专利名称：精子因子oscillogenin的制作方法
技术领域：
本发明涉及卵母细胞单性生殖活化、调节精子生育力和评价精子生育力的组合物和方法。一个组合物包括精子蛋白oscillogenin。
背景技术：
动物饲养领域和人工繁殖技术(ART)需要改进的核转移技术以增加当前正使用的方法的效率和成功率。人工繁殖技术获得的益处很多。例如，胚胎细胞克隆，和移植该克隆胚胎细胞的能力，允许几代遗传学等同动物繁殖。由核转移进行的克隆优于其它方法(如胚胎分裂和胚胎细胞聚合产生胎盘嵌合体)，因为它允许(1)生产多拷贝遗传学等同的动物；(2)特定性状的选择；和(3)低温保存胚胎细胞直到测试完成。
I.核转移1996年报道了首次成功将成年乳腺细胞核转移到去核卵母细胞(Campbell等，Nature 38064-6(1996))。核转移(NT)包括制备作为受体细胞的胞质体。在多数情况下，胞质体来自成熟中期II卵母细胞，其中已经去除了染色体。然后，供体细胞核置于透明带和胞质体之间。电刺激启动融合和胞质体活化。胞质体对供体细胞核的成功重新编程很关键，且它是可能受细胞周期影响的步骤(Wolf等，Biol.Reprod.60199-204(1999))。
已经建立很多使用胎儿细胞作为供体核来源的妊娠。然而，使用细胞系产生转基因动物有利于动物克隆，它允许核转移前在体外对细胞进行基因操作。同上。调节早期胚胎发育的机制在哺乳动物种中可能是保守的，因而，例如牛卵母细胞细胞质可支持导入的、分化的供体核，而不考虑供体成纤维细胞的染色体数量、种类或年龄(Dominko等，Biol.Reprod.601496-1502(1999))。
根据Cibelli等，Science 2801256-9(1998)描述的步骤，活跃分裂的胎儿成纤维细胞可用作核供体。用于供体分化核核转移的受体卵母细胞的另外制备方法可以按国际PCT申请号99/05266；99/01164；99/01163；98/3916；98/30683；97/41209；97/07668；97/07669；和美国专利号5,843,754描述的实施。典型的转移核得自培养的胚胎干(ES)细胞，胚胎生殖(EG)细胞或其它胚胎细胞(如见国际PCT申请号95/17500和95/10599；加拿大专利号2,092,258；英国专利号2,265,909；和美国专利号5,453,366；5,057,420；4,994,384；和4,664,097)。内细胞团(ICM)细胞也可以用作核供体(Sims等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 906143-7(1990)；和Keefer等，Biol.Reprod.50935-9(1994))。
II.卵母细胞中钙诱导和卵母细胞活化在哺乳动物种以及其它动物中，受精以存在钙离子(Ca2+)振荡为特征，在哺乳动物中它可持续几个小时(Miyazaki等，Dev.Biol.118259-67(1986)；Wu等，Dev.Biol.203369-81(1998))；Swann等，R Exp.Zool.285267-75(1999)。这种Ca2+振荡是激发卵活化和启动胚胎发育(同上)所必需的，它由包括皮层颗粒胞吐、恢复减数分裂和第二极体挤出、前核形成、DNA合成和第一次有丝分裂卵裂的事件顺序组成(Kline等，Dev.Biol.14980-89(1992)；and Schultz等，Curr.Topics Dev.Biol.3021-62(1995))。精子启动Ca2+释放的机制未知(Id.)，但提出了三个理论(Swann等，1999)。首先，精子作为膜融合后Ca2+进入卵的引导。其次，精子作为质膜受体刺激卵内磷脂酶C(PLC)产生肌醇1，4，5-三磷酸(InsP3或IP3)。最后，精子可以促使尚未鉴定的精子蛋白引起Ca2+释放。已经表明除了最后一点，其余的都不主要负责卵母细胞活化(Wu等，Dev.Biol.203369-81(1998))。IP3通过与位于内质网和形成四聚体复合体的IP3受体(IP3R)相互作用调节Ca2+释放(Patel等，Cell Calcium25247-64(1999))。注射不可水解的G蛋白的(因而也是PLC的)活化剂GTPγ[S]，可诱导几个物种卵中重复性Ca2+反应，表明这个途径在哺乳动物卵中是功能性的(Miyazaki，J.Cell.Biol.106345-53(1988)；和Fissore等，Biol.Reprod.53766-74(1995))。此外，表明注射IP3也可诱导哺乳动物卵中Ca2+释放(Miyazaki等，1988；Schultz等，1995)。
哺乳动物卵中表达的IP3R有三种确定的同工型(Fissore等，Biol.Reprod.6049-57(1999)；和He等，Biol.Reprod.61935-43(1999))，但IP3R亚型1(IP3R-1)大量表达且量压倒性地高于其它同工型(Parrington等，Dev.Biol.203451-61(1998)；和He等，Biol.Reprod.571245-55(1997))。而且，IP3R-1蛋白在哺乳动物卵中以阶段特异性方式表达，表明在受精中的重要作用。例如，用Western印迹需要低于20只小鼠和牛卵来检测IP3R-1蛋白(He等，1997；Fissore等，1999)，IP3R-1蛋白的量在卵母细胞成熟期间显著增加(Mehhnann等，Dev.Biol.180489-98(1996)；和He等，1997)。受体密度增加导致卵母细胞成熟期间IP3R反应性增加(Fujiwara等，Dev.Biol.15669-79(1993)；和Mehhnann等，Biol.Reprod.511088-98(1994))。此外，受精前，注射阻断IP3R-1单克隆抗体18A10可以剂量依赖性方式抑制小鼠卵中受精相关Ca2+释放和活化(Miyazaki等，Science 257251-5(1992)；and Xu等，Development 1201851-9(1994))。
除了几个其它机制，通过IP3R系统的Ca2+释放可以通过调节IP3R-1蛋白水平来控制。体细胞系研究已经表明IP3R下调跟随着由与PLC偶联的细胞表面受体活化所诱导的IP3产生持续刺激(Wojcikiewicz等，J.Biol.Chem 2697963-9(1994)；Wojcikiewicz等，J.Biol.Chem.27011678-83(1995)；和Sipma等，Cell Calcium 2311-21(1998))。已经表明导致对IP3的细胞反应性降低的IP3R的这种降解是特异性的，因为它不伴一般蛋白降解(Wojcikiewicz等，J.Biol.Chem.27116652-5(1996)；and Bokkala等，J.Biol.Chem.27212454-61(1997))，而与IP3结合IP3R相伴(Zhu等，J.Biol.Chem.2743476-84(1999))，且受参与ubiquinated蛋白降解的多蛋白细胞复合体蛋白酶体的调节(Bokkala等，1997；Oberdorf等，Biochem.J.339453-61(1999))。受精过程中，哺乳动物卵也随它们进展到前核期而显示IP3R反应性降低(Fissore等，Dev.Biol.166634-42(1994)；Jones等，Development 1213259-66(1995)；和Machaty等，Biol.Reprod.56921-30(1997))，且这看来伴随IP3R-1下调(Parrington等，1998；和He等，Biol.Reprod.61935-43(1999))。然而，控制哺乳动物卵中IP3R-1死亡的机制未知。而且，哺乳动物卵的单性生殖活化(其使用已随克隆技术的到来而普及)可用几种刺激单一或多个Ca2+升高的激动剂诱导，但尚未确定它们对IP3R-1数量的作用。因此，我们研究了控制小鼠卵中IP3R-1下调的信号机制，包括蛋白酶体途径可能参与。
