专利名称：含o型口蹄疫病毒ires rna的病毒样颗粒与制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒样颗粒，尤其是涉及一种可在RNA病毒检测中应用的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒及其制备方法。
背景技术：
RNA病毒是以RNA为遗传物质的病毒，例如禽流感病毒、口蹄疫病毒和SARS病毒等。因为这些RNA病毒具有严重的危害性，所以其快速准确的检测就显得至关重要。检测RNA病毒常用的方法有传统的病毒分离试验、血凝抑制试验、病毒中和试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，以及分子生物学检测技术如核酸依赖的扩增技术(NASBA)(Romano J W，Will-iams K G，Shurtliff R N，et al.NASBA technologyisothermal RNA amplification in qualitativeand quantitative diagnostics[J].Immunol.Invest，1997，26(1-2)15-28)、常规RT-PCR、实时RT-PCR技术和PCR-ELISA技术等。其中实时荧光PCR是近几年发展起来的新检测技术，具有分析灵敏度高和简便快捷等方面的优点，在RNA病毒快速诊断中优势明显(Spackman E，Senne D A，Bulaga L L，et al.Development of real-time RT-PCR for the detection of avianinfluenza virus.Avian Dis，2003，47(3Suppl)1079-1082；Heid C A，Stevens J，Livak J K，et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Res，1996，6(10)986-994)。
RNA病毒在PCR基础上的定性和定量检测中，影响因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度和逆转录的效率及试剂的问题等，这些因素均可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差，甚至假阴性的结果，所以RNA病毒的PCR测定必须使用质控品和标准品，才能保证结果的可靠性。传统的RNA病毒扩增检测的质控品和标准品有两种一种为裸露的RNA或者原病毒颗粒，另一种为体外转录cDNA。前者容易被广泛存在的核糖核酸酶降解且具有传染性，后者不能反应样品提取和逆转录过程对测定的影响。
近几年，Pasloske等人提出了一种新的RNA质控品制备技术，即盔甲RNA(armored RNA)技术(Pasloske B L，Walkerpeach C R，Obermoeller R D，et al.Armored RNA technology forproduction of ribonuclease-resistant viral RNA controls andstandards[J].J Clin Microbiol，1998，36(12)3590-3594；Walker Peach C R，Winkler M，DuBois D B，et al.Ribonuclease-resistantRNA controls(Armored RNA)for reverse transcription-PCR，branched DNA，and genotypingassays for hepatitis C virus[J].Clin.Chem，1999，45(12)2079-2085。目前这种技术正逐渐应用于RNA病毒的检测等方面(Hietala S K，Crossley B M.Armored RNA as Virus Surrogate in aReal-Time Reverse Transcriptase PCR Assay Proficiency Panel.J Clin.Microbiol.Jan.2006，67-70)。盔甲RNA技术是指由MS2噬菌体外壳蛋白包裹重组RNA的技术。大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，编码成熟酶蛋白、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子(贾盘兴.噬菌体分子生物学-基本知识和技能[M].北京科学出版社，2001，2-5.)。MS2噬菌体由180个外壳蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成，在MS2噬菌体外壳蛋白的研究中发现，外壳蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可在引发噬菌体外壳组装的同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内(Peabody DS.The RNA binding site of bacteriophage MS2coat protein.The EMBO Journal，1993，12(2)595-600；Peabody D S.Role of the coat protein-RNA interaction in the life cycle ofbacteriophage MS2.Mol Gen Genet，1997，254358-364)。