专利名称：克列维醇在制备酪氨酸酶抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种克列维醇，尤其是涉及一种来源于红树林内生真菌一矮棒曲霉BYY-1(A.clavatonanicus)真菌代谢产物克列维醇作为酪氨酸酶抑制剂在医药品、化妆品及食品领域的用途。
背景技术：
酪氨酸酶广泛存在于人、动物、植物和微生物中，是一种以Cu2+为辅助因子的金属酶。该酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用，是黑色素合成过程的限速酶。它能够催化单酚羟化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。酪氨酸酶的活性与黑色素合成量密切相关，在人体内的活性增高会导致产生黄褐斑、雀斑、老人斑等色素沉着性疾病。食物(果蔬、虾、蟹等)中的酪氨酸酶会引起食物在加工及贮藏过程中的褐变反应，导致食品品质变差，货架期缩短(1、Slominski A，Tobin DJ，Shibahara S，et al.Melanin pigmentation in ammalian skin and its hormonal regulation.Physiol Rev，2004，841155-1228；2、丁大鹏，马文丽，郑文岭.酪氨酸酶抑制剂的研究进展.实用医学杂志，2005，211364-1366)。
鉴于酪氨酸酶与人体健康疾病的关系十分密切，而且又是影响食品质量的主要原因，因此寻找具有抗酪氨酸酶的活性化合物，已成为制药、食品及化妆品等不同领域的研究开发热点。
目前，已有不少来源于化学合成和天然产物的酪氨酸酶抑制剂作为药品、化妆品或食品添加剂使用。已普遍应用的酪氨酸酶抑制剂有氢醌、曲酸、壬二酸、熊果苷和黄酮类化合物等。但现有的酪氨酸酶抑制剂在活性、稳定性或安全性等多方面存在着不同程度的缺陷。例如氢醌作为酪氨酸酶抑制剂使用一定时间后，会引起对皮肤的原发性刺激反应、接触性皮炎和炎症后新的色素沉着，从而可能会导致皮肤颜色进一步加深。因此，继续寻找活性高、安全性好、性质稳定的酪氨酸酶抑制剂仍然具有十分重要的意义。
海洋真菌种类多，分布广，既可生活在水体和底泥中，又可栖息在红树植物、海绵、珊瑚、海鞘、海藻等不同的海洋动植物体上。国内外对海洋真菌的系统研究起步较迟，对其代谢产物化学及生物活性的研究水平远不及陆生真菌，但近几年来研究进展较快，目前已从这类真菌中分离并鉴定了许多活性化合物，其中有些具有很强的抑制酪氨酸酶活性(1、BugniT S，Ireland C M.Marine-derived fungia chemically and biologically diverse group ofmicroorganisms.Nat.Prod.Rep.，2004，21143-163；2、Imada C，Sugimoto Y，Makimura T，kobayashi T，Hamada N，Watanabe E.Isolation and characterization of tyrosinaseinhibitorproducing microorganisms from marine environment.Fisheries science.2001，671151-1156.)。已有的研究结果表明海洋真菌代谢产物中蕴藏着许多具有生物活性的新化合物，是开发活性物质的宝贵资源。
红树植物内生真菌是海洋真菌的重要成员，这类微生物能产生许多与宿主植物相同或不同的活性代谢产物，包括一些在陆栖微生物中未曾发现过的生物活性物质，是发掘天然的酪氨酸酶抑制剂的重要资源，但目前鲜见从这类真菌中寻找酪氨酸酶抑制剂乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究开发报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇在制备酪氨酸酶抑制剂的应用。
本发明所用的红树林内生真菌为矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NOM206063。
本发明所述的克列维醇(clavatol)为2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化学结构式如下 所述的克列维醇的制备方法为1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的种子培养A.配制斜面培养基马铃薯去皮切块，放入海水中，煮后过滤，滤液用海水定容，得马铃薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及琼脂，分装试管，灭菌后制成斜面培养基。将矮棒曲霉BYY-1转接至斜面培养基上培养。
B.配制种子液在马铃薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分装后灭菌，得种子培养基。将上述培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，摇瓶培养，得种子液。
C.种子罐种子培养先配制种子培养基(配方同上)，将种子培养基装入种子罐，将上述培养的种子液接入种子罐中，培养后得培养后的种子液。
2、克列维醇的发酵配制发酵培养基(配方同种子培养基)，将发酵培养基装入发酵罐，将上述培养后的种子液接入发酵罐中，发酵后得发酵液。
3、克列维醇的提取将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩后用有机溶剂萃取，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
4、克列维醇的精制浸膏用甲醇溶解得克列维醇甲醇溶液，在克列维醇甲醇溶液中加入硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯(石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100)为洗脱剂梯度洗脱，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为(50～3)∶1时的洗脱液，合并洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加溶剂溶解后重结晶至少2次，得目标产物，即克列维醇。
