其序列为下列序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11中所示的一种-SEQ ID NO.15’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.25’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3’-SEQ ID NO.35’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.45’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.11 5’-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3’
17.权利要求11所述的寡核苷酸，其序列为下列序列SEQ ID NO.5所示-SEQ ID NO.55’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’
18.作为一种新产品的寡核苷酸，其序列为下列序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11中所示的一种-SEQ ID NO.1 5’-GCAAAACAAAGACCTGGTTT-3’-SEQ ID NO.2 5’-AGACCTGGTTTGCAGCTCTT-3′-SEQ ID NO.3 5’-TGCTTGAAATAAGAGTGCAA-3’-SEQ ID NO.4 5’-AAAATCCAGCTCACAATCCT-3’-SEQ ID NO.5 5’-AGGAGCACTCATTCTGCTTG-3’-SEQ ID NO.6 5’-AGGAACTGGCTAATTGGAGT-3’-SEQ ID NO.7 5’-CAAGGTCTGCAGGAACTGGC-3’-SEQ ID NO.8 5’-CCTCACAAGGTCTGCAGGAA-3’-SEQ ID NO.9 5’-CTACAGACAATCTGCCAAGA-3’-SEQ ID NO.10 5’-GCATTCTICCTCTAGTCCTC-3’-SEQ ID NO.11 5’-TTCCAGTACCTCACAATCCT-3’
19.上述权利要求之一所述的寡核苷酸，在它的糖组分、核苷组分或核苷酸间主链上包括一个或多个化学修饰，所述的化学修饰赋予了所希望的物化特性，如增加的生物可利用性、对靶序列的亲和力的增加、细胞内在化的增加、或者更好的生物学稳定性或在细胞内核酸酶存在下稳定性的增加。
20.权利要求20所述的寡核苷酸，特征在于它的糖组分包含2′-O-氟代或2′-O-烷基的取代基，优选2′-O-乙氧基甲基或2′-O-甲基取代基。
21.权利要求20或21所述的寡核苷酸，特征在于其核苷酸间主链上的一些磷酸二酯基被硫代磷酸酯基取代。
22.权利要求20或21所述的寡核苷酸，特征在于其核苷酸间主链上的一些磷酸二酯基被甲基膦酸酯基取代。
23.权利要求22所述的寡核苷酸，特征在于所有的磷酸二酯基被硫代磷酸酯基取代。
24.权利要求23所述的寡核苷酸，特征在于所有的磷酸二酯基被甲基膦酸酯基取代。
25.权利要求22和23所述的寡核苷酸，特征在于磷酸二酯基全部或部分地被硫代磷酸酯基和/或甲基膦酸酯基取代。
26.权利要求1至26之一所述的寡核苷酸，其上接枝了线性的核酸类或肽类载体或者环状质粒类载体。
27.以上权利要求之一所述的寡核苷酸，作为一种医用产品。
28.美容或皮肤护理组合物，其包含至少一种权利要求1至27之一所述的寡核苷酸和美容或皮肤护理上可接受的介质。