研究发现将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含基因调节元件的5′非编码序列的基因克隆到表达载体中，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和外壳蛋白，并且在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片段的协同作用下，外壳蛋白可组装为成熟的病毒样颗粒，并具备耐RNase作用的特性。如果将MS2噬菌体的这些相关基因和外源片断一起克隆到表达载体中，这一载体可以将外源克隆片断转录成RNA，同时外壳蛋白可以将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，即盔甲RNA病毒样颗粒(Peabody D S.Translational repression by bacteriophage MS2coat proteinexpressed from a plasmid.The journal of biological chemistry.1990，265(10)5684-5689；PickettG G，Peabody D S.Encapsidation of heterologous RNAs by bacteriophage MS2coatprotein.Nucleic Acids Research，1993，21(19)4621-4626)。本发明就是利用以上原理将MS2噬菌体部分基因和口蹄疫病毒IRES基因克隆到表达载体上，进行原核表达得到耐RNase的含口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒。
发明内容
本发明的目的在于针对传统的RNA病毒检测的质控品和标准品存在的易传染、易被核糖核酸酶降解、不能全程监控RNA病毒的检测等问题，提供一种安全、耐核糖核酸酶、稳定性好、易保存、可全程监控RNA病毒提取、反转录、扩增以及最终检测的含有O型口蹄疫病毒IRES(internal ribosoma entry site，内部核糖体进入位点)RNA的病毒样颗粒与制备方法及其应用。
本发明所述的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒是指由MS2噬菌体外壳蛋白包裹含口蹄疫病毒IRES RNA的一种RNA-蛋白复合体，RNA-蛋白复合体的形状为球状，直径为24～28nm，具有耐核糖核酸酶的特性。
本发明所述的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒的制备方法包括以下步骤1.初载体pET32a-CP的构建1)根据MS2噬菌体基因序列，设计引物PCR扩增MS2噬菌体的CP基因，扩增MS2噬菌体的CP基因的引物序列为上游引物5′-CGCGGTACCCCCTTTCGGGGTCCTGCTC-3′，下游引物5′-CGCGGATCCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3′。
2)Kpn I和BamH I双酶切CP片断和质粒pET32a，纯化后进行连接。
3)连接产物转化大肠杆菌，挑阳性单克隆进行PCR和酶切鉴定，最后经测序结果比对以确认正确构建初载体pET32a-CP。
2.终载体pET32a-CP-IRES(简称pCPES)的构建1)根据IRES基因序列，设计引物PCR扩增口蹄疫病毒IRES的基因片断，口蹄疫病毒IRES的序列为CGGTCACCTATTCAGGCGTAGAAGCTTTTTAAACTGGGCACTTTTAAAGAAGTCCCAATCCCCTTCTCAGATCCCGAGTGTCCCGTGTTACCTCGGGGTACCTGAAGGGCATCCTTAG扩增口蹄疫病毒IRES基因片断的引物序列为上游引物5′-TCGAGCGGCCGCGGTC-3′，下游引物5′-CTCGGATCCCTAAGGATGCCC-3′。
2)Not I和BamH I双酶切IRES片断和质粒pET32a-CP，纯化后进行连接。
3)连接产物转化大肠杆菌，挑阳性单克隆进行PCR鉴定，最后经测序结果比对以确认正确构建终载体pET32a-CP-IRES，即pCPES。
3.病毒样颗粒的原核表达将质粒pCPES转化表达宿主菌BL21 E.Coli，把阳性克隆的菌接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，振荡培养，至OD值为0.6～0.8，在28～37℃条件下加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.8～1.5mmol/L，诱导表达4～8h。将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀，超声处理缓冲液重悬菌体沉淀，用超声细胞破碎仪破碎细菌。破碎完全后将细菌破碎物离心，取上清转移到另一干净的离心管，得到所要的表达产物。
4.病毒样颗粒的纯化