精子胞质因子是卵母细胞活化必需的(Stice等，Mol.Reprod.Dev.25272-80(1990)and Swann等，Devel.1101295-302(1990))。哺乳动物卵母细胞活化包括退出减数分裂并以次级卵母细胞进入有丝分裂细胞周期，和细胞内前核的形成和迁移。因此，卵母细胞活化需要细胞周期转变。尽管受精(美国专利号5,496,720)和精子胞质成分(Swann等，1990)可诱导Ca2+振荡，但是诱导单一或多个Ca2+振荡的单性生殖处理也可诱导活化。可使用单性生殖活化制备用于核转移的卵母细胞。
单性生殖是胚胎细胞在不存在雄配子的任何贡献的情况下从雌配子得到的结果，伴或不伴最终发育为成年(美国专利号5,496,720)。哺乳动物卵母细胞的单性生殖活化可如下实施(1)使用电休克、电穿孔或电刺激；(2)离子霉素和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)联合处理；(3)钙离子载体A23187和6-DMAP联合处理(Susko-Parrish等，Dev.Biol.166729-39(1994)；Mitalipov等，Biol.Reprod.60821-7(1999)；Liu等，Biol Reprod.611-7(1999)；和美国专利号5,496,720)。后两种方法使用钙离子载体与蛋白激酶抑制剂联合，它对于诱导蛋白激酶抑制剂释放很重要(Mayes等，Biol.Reprod.53270-5(1995))。
用于卵母细胞活化的其它二价阳离子包括镁、锶、钡，如以离子载体的形式。也可以通过电休克、乙醇处理和支架螯合剂处理卵母细胞的方法增加二价阳离子水平。添加激酶抑制剂(如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如6-二甲基氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)可降低卵母细胞磷酸化(美国专利号5,945,577)。可供选择地，向卵母细胞中导入磷酸酶可抑制卵母细胞蛋白磷酸化(如磷酸酶2A和磷酸酶2B)(Id.)。
可供选择地，可以通过使用已知的活化试剂完成活化。例如，已经表明核转移后，受精时精子穿过卵母细胞产生更大数量有活力的妊娠和多个遗传学等同的小牛。而且，融合后，可以用电子和化学休克处理来活化NT胚胎。合适的卵母细胞活化方法是美国专利号5,496,720，Susko-Parrish等的主题，这里以其完整形式引入作为参考。
Oscillin.几个组假定精子通过诱导Ca2+振荡的蛋白活化卵母细胞。推定的蛋白是oscillogen(Parrington等，Nature 379364-8(1996))。Oscillin是第一个鉴定的oscillogen，据信可诱导卵母细胞细胞内钙释放(Id.)。oscillin实际上是氨基葡萄糖6-磷酸脱氨基酶(Wolosker等，FASEB J1291-9(1998))。然而，尽管有据称证明oscillogen诱导卵母细胞活化的程度与用精子细胞核注射卵母细胞相同的实验(Sasagawa等，J.Urol.1582006-8(1997)；Wolny等，Mol.Reprod.&Dev.52277-87(1999))，后来证明oscillin不是负责卵母细胞中Ca2+释放的精子蛋白(Wolosker等，(1998)；and Wu等，Dev.Biol.203369-81(1998))。结果，仍不知道负责卵母细胞活化的精子因子(Wolny等，1999)。
III.制备用于核移植或核转移的体细胞为了动物饲养业，可以使用胚胎干细胞(ES)、内细胞团细胞(ICMs)和体细胞进行核转移。
胚胎干细胞.已开发了使用ES细胞产生转基因动物的另一个系统。在小鼠中，ES细胞使得研究者可以选择转基因细胞并实施基因寻靶。这个方法允许比其它转基因技术可能进行的更多的基因工程改造。例如，ES细胞在体外相对容易长成集落，可通过标准步骤转染和通过抗生素抗性克隆选择转基因细胞(Doetschman，″Gene transfer inembryonic stem cells.″IN TRANSGENIC ANIMAL TECHNOLOGYALABORATORY HANDBOOK 115-146(C.Pinkert，ed.，Academic Press，Inc.，New York 1994))。而且，这个方法的效率是可产生足够的转基因集落(成百至上千)允许第二次选择同源重组体(Id.)。然后ES细胞可与正常宿主胚胎联合，并且由于它们保持着其潜能而可以在所得杂合动物中发育为所有组织，包括生殖细胞。因此，转基因改变可传递给后代。
在体外从早期移植前小鼠胚胎产生胚胎干细胞(ES)系的方法是熟知的(Evans等，Nature 29154-6(1981)；and Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 787634-8(1981))。ES细胞可以以未分化状态传代，只要存在成纤维细胞的饲养层(Evans等，1981)或分化抑制源(Smith等，Dev.Biol.1211-9(1987))。
基于它们将其基因组转移给下一代的能力，ES细胞具有对家畜动物进行种系操作的潜在用途。有些研究组已经报道了多能干细胞的分离。例如，Notarianni等，J Reprod.Fert.Suppl.4355-260(1991)报道了从猪和绵羊胚泡建立稳定的多能细胞系，它与从绵羊胚泡免疫外科分离的内细胞团(ICMs)原代培养细胞在一些形态和生长特性上相似。而且，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.4151-56(1990)公开了从猪胚泡分离胚胎细胞系，它不需要小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，并报道了培养过程中分化为几种不同的细胞型。
此外，Saito等，Roux’s Arch.Dev.Biol.201134-41(1992)报道了培养的牛胚胎干细胞样细胞系，它存活了三代，但在第四代丢失。Handyside等，Roux’s Arch.Dev.Biol.196185-90(1987)公开了在分离来自小鼠ICMs的小鼠ES细胞系允许的条件下培养免疫外科分离的绵羊胚胎ICMs。
Campbell等，Nature 38064-6(1996)报道了在促进小鼠ES细胞分离的条件下培养的来自九天绵羊胚胎的培养胚盘(ED)细胞核转移后产生活羊羔。
据称，已分离、选择和繁殖动物干细胞用于获得转基因动物(见Evans等，WO90/03432；Smith等，WO94/24274；和Wheeler等，WO94/26884)。Evans等也报道了从猪和牛种衍生据称的多能ES细胞，据称可用于进行转基因动物生产。
来自转基因胚胎的ES细胞可用于核移植。也报道了使用有蹄类ICM细胞用于核移植。来自相似移植前家畜胚胎的家畜动物(如蹄类)核支持去核卵母细胞发育至足月(Keefer等，Biol.Reprod.50935-39(1994)；Smith等，Biol.Reprod.401027-1035(1989))。相比之下，小鼠胚胎的核转移后不支持去核卵母细胞在8细胞阶段后的发育(Cheong等，Biol.Reprod.48958-63(1993))。因此，家畜动物ES细胞十分需要，因为它们可提供全能供体核潜在来源，经过或不经过遗传学操作，用于核转移步骤。