在步骤1)中，配制斜面培养基的马铃薯去皮切成小块，取150～300g放入1L 20％～100％海水(海水与自来水按体积比混合)中，煮后过滤，滤液用20％～100％海水定容至1000ml，得马铃薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖10～30g，琼脂1.5～3.0g，分装试管，121℃灭菌30min后制成斜面培养基，将矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)转接至斜面培养基上后25～32℃下培养3～7d；配制种子液时，在每升马铃薯汁(制备方法同上)中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分装后灭菌(121℃，30min)，得种子培养基，将上述培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，25～32℃下，120～250r/min摇瓶培养2～5d，得种子液；种子罐种子培养时，将种子培养基装入种子罐的装罐量为种子罐容积的60％～70％，将上述培养的种子液按接种量2％～10％接入种子罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～220r/min和通气量0.3～1.2vvm的条件下培养2～4d，得培养后的种子液。
在步骤2)中，配制发酵培养基时，将发酵培养基装入发酵罐的装罐量为发酵罐容积的60％～70％，将上述培养后的种子液按接种量5％～10％接入发酵罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～200r/min和通气量0.3～1.5vvm的条件下发酵4～7d，得发酵液。
在步骤3)中，将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至发酵液体积的35％～20％后用有机溶剂萃取至少2次，收集有机相并减压浓缩成浸膏，有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一种。
在步骤4)中，在克列维醇甲醇溶液中加入质量为浸膏5～10倍的硅胶拌样，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为(50～3)/1时的洗脱液。溶剂选自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种。
所得的化合物无色针状晶体，mp180～182℃，ESIMSm/z(rel.int.)179.0[M-H]-；1H-NMR和13C-NMR(500MHz，DMSO，ppm)数据见表1。经谱图综合解析结果证实该化合物为克列维醇。
表1.克列维醇的NMR数据
经药理实验证实该化合物具有显著的抑制酪氨酸酶活性，可用于制备酪氨酸酶抑制剂并应用于医药品、化妆品及食品中。本发明所述的来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇可通过发酵制得，无原材料之忧，且提取精制方法简单，适合规模化生产。
图1 克列维醇对酪氨酸酶活力的影响。在图1中，横坐标为Clavatol(μg/ml)，纵坐标为Inhibitior(％)。
图2 clavatol对蘑菇酪氨酸酶抑制机理的判断。在图2中，直线0，1，2，3，4的克列维醇浓度分别为1.67μg/ml，3.33μg/ml，5.0μg/ml，6.67μg/ml。横坐标为CE/μg·ml-1，纵坐标为Activity/μmol·L-1。
图3化合物clavatol对mushroom tyrosinase抑制作用的Lineweaver-Burk双倒数作图。在图3中，横坐标为S-1/mmol-1·L，纵坐标为v-1/μmol-1·L·min。
具体实施例方式
下面结合具体实例进一步阐述本发明。
实施例1A.培养基配方斜面培养基配方每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取200g放入1L 50％海水中，煮30min，过滤，滤液用50％海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖20g，琼脂2.0g。种子培养基配方每升马铃薯汁(制法同上)中添加葡萄糖20g。发酵培养基配方同种子培养基。
B.发酵工艺斜面培养按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min后制斜面。将保存的红树植物内生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌种转接至斜面培养基上，25℃下培养7d。摇瓶培养按种子培养基配方配制培养基，分装500锥型瓶(80ml/瓶)，灭菌(121℃，30min)后将培养的斜面菌种接入，28℃下，140r/min摇瓶培养3d。种子罐培养按种子培养基配方配制培养基，20L种子罐培养基装量为12L，121℃灭菌30min，冷却后将培养的摇瓶种子按接种量2％接入种子罐中，在温度28℃、搅拌转速120r/min和通气量0.5vvm的条件下培养3d。发酵罐培养按发酵培养基配方配制培养基，200L发酵罐培养基装量为120L，121℃灭菌30min，待冷却至28℃后将上述种子罐已培养好的种子按接种量10％接入罐中，在温度28℃、搅拌转速120r/min和通气量0.3vvm的条件下培养7d。
C.克列维醇的提取发酵结束后，发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至原液体积的25％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