配制蔗糖密度不同梯度的4～6种溶液，加入离心管中，得到蔗糖梯度液。在超声破碎的表达产物溶液中加入过量的RNaseA和DNase I，以除去细菌本身的RNA和DNA。将SYBRGreen I加入双酶处理过的表达产物中染色，然后将样品加到离心管的顶端，在超速离心机上离心，把有绿色荧光的部分样品取出，PBS溶液透析，得到纯化的含O型口蹄疫病毒IRESRNA的病毒样颗粒。
在病毒样颗粒的纯化步骤中，配制蔗糖密度不同梯度的4种溶液，蔗糖密度最好分别为15％、25％、35％、45％的溶液。
本发明所述的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒可用于RNA病毒的检测。
本发明具有以下优点1.该病毒样颗粒无传染性、安全可靠，在制备时对实验人员不会造成危害。
2.该病毒样颗粒具有耐核糖核酸酶特性、稳定性好、易保存、运输储存方便。
3.该病毒样颗粒具有与RNA病毒相似结构，即都是蛋白包裹的核酸，因此可以把它加入病毒材料中，一起经历核酸提取，反转录，PCR扩增，对RNA病毒的检测进行全程监控，也避免出现假阴性结果。
4.制备方法简单，成本低廉，利于推广使用。
图1为超声破碎后表达产物的RNaseA和DNase I的双酶消化结果。在图1中，1为加RNaseA消化；2为加DNase I消化；3为加RNaseA和DNase I消化；4为未加酶消化产物；M代表DNA marker DL2000；DNA marker DL2000的核酸片断从上至下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp。
图2为纯化的病毒样颗粒的电镜观察结果。
图3为提取病毒样颗粒中RNA的RT-PCR检测结果。在图3中，M代表DNA marker DL2000；1为RNA反转录后PCR结果；2为RNA未反转录后PCR结果；3为阳性对照；4为阴性对照。DNA marker DL2000的核酸片断从上至下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
图4为病毒样颗粒中RNA一步法反转录实时荧光PCR检测结果。在图4中，横坐标为循环数cycle，纵坐标为荧光强度fluorescence。曲线A为病毒样颗粒RNA一步反转录荧光PCR结果，曲线B为阴性对照。
图5为双色荧光检测禽流感病毒RNA荧光RT-PCR结果。在图5中，横坐标为循环数cycle，纵坐标为荧光强度fluorescence。曲线A、B、C分别为3管禽流感病毒RNA的荧光结果，曲线D为阴性对照。
图6为双色荧光检测病毒样颗粒RNA的结果。在图6中，横坐标为循环数cycle，纵坐标为荧光强度fluorescence。曲线A、B、C分别为3管病毒样颗粒RNA的荧光结果，曲线D为阴性对照。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明。
实施例1含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒的制备方法含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒的制备方法包括以下步骤(1)初载体pET32a-CP的构建以pMS27质粒为模板扩增CP片断，PCR体系为10×PCR buffer 2μl，TaqDNA Polymerase0.2μl(5u/μl)，dNTP 0.5μl(10mmol/L)，模板1μl，上下游引物各0.5μl(10μmol/L)，双蒸水补足20μl。PCR反应条件为94℃变性5min，然后94℃30s，60℃30s，72℃2min，28个循环，最后72℃延伸7min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒纯化回收CP片断。将回收的CP片断和质粒pET32a分别用Kpn I和BamH I酶切，胶回收试剂盒回收双酶切的CP基因和载体pET32a，然后按照如下体系16℃连接过夜目的片段CP 5μl，质粒pET32a1.5μl，连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶0.5μl，RNase 0.5μl(10mg/ml)，ddH2O补足10μl。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，铺板培养12h，挑取单克隆进行PCR和酶切鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-CP。测序结果与已知的序列比对，结果说明CP基因正确克隆到载体pET32a上。
(2)终载体pET32a-CP-IRES(简称pCPES)的构建以pcDNA3-IRES质粒为模板扩增IRES片断，PCR反应体系和条件与CP扩增的体系条件相同。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收IRES片断。利用初载体构建同样的方法，Not I和BamH I酶切质粒pET32a-CP和回收的IRES片断，胶回收酶切的目的产物，并将IRES片断与初载体pET32a-CP连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-CP-IRES，简称pCPES。测序结果与已知的IRES序列比对，同源性为100％。