ICM细胞的用途.Collas等，Mol.Reprod.Dev.38264-7(1994)公开了通过将裂解核供体微注射给去核成熟卵母细胞进行的牛ICMs核移植。体外培养胚胎7天产生十五胚泡，转移给牛受体，四只妊娠，出生两只。而且，Keefer等(1994)公开了使用牛ICM细胞作为核转移步骤中的供体核，以产生也能得到几个活后代的胚泡。此外，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906143-7(1993)公开了将体外培养短期足月牛ICM细胞转移到去核成熟卵母细胞产生小牛。
IV.胞质内精子注射(ICSI)可以用几个方法之一获得精子，包括显微外科附睾精子吸引术(MESA)和睾丸精子抽出术(TESE)。对于成熟附睾精子和睾丸精子的情况，当注射给成熟小鼠卵母细胞，正常胚胎发育并得到相应小鼠(Sasagawa等，J.Urol.1582006-8(1997))。然而，圆形精子细胞不能活化卵母细胞(Id.)。因此，为了动物饲养业以及人工繁殖技术，当使用不成熟精子或圆形精子细胞时，同时将oscillogenin注射给卵母细胞以启动正常胚胎发育。
ICSI是开发用于ART领域中人工繁殖和体外受精以协助精子缺陷男性的技术。有些已经表明这个步骤改革了男性不育症的治疗，因为精子严重受影响不能正常受精(Tarlatzis等，Hum.Reprod.13S165-77(1998))。例如，已表明囊性纤维化可引起输精管先天aphasia，降低精子质量(Jakubiczka等，Hum.Reprod.141833-4(1999))。男性不育症的其它原因包括Y染色体微小缺失引起的生精受损和核型异常(Kim等，Prenat.Diagn.181349-65(1998))。接触鱼精蛋白也可降低精子的效力(Ahmadi等，J Assist.Reprod.Genet.16128-32(1999))。ICSI也与动物饲养业相关(如见Li等，Zygote 7233-7(1999))。
Gomez等，Reprod.Fertil.Dev.10197-205(1998)提出介质中存在钙可增强ICSI后的受精率。这不是预料不到的，如Sousa等，Mol.Hum.Reprod.2853-7(1996)提出可溶性精子因子(SSF)可能负责ICSI后驱动卵母细胞活化的Ca2+振荡。Ca2+波可足够大至产生受精伴发的所有反应(Uranga等，Int’l.J.Dev.Biol.40515-9(1996))。而且，推测精母细胞注射的卵母细胞中缺乏典型振荡Ca2+反应是由于精母细胞中SSF缺乏，而不是被注射卵母细胞的反应缺陷或SSF不能释放到卵母细胞细胞质(Sousa等(1996))。此外，钙反应可能对精子细胞妊娠后正常胚胎发育很重要(Id.)。Tesarik等，Biol.Reprod.51385-91(1994)报道了尽管在ICSI受精卵母细胞中观察到Ca2+振荡，但它仅在相当延迟后才发生。
ICSI也用于精子受精能力低劣的人精子核型分析技术。例如，Goud等，Hum.Reprod.131336-45(1998)讨论了用于估计显微注射人精子的叙利亚金色仓鼠卵母细胞单性生殖活化的技术和条件。
使用针对肝素结合蛋白的抗体和估计精子膜中肝素结合蛋白含量也可以估计精子生育力(美国专利号5,962,241)。使用这里描述的精子因子oscillogenin可以帮助克服可能由遗传印记(Moore等，Rev.Reprod.173-7(1996))或可能由重建胚胎死亡率高造成的移植前胚胎体外操作引起的某些生长异常(如大牛犊综合症)。遗传印记与蛋白激酶活性有关，反过来可能受正常精子诱导成熟卵母细胞受精时观察到的钙离子振荡部分控制。这种发育异常对于罹患动物是有害的甚至可致死。确定精子生育力的另外方法在美国专利5,770,363；5,763,206；5,434,057和5,358,847中讨论。
因此，不管文献中以前报道了什么，需要诱导用于活化卵母细胞的卵母细胞Ca2+振荡的改善方法，特别是用于核转移和ICSI和其它相关人工繁殖技术。另外，oscillogenin和调节oscillogenin的试剂的制备和使用方法将大大助于克隆家畜的产生，ART在健康人出生中的应用和避孕。
发明目的和概述本发明的一个目的是提供从精子中分离oscillogenin的新方法，包括(A)制备精子胞质级分；(B)精子胞质级分经过HiTrap蓝亲和FPLC层析柱、羟基磷灰石FPLC柱和Surperose 12 FPLC层析柱的顺序处理而分离oscillogenin；和(C)获得具有[Ca2+]i释放活性的级分。
本发明的另一个目的是提供增强卵母细胞活化的方法，包括在用精子或其它细胞核注射或融合卵母细胞之前、同时或之后立即将oscillogenin注射给卵母细胞的步骤，其中在oscillogenin注射前或后已经对所述的卵母细胞进行了处理，去除或灭活了其内源核。卵母细胞可以是哺乳动物卵母细胞(如灵长目、牛、羊、绵羊、猪、猫、鼠或犬)，优选可以是人卵母细胞。该方法可进一步包括用至少一种另外增强二价阳离子释放的试剂或这种试剂的组合注射卵母细胞的步骤。
本发明的一个更具体的目的是允许活化的卵母细胞发育为胚胎，在有些情况下，这个胚胎可以移植到雌性代理母亲中，并允许孕育为非人动物。
本发明的另一个目的是提供了增强胞质内精子注射(ICSI)的方法，包括在精子或精子核插入卵母细胞之前或之后，将oscillogenin注射给卵母细胞的步骤。本发明的另一个目的是提供增强卵母细胞单性生殖活化的方法，包括用oscillogenin注射卵母细胞的步骤。
本发明的另一个目的是提供了预测精子[Ca2+]i释放活性的方法，包括测定精子样品中oscillogenin的浓度。一个更特殊的目的是提供了预测精子[Ca2+]i释放活性的试剂盒，包含识别和结合oscillogenin或编码oscillogenin的核酸的标记试剂。
本发明进一步的目的是提供编码oscillogenin的核酸，及其相应的氨基酸序列。Oscillogenin序列可以是人、灵长类、牛、猪、绵羊、马、猫、犬、鼠和山羊的。
本发明的另一个目的是提供识别和结合oscillogenin的抗体或其免疫原性片段。优选抗体是单克隆抗体和由Fab，scFv，F(ab’)2和Fab’组成的免疫原性片段。
附图简述
图1.图A显示了逐步使用层析柱得到精子因子(SF)蛋白富集的洗脱物。精子馏分首先通过HiTrap蓝染料柱处理，然后通过羟基磷灰石柱和最后通过Superose12柱。图B显示了通过各种层析柱处理后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的各个馏分(F1-F5)中蛋白分布。图C显示了多个柱的每个馏分的[Ca2+]i释放活性。监测的最大活性在F4-1馏分。
图2.体外(A和B)成熟或体内(C和D)受精后小鼠卵中IP3R-1免疫反应性的Western印迹分析和定量。每个泳道用二十只卵。“UF”代表未受精卵，“F”代表受精卵。MII卵通常在人绒毛膜促性腺激素(“hCG”)后16小时，指示的时间是指hCG后的小时数(phCG)。数据代表平均数±SEM。有共同上标的柱下处理没有显著差异(p＞0.05)。数值是对不同批次卵实施的4个Western印迹实验的平均值。
图3.接触7％乙醇(Et；A和B)或离子霉素/DMAP(Io/D；C和D)活化的小鼠卵中IP3R-1免疫反应性的Western印迹分析和定量。在phCG 16小时开始活化。Et-24hr-1细胞是接触乙醇后形成前核的phCG 24小时的卵；Et-24hr-2细胞是接触4小时内分裂成2个细胞的卵。用于所有处理的phCG 24小时(活化后8小时)的所有卵显示出形成前核。每个泳道使用二十只卵(e)。带有不同上标的柱下处理有显著性差异(p＜0.05)。数值是对不同批次卵实施的三个Western印迹实验的平均数。