D.克列维醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入适量硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯＝50∶1(v/v)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加适量的乙酸乙酯溶解，于室温下重结晶，同法再重结晶4次。
实施例2A.培养基配方斜面培养基配方每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取300g放入1L 100％海水中，煮30min，过滤，滤液用100％海水定容至1000ml)中添加葡萄糖30g，琼脂3.0g。种子培养基配方每升马铃薯汁(制法同上)中添加蔗糖30g。发酵培养基配方同种子培养基。
B.发酵工艺斜面培养按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min后制斜面。将保存的红树植物内生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌种转接至斜面培养基上，28℃下培养5d。摇瓶培养按上述种子培养基配方配制培养基，分装锥型瓶(100ml/瓶)，灭菌(121℃，30min)后将上述培养的斜面菌种接入，28℃下，220r/min摇瓶培养3d。种子罐培养按上述种子培养基配方配制培养基，20L种子罐培养基装量为12L，121℃灭菌30min，冷却后将上述培养的摇瓶种子按接种量5％接入种子罐中，在温度25℃、搅拌转速220r/min和通气量0.5vvm的条件下培养3d。发酵罐培养按上述发酵培养基配方配制培养基，200L发酵罐培养基装量为120L，121℃灭菌30min，待冷却至25℃后将上述种子罐已培养好的种子按接种量5％接入罐中，在温度25℃、搅拌转速220r/min和通气量0.5vvm的条件下培养3d。
C.克列维醇的提取发酵结束后，发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至原液体积的20％后用乙酸乙酯萃取5次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
D.克列维醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入适量硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯＝20∶1(v/v)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加适量的甲醇溶解，于室温下重结晶，同法再重结晶2次。
实施例3A.培养基配方斜面培养基配方每升马铃薯汁(马铃薯去皮切成小块，取150g放入1L 20％海水中，煮30min，过滤，滤液用20％海水(海水与自来水按体积比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖15g，琼脂1.5g。种子培养基配方每升马铃薯汁(制法同上)中添加葡萄糖15g。
发酵培养基配方同种子培养基。
B.发酵工艺斜面培养按上述斜面培养基配方配制培养基，分装试管，121℃灭菌30min后制斜面。将保存的红树植物内生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌种转接至斜面培养基上，32℃下培养5d。摇瓶培养按上述种子培养基配方配制培养基，分装500锥型瓶(120ml/瓶)，灭菌(121℃，30min)后将上述培养的斜面菌种接入，32℃下，180r/min摇瓶培养5d。种子罐培养按上述种子培养基配方配制培养基，50L种子罐培养基装量为30L，121℃灭菌30min，冷却后将上述培养的摇瓶种子按接种量5％接入种子罐中，在温度32℃、搅拌转速180r/min和通气量1.2vvm的条件下培养5d。发酵罐培养按上述发酵培养基配方配制培养基，500L发酵罐培养基装量为120L，121℃灭菌30min，待冷却至32℃后将上述种子罐已培养好的种子按接种量10％接入罐中，在温度32℃、搅拌转速180r/min和通气量1.2vvm的条件下培养5d。
C.克列维醇的提取发酵结束后，发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至原液体积的35％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
D.克列维醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入适量硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯＝10∶1(v/v)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加适量的丙酮溶解，于室温下重结晶，同法再重结晶3次。
实施例4采用分光光度法测定克列维醇对酪氨酸酶抑制的抑制活性在比色杯中先后加入0.1mL含不同浓度的克列维醇(溶于甲醇溶液)，2.8mL的0.5mmol/L L-DOPA(L-3，4-Dihydroxyphenylalanine，)溶液(0.05mol/L磷酸缓冲液配制)，0.1mL蘑菇酪氨酸酶水溶液(133U/ml)，立刻混匀，于Beckman DU650分光光度计，30℃恒温下测定475nm的光密度值随时间的增长直线，从直线的斜率求得酶活力(参见图1)。
将测定结果经回归统计分析软件得到克列维醇对酪氨酸酶的IC50(抑制酶活力50％时的抑制剂浓度)为6.94μmol/L，显示该化合物对酪氨酸酶具有很强的抑制作用。
实施例5在上述测活体系中，固定底物浓度(L-DOPA，0.5mmol/L)，加入不同浓度的克列维醇，改变加入的酶量，测定不同浓度的克列维醇对酪氨酸酶活力的影响，以酶活力对酶量作图得到一组通过原点的直线(参见图2)，且随着化合物浓度的增大，直线的斜率降低。说明克列维醇与酶的结合为可逆结合，是可逆抑制剂。
实施例6在上述测活体系中，固定酶的浓度，改变底物(L-DOPA)的浓度，测定不同浓度的克列维醇对酶活力的影响，以Lineweaver-Burk双倒数作图，得到一组交叉于纵轴的直线(参见图3)，说明该化合物作为酪氨酸酶的抑制剂，不改变酶促反应的最大反应速度(Vmax)，只影响米氏常数(Km)，其抑制类型为竞争性抑制类型。从直线斜率可以求得抑制常数Ki为0.166μmol/L。