29.权利要求29所述的美容或皮肤护理组合物，其包含一种或多种选自下列物质的活性剂鞣花酸及其衍生物；间苯二酚及其衍生物；维生素C及其衍生物；泛酸磺酸酯及其衍生物；可直接或间接干扰α-促黑素(α-MSH)或其受体或促肾上腺皮质激素(ACTH)的分子；多羟基化合物，如甘油、乙二醇或丙二醇；维生素；溶角蛋白剂或脱皮剂，如水杨酸及其衍生物；α-醇酸，如乳酸或苹果酸，可以是单独的或接枝的；抗坏血酸及其衍生物；视黄酸；视黄醛；视黄醇及其衍生物，如棕榈酸酯、丙酸酯或乙酸酯，它们是或不是脂质体制剂形式；antiglycation剂或抗氧化剂，其单独或联合使用，如生育酚及其衍生物、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、三磷酸腺苷；抗炎剂，如甘草亭酸十八烷基酯；润肤剂及其混合物，化学的或物理的防晒剂，如微粉化氧化锌，氧化钛，丁基甲氧二苯甲酰基甲烷和甲氧基肉桂酸辛酯；以及脱氧核糖核酸或核酸。
30.权利要求29或30所述的组合物，特征在于寡核苷酸占组合物总重量的0.00001％到10％，优选地0.0003％到3％。
31.权利要求29到31之一所述的美容或皮肤护理组合物，特征在于它以适于局部应用的通常形式提供，并且特别是含水的、水-醇的或油的溶液，水包油、油包水或多相乳液形式，水或油性凝胶形式，液体的、糊状的或固体无水的产品形式，聚合颗粒的分散物，如在水相或油相中的小球和小胶囊，或者是离子或非离子型脂囊泡的分散体形式。
32.一种寡核苷酸作为美容剂的用途，该寡核苷酸包含7到25个核苷酸，优选地为20个核苷酸，其能与参与黑色素合成途径的一种必需酶的编码基因或其产物杂交，所述必需酶选自酪氨酸酶和TRP-1。
33.权利要求33所述的寡核苷酸在褪色或漂白人类皮肤、体毛或头发中的用途。
34.权利要求1至27之一所述的一种寡核苷酸在制备医用产品上的用途，该医用产品用来通过局部途径治疗或预防酪氨酸酶和/或TRP-1过度表达引起的疾病。
35.权利要求1至27之一所述的一种寡核苷酸在制备抑制黑色素合成的医用产品中的用途。
36.权利要求36所述的一种寡核苷酸在治疗或预防黑色素细胞过度活化引起的局部过度色素沉着，如特发性黑斑病，由于良性的黑色素细胞的过度活化和增殖引起的局部过度色素沉着，如老年斑，以及意外的过度色素沉着，如光致敏或瘢痕性过度色素沉着中的用途，以及在治疗某些白斑病，如白斑中的用途。
37.权利要求35或36所述的寡核苷酸在制备用于褪色或漂白皮肤的医用产品中的用途。
38.权利要求1至27之一所述的一种寡核苷酸在调节酪氨酸酶或TRP-1的表达中的用途。
39.权利要求35至38之一所述的一种寡核苷酸在制备一种医用产品中的用途，该医用产品可以同时或分别或以随时间扩散的方式与以下一种或多种活性剂组合使用鞣花酸及其衍生物；氢醌；熊果苷；间苯二酚及其衍生物；维生素C及其衍生物；泛酸磺酸酯及其衍生物；曲酸；胎盘提取物；可直接或间接干扰α-促黑素(α-MSH)或其受体或促肾上腺皮质激素(ACTH)的分子；多羟基化合物，如甘油、乙二醇或丙二醇；维生素；溶角蛋白剂或脱皮剂，如水杨酸及其衍生物；α-醇酸，如乳酸或苹果酸，可以是单独的或接枝的；抗坏血酸及其衍生物；视黄酸；视黄醛；视黄醇及其衍生物，如棕榈酸酯、丙酸酯或乙酸酯，其是或不是脂质体制剂形式；antiglycation剂或抗氧化剂，可以单独或联合使用，如维生素E(生育酚)及其衍生物、硫代牛磺酸、亚牛磺酸、氨基胍、硫胺素焦磷酸、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、三磷酸腺苷；抗炎剂，如甘草亭酸十八烷基酯；润肤剂及其混合物，化学的或物理的防晒剂，如微粉化氧化锌，氧化钛，丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷和甲氧基肉桂酸辛酯；以及脱氧核糖核酸或核酸。
全文摘要
本发明涉及新型寡核苷酸序列及其衍生物。这些寡核苷酸序列能与编码酪氨酸酶的基因或其产物特异地杂交，或者与编码酪氨酸酶相关蛋白1(TRP－1)的基因或其产物特异地杂交。本发明还涉及这些新型寡核苷酸作为褪色或漂白剂在美容组合物或皮肤护理组合物中的用途。
文档编号A61K8/33GK1411508SQ0180602
公开日2003年4月16日 申请日期2001年2月9日 优先权日2000年2月11日
发明者R·库弗斯特, R·乔里 申请人:Lvmh研究公司