图4.注射SF(A和B)或adenophostin A(Ad；C和D)活化的小鼠卵中IP3R-1免疫反应性的Western印迹分析和定量。在phCG 16小时进行注射，样品在注射后1小时、2小时、4小时和8小时取出。不同上标的柱下处理有显著差异(p＜0.05)。数值是对不同批次卵实施的三个Western印迹实验的平均数。
图5.SrCl2(A和B)或硫柳汞(“Th”；C和D)活化的小鼠卵中IP3R-1免疫反应性的Western印迹分析和定量。在phCG 16小时进行注射，每个泳道使用15只卵。“C”代表对照和培养相同时间但不接触SrCl2的这些卵。不具有共同上标的柱下处理有显著差异(p＜0.05)。数值是对不同批次卵实施的五个Western印迹实验的平均数。
图6.本发明使用的几个激动剂诱导的小鼠卵中[Ca2+]i振荡图。注射SF(～10ng/μl细胞内浓度)诱导的高度重复性增高(A)类似于注射adenophostin A(B；～100mM细胞内浓度)的诱导。SrCl2诱导升高延长和较低频率(C)。硫柳汞与卵孵育30分钟，诱导重复性升高(D)。显示的Ca2+记录是三个独立的实验进行的，振荡终止是由于记录终止而不是振荡停止。
图7.在lactacystin(″Lac″)存在或缺乏下，用SF活化的小鼠卵中IP3R-1免疫反应性的Western印迹分析和定量。在phCG 16小时注射SF。SF注射前，卵与抑制剂(100μM)预培养30分钟并在注射后在Lac中培养2小时。每个泳道使用15只卵。不具有共同上标的柱下处理有显著性差异(p＜0.05)。数值是对不同批次卵实施的3个Western印迹实验的平均数。
发明详述本发明涉及从精子中分离oscillogenin以及重组生产oscillogenin的方法。然后，该蛋白可用于增强卵母细胞单性生殖活化和增强精子生育力。该蛋白或编码该蛋白的核酸的检测可用于估计精子生育力。本发明也涉及调节oscillogenin活性因此调节生育力。
I.定义“oscillogenin”是指当注射给未活化的卵母细胞时，负责Ca2+振荡的蛋白。从精子细胞提取物中纯化oscillogenin的情况下，“钝化的oscillogenin”是oscillogenin经过至少三个层析柱的顺序处理并得到[Ca2+]i释放馏分而获得的。所述馏分包括银染估计的oscillogenin和大约五个其它蛋白。更优选的纯化oscillogenin组合物包括银染确定的oscillogenin和大约三个其它蛋白。优选使用的连续层析柱如实施例1中所述。“顺序处理”是指使用柱优选以实施例中所述的顺序进行。
“核酸”或“核酸分子”是指包括DNA、RNA、mRNA、cDNA或重组DNA或RNA。
“动物”是指动物界的任何成员，包括脊椎动物(如青蛙、蜥蜴、小鸡或马)和无脊椎动物(如蠕虫等)。优选的动物是哺乳动物。优选的哺乳动物包括家畜动物(例如有蹄类动物，如牛、水牛、马、绵羊、猪和山羊)，以及啮齿动物(如小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠)、犬、猫和灵长类。“非人”是指包括所有动物，尤其是哺乳动物并包括除人灵长类外的灵长类。
“雌性代理母亲”是指本发明的胚胎插入其中而妊娠的雌性动物。典型地，雌性动物与胚胎动物种相同，但雌性代理母亲也可以是不同的动物种。这里使用的该胚胎可以包括两个或更多细胞的复合体。
“胞质体”是指一旦核被去除，细胞保留的部分。
“单性生殖活化”是指其核没有与雌性核或雌性细胞融合形成合子的卵子或卵母细胞的发育。
“卵母细胞”是指未经Ca2+振荡的有核或去核动物卵。
“活化卵母细胞”是指好似已经单性生殖活化或已经受精的卵母细胞。
“去核卵母细胞”是指内源核去除或灭活的动物卵。
“精子”、“精液”、“精子样品”和“精液样品”是指雄性动物含有精子的射出物。成熟精子细胞是“精子”，而前体是“精子细胞”。精子细胞是精子发生时第二次减数分裂的单倍体产物，分化为精子。
“精子生育力’是指精子使卵受精并产生胚胎的能力。“精子[Ca2+]i释放活性”是指精子活化(任何动物的)卵母细胞的能力，通过卵母细胞中Ca2+振荡诱导可测定。
“精子胞质级分”是指该细胞中核和多数遗传材料缺失的部分。优选，胞质级分包括质膜内含有的物质，但不包括核及其遗传材料。
“诱导”、“增加”、“增强”或“上调”是指提高oscillogenin活性水平的能力。“增强活化”是指增加卵母细胞活化的方法或试剂。
“调整”或“调节”是指试剂使各个生物体内oscillogenin活性从野生型水平改变(如上调或下调)的能力。Oscillogenin活性可以在转录、翻译、核酸或蛋白稳定性或蛋白活性水平上。
“抗体片段”和“免疫原性片段(immunogenic fragment)”是指能够识别和结合oscillogenin或其片段的免疫原性蛋白肽。这包括抗oscillogenin抗体或其多肽片段。
“胞质内精子注射”或“ICSI”是指将精子或至少精子的遗传内容物注射给卵母细胞。
术语“核转移”或“核移植”是指克隆方法，其中供体核在细胞内源核被去除前或后移植给细胞。胞质体可以来自去核卵母细胞，去核ES细胞，去核EG细胞，去核胚胎细胞或去核体细胞。文献中已知核转移技术或核移植技术(Campbell等，Theriogenology 43181(1995)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod 50 935-939(1994)；Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906143-6147(1993)；Evans等，WO90/03432；Smith等，WO94/24274；和Wheeler等，WO94/26884。美国专利号4,994,384和5,057,420也公开了牛核移植的步骤。在本申请中，“核转移”或“核移植”或“NT”可以互换使用。
术语“核转移单位”和“NT单位”是指体细胞或细胞核注射或和去核胞质体(如去核卵母细胞)之间融合的产物，有时这里是指融合NT单位。
“体细胞”是指多细胞生物体，优选动物的任何细胞，其不变成配子。
“分离”或“纯化”的oscillogenin是指从分离它的精子中或从用于重组制备oscillogenin蛋白或肽的细胞中基本纯化没有其它非oscillogenin蛋白、肽或核酸的Ca2+活性蛋白。
“蛋白激酶抑制剂”是抑制催化磷酸从ATP转到蛋白羟基侧链引起蛋白功能改变的酶的试剂。本发明优选的蛋白激酶抑制剂是6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)、星形孢菌素、丁内酯、roscovitine、p34(cdc2)抑制剂、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
“磷酸酶”是指水解磷酸单酯的酶。这里公开的优选磷酸酶是磷酸酶2A和2B。
“钙离子载体”是指允许钙离子(Ca2+)越过脂质双层的物质。优选的钙离子载体包括离子霉素和A23187。
“分化”是指细胞变为专门执行特定功能的生物体发育过程。分化需要部分基因组的选择性表达。
“内细胞团”或“ICM”是指在哺乳动物胚泡中发现的产生胚胎且能够潜在形成胚胎的或胚胎外的除了滋养层的所有组织的一组细胞。
“饲养层”是指调节培养基的细胞层，为了培养其它细胞，尤其是培养那些低或纯系密度的细胞。
“培养基”或“介质”是指细胞和组织生长的营养溶液。
这里使用的术语“可药用载体”是指参与携带或转运化学物质的可药用材料、组合物或载体，例如液体或固体填充物、稀释剂、赋形剂、溶剂或成囊材料。稀释剂或载体成分不应该减弱活性化合物的治疗效果。