(3)病毒样颗粒的原核表达将质粒pCPES转化表达宿主菌BL21 E.Coli，挑取阳性单克隆菌接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养。取2ml过夜培养的菌液接种到200ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min振荡培养6h至OD值为0.8。加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在28℃，200r/min条件下诱导表达16h。将菌液4000r/min离心10min，收集菌体沉淀，用STE洗涤两次。重新悬于5ml超声破碎缓冲液中，在冰上超声超声时间20s，间隔时间15s，超声次数20次，重复处理两次。将破碎完全的表达产物4000r/min离心10min，沉淀细胞碎片，收集上清转移到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物。
(4)病毒样颗粒的纯化配制蔗糖密度分别为15％、25％、35％、45％的溶液，加入离心管中，得到蔗糖梯度液。在超声破碎的表达产物溶液中加入过量的RNaseA和DNase I，以除去细菌本身的RNA和DNA。将SYBR Green I加入双酶处理过的表达产物中染色，然后将样品加到离心管的顶端，在超速离心机上离心，把有绿色荧光的部分样品取出，PBS溶液透析，得到纯化的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒。
实施例2超声破碎后表达产物的RNaseA和DNase I的双酶消化鉴定将超声破碎后的表达产物，分别用RNaseA和DNase I进行单酶和双酶消化1h，如图1所示表达产物在用RNaseA和DNase I双酶消化后，可以看到一条1500bp左右的荧光条纹；仅DNase I消化后可以看到细菌RNA的存在；仅RNaseA消化后，细菌RNA已经被降解。表达产物分别在室温放置20d后再进行酶消化，电泳结果均可见表达产物的存在，说明病毒样颗粒具有耐核糖核酸酶的特性且稳定性良好。
实施例3纯化病毒样颗粒的形态观察蔗糖密度梯度离心纯化的病毒样颗粒用醋酸铀染色5min，JM2100电镜观察，如图2所示可以看到直径大约为26nm的圆形颗粒，这就是表达的病毒样颗粒(viral likeparticles，VLPs)。
实施例4病毒样颗粒中RNA的提取和RT-PCR检测将纯化的病毒样颗粒用Trizol法提取RNA，分两份，一份进行反转录，另外一份不进行反转录，然后进行PCR扩增，电泳鉴定。如图3所示提取的RNA经反转录进行PCR扩增后，有FMDVIRES的目的条带；而提取的RNA不经反转录直接PCR扩增后，没有出现目的条带。说明该病毒样颗粒的外壳蛋白包裹的是含口蹄疫病毒IRES的RNA片断。
实施例5病毒样颗粒中RNA一步法反转录实时荧光PCR检测以提取病毒样颗粒中的RNA为模板，进行一步法实时荧光RT-CPR检测。设计了用来检测病毒样颗粒目的基因IRES的探针，序列如下荧光链ROX-5′-TCCCCTTCTCAGATCCCGAGTGTC-3′phosphorylation
淬灭链5′-TCGGGATCTGAGAAGGGGA-3′Dabcyl在20μl反应液中含有4.0mmol/L Mg2+，10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，0.25mmol/LdNTP，0.4μmol/L上游引物，0.4μmol/L下游引物，1.8U Taq DNA聚合酶，0.3U AMV(反转录酶)，0.12U RNase inhibitor，0.2μmol/L荧光链，0.25μmol/L淬灭链，RNA模板1μl。反应条件为42℃反转录30min使模板RNA反转录为cDNA，94℃预变性3min，然后进入循环，循环程序为94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。每次在退火时采集ROX荧光，Rotorgene3000实时荧光PCR仪进行检测。如图4所示模板RNA经反转录PCR扩增后荧光有明显升起。
实施例6双色荧光检测禽流感病毒RNA和病毒样颗粒RNA反转录PCR的结果将病毒样颗粒作为内标，以检测禽流感病毒HA基因为例，设计了等长双链探针来检测HA基因，序列如下荧光链FAM-5′-CCTCTCTTTTTTCTTCTTCTCTCTC-3′phosphorylation淬灭链5′-CTCTCAGAAGAAGAAAAAAGAGAGG-3′DabcylHA基因的引物序列为HAS-15′-CATTCCACAACATACACCC-3’HAS-25′-CAACCATCTACCATTCCCT-3’将禽流感的病毒材料和纯化的病毒样颗粒一起提取RNA，进行反转录PCR扩增，并用双色荧光进行全程检测。在20ul反应液中含有4.0mmol/LMg2+，10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，0.25mmol/L dNTP，3.0U Taq DNA聚合酶，0.3U AMV(反转录酶)，0.12U RNase inhibitor，两对引物各0.4μmol/L，两对探针各0.2μmol/L，模板各1μl，重复3管检测。反应条件为42℃反转录45min，94℃预变性5min，然后进入循环，循环程序为94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。每次在退火时采集FAM和ROX荧光，Rotorgene3000实时荧光PCR仪进行检测。如图5和6所示，FAM和ROX通道的荧光均有升起，说明禽流感病毒和病毒样颗粒RNA反转录PCR扩增正常。