权利要求
1.克列维醇的制备方法，所述的克列维醇来源于红树林内生真菌次级代谢产物，红树林内生真菌为矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM206063，所述的克列维醇为2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化学结构式如下 其特征在于包括以下步骤1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的种子培养A.配制斜面培养基马铃薯去皮切块，放入海水中，煮后过滤，滤液用海水定容，得马铃薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及琼脂，分装试管，灭菌后制成斜面培养基，将矮棒曲霉BYY-1转接至斜面培养基上培养；B.配制种子液在马铃薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分装后灭菌，得种子培养基，将培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，摇瓶培养，得种子液；C.种子罐种子培养先配制种子培养基，将种子培养基装入种子罐，将培养的种子液接入种子罐中，培养后得培养后的种子液；2)克列维醇的发酵配制发酵培养基，将发酵培养基装入发酵罐，将培养后的种子液接入发酵罐中，发酵后得发酵液；3)克列维醇的提取将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩后用有机溶剂萃取，收集有机相并减压浓缩成浸膏；4)克列维醇的精制浸膏用甲醇溶解得克列维醇甲醇溶液，在克列维醇甲醇溶液中加入硅胶拌样，上硅胶柱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为50～3∶1时的洗脱液，合并洗脱液并减压浓缩至干，得微黄色晶体，加溶剂溶解后重结晶至少2次，得目标产物，即克列维醇，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100。
2.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，配制斜面培养基的马铃薯去皮切成小块，取150～300g放入1L 20％～100％海水中，煮后过滤，滤液用20％～100％海水定容至1000ml，得马铃薯汁。
3.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，添加葡萄糖或蔗糖的量为10～30g，琼脂1.5～3.0g，分装试管，121℃灭菌30min后制成斜面培养基，将矮棒曲霉BYY-1转接至斜面培养基上后25～32℃下培养3～7d。
4.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，配制种子液时，在每升马铃薯汁中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分装后121℃灭菌30min，得种子培养基，将培养的斜面菌种接入到分装后的种子培养基中，25～32℃下，120～250r/min摇瓶培养2～5d，得种子液。
5.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤1)中，种子罐种子培养时，将种子培养基装入种子罐的装罐量为种子罐容积的60％～70％，将培养的种子液按接种量2％～10％接入种子罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～220r/min和通气量0.3～1.2vvm的条件下培养2～4d，得培养后的种子液。
6.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤2)中，配制发酵培养基时，将发酵培养基装入发酵罐的装罐量为发酵罐容积的60％～70％，将培养后的种子液按接种量5％～10％接入发酵罐中，在温度25～32℃、搅拌转速120～200r/min和通气量0.3～1.5vvm的条件下发酵4～7d，得发酵液。
7.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤3)中，将发酵液过滤除菌体，滤液减压浓缩至发酵液体积的35％～20％后用有机溶剂萃取至少2次，收集有机相并减压浓缩成浸膏。
8.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤3)中，有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一种。
9.如权利要求1所述的克列维醇的制备方法，其特征在于在步骤4)中，在克列维醇甲醇溶液中加入质量为浸膏5～10倍的硅胶拌样，收集当石油醚/乙酸乙酯的体积比例为(50～3)/1时的洗脱液，溶剂选自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种。
10.如权利要求1所述的克列维醇在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用。
全文摘要
克列维醇在制备酪氨酸酶抑制剂的应用，涉及一种克列维醇。提供一种来源于红树林内生真菌次级代谢产物克列维醇在制备酪氨酸酶抑制剂的应用。制备方法为矮棒曲霉BYY－1种子培养；液体深层发酵；发酵液过滤除菌体；滤液减压浓缩后用有机溶剂多次萃取，收集有机相并减压浓缩获得粗提物；粗提物经硅胶柱色谱及重结晶精制后制得克列维醇。经药理实验证实该化合物具有显著的抑制酪氨酸酶活性，可用于制备酪氨酸酶抑制剂并应用于医药品、化妆品及食品中。可通过发酵制得，无原材料之忧，且提取精制方法简单，适合规模化生产。
文档编号C12R1/66GK101070552SQ200710008930
公开日2007年11月14日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者沈月毛, 黄珊珊, 郑忠辉, 杜希萍, 黄耀坚, 宋思扬 申请人:厦门大学