这里使用的术语“组合物”是指一种以上的组分或成分混合或组合所得的产物。
II.从精子分离oscillogenin的方法通过如Wu等，Mol.Reprod.Devol.46176-89(1997)和Wu等，Mol.Reprod.Dev.4937-47(1998)描述首先制备胞质精子提取物可从动物精子中得到含oscillogenin的精子级分。简言之，用TL-Hepes培养基洗涤精液样品两次，精子沉淀重悬于含75mM KCl，20mM Hepes，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，10mM甘油磷酸酯，1mM DTT，200uM PMSF，10μg/ml胃蛋白酶抑制剂，10μg/ml亮抑酶肽，pH7.0的溶液中。在4℃超声处理精子悬液大约25至35分钟(XL2020，HeatSystems，Inc.，Farmingdale，NY)。接着溶解产物在10,000×g旋转两次，收集上清。然后，所得上清在100.000×g 4℃离心1小时。这个澄清上清代表精子的胞质体级分。例如在缺乏抗冻剂下，由冰冻猪精子和融化精子两次也可以获得活性精子级分。
由此得到的胞质级分接着接受硫酸铵沉淀(50％)并沉淀。然后沉淀物离心成沉淀并保存在-20℃至-80℃延长一段时间。沉淀可重新组成并接受下列层析步骤以分离和/或纯化oscillogenin。重新组成的沉淀首先通过羟基磷灰石FPLC层析柱，随后是色谱聚焦柱，接着跟随Superose 12 FPLC层析柱。在大约30至大约68kDa分子量洗脱的馏分含有[Ca2+]i诱导剂oscillogenin。可以使用Wu等，1998中使用的各个层析柱所描述的层析柱条件。Wu等，(1998)没有描述如这里所述的特定顺序地使用层析柱，Wu等也没有描述将使用哪个特定含有活性因子的馏分。
III.oscillogenin的表征一旦从精子分离oscillogenin，它可被肽测序。使用由此鉴定的肽序列，可以产生可用于筛选文库以鉴定编码oscillogenin的基因的简并探针。
本发明进一步提供了编码oscillogenin和相关蛋白的核酸分子，尤其是以分离的形式。这里使用的“核酸”的定义是这样的RNA，rRNA，mRNA，DNA，rDNA或eDNA序列，其编码oscillogenin或其多肽片段，或与编码oscillogenin或其多肽片段的核酸序列互补，或在适当严格条件下与这种核酸杂交并与其保持稳定结合，或编码与该肽序列具有至少75％序列等同性，或优选至少80％，或更优选至少85％，或更优选至少大约90-95％等同性的多肽。特别期望基因组DNA、cDNA、mRNA和反义分子，以及天然来源或合成的基于可替换的主链或包括可替换的碱基的核酸。然而，进一步定义这种杂交或互补核酸是新的且对于任何现有核酸是非显而易见的，包括编码根据本发明的oscillogenin，在适当严格条件下杂交，或与编码根据本发明的oscillogenin互补的核酸。
“严格条件”是(1)使用低离子强度和高温度洗涤，例如，0.015MNaCl，0.0015M柠檬酸钠(sodium titrate)，0.1％SDS，在50℃；或(2)杂交过程使用变性试剂如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，含750mM NaCl，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液pH6.5的50％(vol/vol)甲酰胺，在42℃。另一个实例是使用50％甲酰胺，5XSSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5X Denhardt’s溶液，超声处理鲑精子DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡萄糖，42℃，以及在0.2XSSC和0.1％SDS中42℃洗涤。本领域技术人员容易适当地确定和改变严格条件得到清晰和可检测的杂交信号或使用如MANIATIS等，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL(1989)描述的材料和方法。
这里使用的，当核酸从编码其它多肽的污染核酸中基本分离时，核酸分子被述为是“分离”或“纯化”的。
本发明进一步提供了该编码核酸分子的片段。这里使用的“编码核酸分子的片段”是指编码完整蛋白的核酸序列的一小部分。根据意欲用途确定片段大小。例如，如果选择片段编码蛋白的活性部分，该片段需要大得足以编码该蛋白的一个或多个生物活性区域。如果片段将用作核酸探针或PCR引物，那么选择该片段长度使得在探测/引发过程中获得相对少量的假阳性。
用作探针或聚合酶链式反应(PCR)的特异性引物或用于合成编码本发明蛋白的基因序列的本发明编码核酸分子的片段(即合成的寡核苷酸)，可以很容易通过化学技术合成，例如Matteucci等，(J.Am.Chem.Soc.1033185-91(1981))的磷酸三酯方法或使用自动合成方法。此外，可以通过熟知方法很容易制备大DNA片段，例如合成一组限定基因各种模块片段的寡核苷酸，随后连接寡核苷酸以建立完整修饰的基因。
可以进一步修饰本发明的编码核酸分子使得含有用于诊断和探针目的的可检测标记。各种这种标记是本领域已知的，并可很容易与这里描述的编码分子使用。合适的标记包括但不限于，生物素、放射标记的核苷酸等等。本领域技术人员可使用任何本领域已知的标记以获得标记的核酸分子。
翻译过程中缺失、添加或改变掺入蛋白序列的氨基酸进行的一级结构本身的修饰可以在不破坏蛋白活性情况下达到。这种置换或其它改变产生具有落在本发明期望范围内的核酸编码的氨基酸序列的蛋白。
本质上，本领域技术人员能够很容易使用oscillogenin的氨基酸序列以产生抗体探针来筛选从合适细胞中制备的表达文库。典型地，来自哺乳动物例如用纯化蛋白免疫的兔(如下描述)的多克隆抗血清，或单克隆抗体可以用于探测哺乳动物cDNA或基因组表达文库，如λgtll，以获得该蛋白家族其它成员的适当编码序列。克隆的cDNA序列可以表达为融合蛋白，直接使用其自身的调控序列表达，或使用适合表达酶的特定宿主的调控序列的构建体来表达。
可供选择地，可以合成这里描述的编码序列的一部分并用作探针搜索编码任何生物体oscillogenin蛋白家族成员的DNA。制备含有大约18-20个核苷酸(编码大约6-7个氨基酸长度)低聚物并用于筛选基因组DNA或cDNA文库以达到在严格条件下或足够严格以消除不适当假阳性水平的条件下的杂交。也可以制备编码oscillogenin的大约8，9，10，15或更多连续氨基酸的低聚物。
此外，可以制备寡核苷酸引物对用于聚合酶链式反应(PCR)选择性克隆编码核酸分子。本领域熟知使用这种PCR引物的PCR变性/退火/延伸循环并可很容易调整以用于分离其它oscillogenin编码核酸分子，或如NEWTON等，PCR(1997)描述。
重组oscillogenin.本发明进一步提供了含有编码序列的重组DNA分子(rDNAs)。这里使用的rDNA分子是在原位接受了分子操作的DNA分子。产生rDNA分子的方法是本领域熟知的，例如，见SAMBROOKETAL.，CLONINGA LABORATORY MANUAL(1989)。在优选的rDNA分子，编码DNA序列可操作连接表达调控序列和/或载体序列。
如本领域熟知的，oscillogenin编码DNA序列可操作连接的载体和/或表达调控序列直接依赖于期望的功能特性，如蛋白表达和待转化的宿主细胞。本发明包含的载体是至少能够指导rDNA分子中包括的结构基因的复制或插入到宿主染色体，并优选也表达。