序列表扩增MS2噬菌体的CP基因的引物序列为上游引物5′-CGCGGTACCCCCTTTCGGGGTCCTGCTC-3′，下游引物5′-CGCGGATCCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3′口蹄疫病毒IRES的序列为CGGTCACCTATTCAGGCGTAGAAGCTTTTTAAACTGGGCACTTTTAAAGAAGTCCCAATCCCCTTCTCAGATCCCGAGTGTCCCGTGTTACCTCGGGGTACCTGAAGGGCATCCTTAG扩增口蹄疫病毒IRES的基因片断的引物序列为上游引物5′-TCGAGCGGCCGCGGTC-3′，下游引物5′-CTCGGATCCCTAAGGATGCCC-3′
权利要求
1.含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒，其特征在于是指由MS2噬菌体外壳蛋白包裹含口蹄疫病毒IRES RNA的一种RNA-蛋白复合体，RNA-蛋白复合体的形状为球状，直径为24～28nm，具有耐核糖核酸酶的特性。
2.如权利要求1所述的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)初载体pET32a-CP的构建1)根据MS2噬菌体基因序列，设计引物PCR扩增MS2噬菌体的CP基因，扩增MS2噬菌体的CP基因的引物序列为上游引物5′-CGCGGTACCCCCTTTCGGGGTCCTGCTC-3′，下游引物5′-CGCGGATCCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3′；2)Kpn I和BamH I双酶切CP片断和质粒pET32a，纯化后进行连接；3)连接产物转化大肠杆菌，挑阳性单克隆进行PCR和酶切鉴定，最后经测序结果比对以确认正确构建初载体pET32a-CP；(2)终载体pET32a-CP-IRES的构建1)根据IRES基因序列，设计引物PCR扩增口蹄疫病毒IRES的基因片断，口蹄疫病毒IRES的序列为CGGTCACCTATTCAGGCGTAGAAGCTTTTTAAACTGGGCACTTTTAAAGAAGTCCCAATCCCCTTCTCAGATCCCGAGTGTCCCGTGTTACCTCGGGGTACCTGAAGGGCATCCTTAG扩增口蹄疫病毒IRES基因片断的引物序列为上游引物5′-TCGAGCGGCCGCGGTC-3′，下游引物5′-CTCGGATCCCTAAGGATGCCC-3′；2)Not I和BamH I双酶切IRES片断和质粒pET32a-CP，纯化后进行连接；3)连接产物转化大肠杆菌，挑阳性单克隆进行PCR鉴定，最后经测序结果比对以确认正确构建终载体pET32a-CP-IRES，即pCPES；(3)病毒样颗粒的原核表达将质粒pCPES转化表达宿主菌BL21 E.Coli，把阳性克隆的菌接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，振荡培养，至OD值为0.6～0.8，在28～37℃条件下加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，使其终浓度为0.8～1.5mmol/L，诱导表达4～8h；将诱导后的菌液离心收集菌体沉淀，超声处理缓冲液重悬菌体沉淀，用超声细胞破碎仪破碎细菌；破碎完全后将细菌破碎物离心，取上清转移到另一干净的离心管，得到所要的表达产物；(4)病毒样颗粒的纯化配制蔗糖密度不同梯度的4～6种溶液，加入离心管中，得到蔗糖梯度液，在超声破碎的表达产物溶液中加入过量的RNaseA和DNase I，以除去细菌本身的RNA和DNA，将SYBRGreen I加入双酶处理过的表达产物中染色，然后将样品加到离心管的顶端，在超速离心机上离心，把有绿色荧光的部分样品取出，PBS溶液透析，得到纯化的含O型口蹄疫病毒IRESRNA的病毒样颗粒。
3.如权利要求2所述的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于在病毒样颗粒的纯化步骤中，配制蔗糖密度不同梯度的4种溶液，蔗糖密度分别为15％、25％、35％、45％的溶液。
4.如权利要求1所述的含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒在RNA病毒检测中的应用。
全文摘要
含O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒与制备方法及应用，涉及一种病毒样颗粒。提供一种安全、耐核糖核酸酶、稳定性好、易保存、可全程监控RNA病毒提取、反转录、扩增以及最终检测的含有O型口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒与制备方法及应用。病毒样颗粒是指由MS
文档编号C12N15/42GK101058803SQ20071000884
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者陈亮, 窦敏, 张国广, 张红心, 曾雅明 申请人:厦门大学