用于调节可操作连接蛋白编码序列表达的表达调控元件是本领域已知的，且包括但不限于可诱导启动子、组成启动子、分泌信号和其它调控元件。优选地，可诱导启动子容易被控制，如对宿主细胞培养基中的营养产生应答。
在一个实施方案中，含有编码核酸分子的载体将包括原核复制子，即具有指导自主复制和维持重组DNA分子于转化的原核宿主细胞如细茵宿主细胞中染色体外的能力的DNA序列。这些复制子是本领域熟知的。此外，包括原核复制子的载体也可以包括其表达提供了可检测标记如耐药性的基因。典型的细菌耐药性基因是提供抵抗氨苄西林或四环素的基因。
包括原核复制子的载体可进一步包括能够指导编码基因序列在细茵宿主细胞如大肠杆菌中表达的原核或噬茵体启动子。启动子是允许RNA聚合酶结合和发生转录的DNA序列形成的表达调控元件。与细菌宿主相容的启动子序列典型地由含有用于插入本发明DNA片段的方便限制性酶切位点的质粒载体提供。这种载体质粒的典型是可从Biorad实验室(Richmond，CA)获得的pUC8，pUC9，pBR322和pBR329，pPL和pKK223(Pharmacia；Piscataway，N.J.)。
与真核细胞相容的表达载体，优选与脊椎动物细胞相容的，也可以用于形成含有编码序列的rDNA分子。真核表达载体是本领域熟知的且可从几个商业来源获得。典型地，这种载体提供含有用于插入期望的DNA片段的方便限制性酶切位点。这种载体的典型是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-l/pML2d(InternationalBiotechnologies，Inc.)，和pTDTl(ATCC，&num；31255)，之类的真核表达载体。
用于构建本发明的rDNA分子的真核细胞表达载体可以进一步包括真核细胞中有效的可选择标记，优选耐药性选择标记。优选的耐药性标记是表达产生新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸转移酶(neo)基因(Southern等，J Mol.Anal.Genet.1327-41(1982))。可供选择地，可选择标记可存在于分离的质粒中，且两个载体通过共转染导入宿主细胞，通过与选择性标记适当的药物一起培养细胞来选择。
本发明进一步提供了用编码本发明蛋白的核酸分子转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核的。有效表达本发明蛋白的真核细胞不限制，只要该细胞系与细胞培养方法相容，且与表达载体增殖和基因产物表达相容。优选地真核宿主细胞包括但不限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物如来自小鼠、大鼠、猴或人细胞系的细胞。优选的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(ATCC No.CCL61)、NIH Swiss小鼠胚胎细胞NIH/3T3(ATCC No.CRL 1658)、幼年仓鼠肾细胞(BHK)、成纤维细胞和类似的真核组织培养细胞系。
任何真核宿主可用于表达编码本发明蛋白的rDNA分子。优选真核宿主是大肠杆菌。
本发明rDNA分子对合适的细胞宿主的转化和转染可通过典型地依赖于使用的载体类型和使用的宿主系统的熟知方法来完成。关于原核宿主细胞转化，典型使用电穿孔和盐处理方法，如见Cohen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110，(1972)；和MANIATIS等，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spting Harbor，NY(1982)和SAMBROOK等，(1989)。关于用含rDNAs的载体转化脊椎动物细胞，典型采用电穿孔、阳离子脂质或盐处理方法，如见Graham等，Virol.52456-67(1973)；Wigler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761373-76(1979)。
成功转化的细胞，即含有本发明新核酸分子(如rDNA)的细胞可以被熟知技术鉴定，包括可选择标记选择。例如，可以克隆本发明rDNA导入所得的细胞以产生单一茵落。可以收获这些克隆的细胞，裂解，使用如Southern，J.Mol.Biol.98503-17(1975)或Berent等，Biotech.3208(1985)描述的方法为oscillogenin核酸的存在而检测其DNA或RNA含量或通过合适的免疫学检测方法检测细胞产生的蛋白。
重组Oscillogenin蛋白.本发明进一步提供了使用这里描述的重组核酸分子制备本发明蛋白的方法。一般情况下，蛋白的重组形式的产生典型地包括下列步骤首先，得到编码本发明oscillogenin蛋白的核酸分子。编码序列，优选是缺乏内含子的，直接适合在任何宿主表达。序列可转染宿主细胞，例如真核细胞或原核细胞。真核宿主包括哺乳动物细胞以及使用重组杆状病毒的昆虫细胞(如Sf9细胞)。可供选择地，只编码oscillogenin一部分的片段可以单独表达或以融合蛋白的形式表达。可以纯化该融合蛋白并用于产生多克隆抗体。
然后，该核酸分子优选可操作连接合适的调控序列，如上所述，以形成含有oscillogenin开放阅读框架(ORF)的表达单位。该表达单位用于转化合适的宿主，转化的宿主在允许该重组蛋白产生的条件下培养。可选择地，从培养基或细胞中分离该重组蛋白。在有些不纯可以容许的情况下，可以不需要回收和纯化该蛋白。
前述的每个步骤可以以各种方法进行。例如，可从基因组片段获得期望的编码序列并直接用于合适的宿主。使用适当的复制子和调控序列完成在各种宿主中可操作的表达载体的构建，如上阐述。调控序列、表达载体和转化方法依赖于用于表达基因的宿主细胞的类型。如果不是正常获得的，合适的限制性酶切位点可以添加到编码序列末端以提供可割取基因以插入这些载体中。本领域技术人员可以很容易调整本领域所知的任何宿主/表达系统，使用本发明的核酸分子产生期望的重组蛋白或多肽。
IV.使用oscillogenin来单性生殖活化卵母细胞进行核转移的方法本发明一个重要的实施方案涉及使用oscillogenin进行卵母细胞的单性生殖活化。这种活化可以通过下列而发生(1)单独或与其它Ca2+振荡试剂联合给予oscillogenin，和(2)oscillogenin和精子或体细胞联合给予。可使用oscillogenin和精子联合用于胞质内精子注射(ICSI)、精子生育力测试(如oscillogenin增加效能)和体外受精(IVF)。
体外受精步骤.可使用如Long等，Mol.Reprod.Dev.3623-32(1993)；Alan O.Trounson等，HANDBOOK OF IN VITRO FERTILIZATION(1999)；和Brigid Hogan等，MANIPULATING THE MOUSE EMBRYOALABORATORY MANUAL(Cold Spting Hatbor Laboratory，1994)中描述的受精步骤。典型地，例如采用Percoll方法(Hossain等，Arch.Androl.37189-95(1996))处理混合的精液，它甚至可以是冷冻保存的。加入分离的能动精子至终浓度500,000个精子/ml。肝素(10μg/ml，Sigma)加入受精培养基中以诱导精子获能(Parrish等，Biol.Reprod.381171-80(1988))。监测前，卵与精子孵育至少4小时。固定随后表现[Ca2+]i振荡的卵并染色证实受精。固定和染色步骤和用于合子受精期分期的标准如Fissore等，Biol.Reprod.47960-9(1992)和Long等，(1993)描述。
培养基、钙离子载体、磷酸酶和蛋白激酶抑制剂.除了将oscillogenin注射给去核卵母细胞或有核卵母细胞，显微注射的卵母细胞，核来自其它细胞，该细胞也可在富含钙离子(Ca2+)的培养基中培养。可供选择地，或除了在富含Ca2+的培养基中培养外，卵母细胞可与钙离子载体(如离子霉素和A23187)、蛋白激酶抑制剂(如6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)、丁内酯、roscovitine、p34(cdc2)抑制剂、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇或其它丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂)或磷酸酶(如磷酸酶2A或磷酸酶2B)共同注射或接触之以增强细胞(如卵母细胞)中钙振荡。可以如Wang等，Mol.Reprod.Dev.5399-107(1999)描述在富含钙离子的培养基中培养。而且，可以利用其它二价阳离子活化至少啮齿动物的卵母细胞，例如镁、锶和钡。使用电休克、乙醇处理卵母细胞和用支架螯合剂处理卵母细胞也可以增加二价阳离子水平。
钙离子载体典型地与蛋白激酶抑制剂联合使用。这个方法的实施方案包括使用离子载体和oscillogenin或蛋白激酶抑制剂和oscillogenin，或三个全部。可采用如美国专利号5,945,577中描述的蛋白激酶抑制剂。可以使用如Susko-Parrish等，Dev.Biol.166729-39(1994)；Mitalipov等，Biol.Reprod.60821-7(1999)；Liu等，Biol Reprod.611-7(1999)；Mayes等，Biol.Reprod.53270-5(1995)；和美国专利号5,496,720中描述的钙离子载体与蛋白激酶抑制剂联合。典型地，卵母细胞短暂(如大约5分钟)接触离子载体。也可如美国专利号5,945,577描述使用磷酸酶增加钙水平。
卵母细胞的单性生殖活化.可用几种方法诱导卵母细胞单性生殖活化，包括(1)用Ca离子载体和细胞松弛素D与放线菌酮联合进行碱性处理(basic treatment)；(2)电脉冲；(3)放线茵酮和电脉冲处理(见Bodo等，Acta Vet.Hung 46493-500(1998))；(4)钙离子载体(如A23187)和蛋白激酶C刺激剂(如佛波醇酯)联合使用(Uranga等，Int’l.J.Dev.Biol.40515-9(1996))；(5)卵母细胞接触7％(v/v)乙醇溶液(Lai等，Reprod Fertil.Dev.6771-5(1994))；(6)使用嘌呤霉素诱导(De Sutter等，J.Assist.Reprod.Genet.9328-37(1992))；(7)在富含锶离子的培养基中培养(ONeill等，Mol.Reprod.Dev.30214-9(1991))；和(8)200μm thimerosol，观察到它可诱导猪卵母细胞中Ca2+振荡(Machaty等，Biol.Reprod.571123-7(1997))。除了诱导单性生殖活化的方法外，卵母细胞冷冻保存也可影响活化的效率(如见Lai等，Reprod.Fert.Dev.6771-5(1994))。所以，这项发明的另一个实施方案是弥补冷冻保存诱导的单性生殖效率降低，以及提供提高使用新鲜收获细胞进行卵母细胞单性生殖活化的整体效率的新材料。
V.增强ICSI的方法本申请的另一个实施方案是使用oscillogenin增强动物饲养业和体外受精(IVF)中ICSI的效力。Oscillogenin可以单独用于ICSI技术，或与一个或多个钙离子载体、蛋白激酶抑制剂、磷酸酶或富含钙的培养基联合，如上讨论。为了进一步增强精子-卵母细胞融合，可如Yanagida等，Hum.Reprod.141307-11(1999))描述利用电刺激。
可和上面所列的那些联合使用的另一个方法是有力吸出卵母细胞细胞质以改善ICSI结果，如Tesarik等，Fertil.Steril.64770-6(1995)所述。
激酶试验.可使用激酶试验确定oscillogenin诱导的[Ca2+]I振荡是否能够激发卵母细胞活化，并因此确定上述技术和组合物的每个的效率。合适的激酶试验包括组蛋白H1和促细胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶试验，可如Fissore等，Biol.Reprod.551261-70(1996)所述实施。假定髓磷脂碱性蛋白(MBP)测定大部分MAP激酶活性，如前所示(Id.)。将5个卵的各组转移至含10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A，500nM蛋白激酶A抑制剂，80mMβ-甘油磷酸酯，20mM EGTA，15mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇(DTT)的5μl H1激酶缓冲液(如Collas等，Mol.Reprod.Dev.34224-231(1993)所述)。重复冻融循环溶化卵并保存在-80℃直到进行激酶试验。
向5μl粗卵溶解产物中加入含2mg/ml组蛋白Hl(III-S型，Sigma)，1mg/ml MBP(Sigma)，0.7mM ATP和50μCi[γ-32P](Amersham，Arlington Heights，IL)的5μl溶液开始激酶反应。反应在30℃进行30分钟，加入5μl SDS加样缓冲液终止反应(Laemmli，Nature 227680-685(1970))。样品煮沸3分钟并加样到大约12或15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。对照样品典型地含有除卵母细胞外反应的全部成分。在-70℃采用放射自显影用DuPont’s Cronex加强屏板或其它类似系统显现组蛋白H1和MBP的磷酸化。可使用这种激酶试验估计精子样品生育力以及估计技术和/或组合物中特定组合的效能。实施激酶试验的其它条件是本领域技术人员已知的。
确定卵母细胞是否已经诱导进入受精途径(至少在啮齿动物)的另外方法可以通过第二极体是否被挤出而确定。第二极体挤出可通过显微镜看到。而且，肌醇三磷酸受体(IP3R)下调看来只在受精，SF注射和肌醇三磷酸(IP3)注射后发生，而不在卵母细胞接触乙醇、钙离子载体或氯化锶时发生。可在RNA转录或在蛋白合成水平估计IP3R下调。这种方法是本领域普通所知的，例如见ED HARLOW等，ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL(1988)；和SAMBROOK等，CLONINGA LABORATORY MANUAL(1989)。
VI.估计精子生育力的方法和试剂盒本发明的另一个实施方案是测定精子中oscillogenin含量作为测定精子生育力的方法。可通过检测精子中oscillogenin的浓度和/或位置来测定该含量。可使用识别和结合oscillogenin的抗体或其免疫原性片段估计oscillogenin。可供选择地，也可以使用检测mRNAs的核酸探针估计oscillogenin。可以使用任何下列技术或如实施例中所述实施这些步骤。
在一个实施方案中，本发明提供了通过测定待测动物精子中oscillogenin的存在和浓度来确定生育力的方法。在这个方法中，精子样品中oscillogenin的存在或缺乏是通过测定来自样品精子中结合抗oscillogenin抗体的oscillogenin的量，如果有的话，而检测的。该抗oscillogenin抗体可以是多克隆的，但优选是单克隆的。也可以通过本发明的单克隆抗体鉴定Oscillogenin。
在家畜动物中，典型的有大约1×109个精子/ml精液。然后可通过筛选收集的样品中oscillogenin的存在和量确定动物的生育力。使用抗体的测试可用本领域技术人员所知的Western印迹试验、ELISAs和其它免疫试验来实施。
酶链免疫吸附试验(ELISA).优选的检测oscillogenin的免疫学方法是ELISA方法。接着蛋白样品与这些平板接触。优选样品通过在适合孵育的缓冲液中稀释已知数量的精子中分离到的oscillogenin而制备的。样品置于孔中，在大约25℃至大约37℃的温度范围，优选在大约37℃，培养大约1小时至大约4小时的时间，优选大约1小时。在检测抗体(如抗oscillogenin抗体)导入孔中之前，充分洗涤含有样品的孔。
可直接标记或使用二抗检测抗体。标记可以合适地是任何方便连接单克隆抗体或抗体片段用于免疫试验的标记，如酶(如辣根过氧化物酶)、发色团、荧光团(如绿荧光蛋白、蓝荧光蛋白或萤光素酶)、或放射性标记(如125I)。该标记可以通过任何常规方法，包括通过常规交联试剂与单克隆抗体结合。见ED HARLOW等，ANTIBODIESALABORATORY MANUAL(1988)。
Western印迹和免疫沉淀.为了估计稳定状态蛋白浓度，可以使用Western印迹。对于Western印迹，典型的步骤可以实施如下。相对于在例如200μl精液中含有的精子加入到含TWEEN和1％胎牛血清白蛋白(BSA)和蛋白酶抑制剂的1ml磷酸缓冲盐水(PBS)的1.5ml微量离心管中，并以4000rpm离心以去除精液体。在加入样品缓冲液(Laemmli，1970)前可洗涤精子2-3次并在应用到10-15％，优选12％的聚丙烯酰胺凝胶前，煮沸5分钟，转移并进行Western印迹。
对于免疫沉淀，典型的步骤可通过将单克隆抗体与HZ珠(SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.)或类似珠连接而实施。用洗涤剂或用机械方式溶解洗涤过的精子的膜，然后离心去除。珠加入上清中，允许蛋白结合抗体(～10分钟)。然后洗涤珠3次，在样品缓冲液中煮沸，样品缓冲液应用于10-15％，优选12％的PAGE。使用任何合适的蛋白检测技术如凝胶考马斯兰染色、ELISA或通过Western印迹可直接确定蛋白的存在。免疫检测的其它方法在HARLOW等(1988)中描述。
免疫荧光.识别和结合oscillogenin的抗体可用于连接带荧光标记的二抗。荧光标记可以是荧光素、碱性蕊香红、碱性蕊香红GREENO和其它类似的荧光标记。
电子显微镜分析.在本发明的另一个实施方案中，电子显微镜检查可用于估计精子中oscillogenin的浓度和位置。可用R.C.Jones，J.Reprod.Fertil.193145-149(1973)描述的步骤固定精子用于电子显微镜检查。
VII.调节oscillogenin活性的方法和组合物本发明的一个实施方案包括调节oscillogenin活性，并由此调节精子生育力和/或卵母细胞活化的组合物和方法。
例如，oscillogenin可单独或联合(1)精子或其遗传材料或(2)体细胞或其遗传材料给予目的卵母细胞。当oscillogenin与例如精子联合给予时，oscillogenin可在注射例如精子之前、同时或注射后立即给予。Oscillogenin可进一步与调节钙离子振荡的任何试剂一起给予。
VIII.抗体本发明的另一个实施方案是识别和结合oscillogenin的抗体或免疫原性片段。使用适当的免疫方案和oscillogenin或其免疫原性肽免疫合适的哺乳动物宿主而制备抗oscillogenin抗体。这些肽长度至少可以是5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40或50个连续氨基酸，或完整oscillogenin蛋白。Oscillogenin或其免疫原性片段，可以与合适的载体连接。本领域熟知与载体如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)或其它载体蛋白连接的免疫原性连接物的制备方法。有些情况下，使用例如碳二亚胺试剂直接连接可能有效；在其它情况下，期望连接试剂如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL提供的那些可以提供半抗原的可及性。半抗原肽(如上述长度)可以在氨基或羧基末端延伸半胱氨酸残基或散布半胱氨酸残基，例如，以利于连接载体。
免疫原的给予通常是通过注射适当的一段时间并使用合适的佐剂进行的，如本领域中一般所理解的。在免疫时间表中，用抗体效价确定抗体形成的充分性。
采用合成相当于例如oscillogenin氨基或羧基末端15-20个氨基酸的肽产生抗肽抗体。合成肽可以小如2-3个氨基酸长度，但优选至少大约4至大约20个或更多个氨基酸残基长。使用标准方法将该肽与KLH耦联并免疫给动物如兔。也可以使用其它动物如啮齿动物(如小鼠)、绵羊、山羊、吗和其它蹄类。然后可纯化多克隆oscillogenin抗体或肽抗体，例如使用含共价结合肽或蛋白的Actigel珠。
这种方法产生的多克隆抗血清可满意地用于有些应用，但对于药物组合物，优选使用单克隆(mAB)制剂。可以使用Kohler和Milstein(Nature 256495-7(1975))的标准方法或通常所知的引起淋巴细胞或脾细胞永生的改动方法制备分泌期望单克隆抗体的永生细胞系(如见Harlow等1988)。用免疫试验筛选分泌期望抗体的永生细胞系，试验中抗原是半抗原肽、多肽或蛋白。当鉴定到分泌期望抗体的合适的永生细胞培养物时，细胞可在体外培养或在腹水中产生。
然后从培养物上清或从腹水上清中回收期望的单克隆抗体。含有识别和结合oscillogenin的片段的单克隆或多克隆抗血清片段可用于标记oscillogenin以及oscillogenin的可能调节剂。使用免疫反应片段，如Fab，SCFV，Fab’，F(ab’)2片段，特别是在治疗中，常是优选的，因为这些片段的免疫原性通常比整个免疫球蛋白低。
实施例实施例1富集oscillogenin的方法可使用下列步骤通过顺序层析富集精子因子(SF)，一种Ca2+释放活化蛋白，和通过比较SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定效应多肽。
通过循序层析分馏公猪精子因子(SF)和鉴定候选多肽的步骤是a)用硫酸铵沉淀.活性物质在50％饱和溶液中沉淀并使[Ca2+]i释放活性富集2倍。
b)HiTrap蓝染料(HiTrap blue dye)的亲和层析.活性多肽在3号峰1M KCl洗脱。这富集了4倍。
c)羟基磷灰石层析.这个柱的洗脱是用浓度不断增加的磷酸缓冲液完成的。活性蛋白在3号峰(185mM磷酸钾)洗脱并使活性富集了4倍。
d)在Superose 12上进行大小排阻层析.活性蛋白在4号峰洗脱且具有43kDa的MW。这富集5倍。
如果这些步骤的每一步独立进行，当联合使用时预期的富集是大约128倍。由于四个步骤基于不同的生物化学特性，很可能每步去除不同组的公猪SF蛋白。累积12份分离公猪精液的50％硫酸铵沉淀。溶解相当于一只公猪精液的量并通过蓝亲和柱处理。收集3号峰并保存在活性完全保持的-80℃。重复这种处理12次。然后组合从这12次中得到的3号峰馏分并填料到羟基磷灰石柱中。收集羟基磷灰石柱中得到的3号峰，浓缩并立即导入Superose 12中。分别浓缩这个柱中活性峰(4号峰)的每一各个馏分(250μl)并测试[Ca2+]i释放活性。
我们的结果表明在馏分4-2内的分子量在35-80kDA之间的几种蛋白可能参与SF激发Ca2+释放的能力。
硫酸铵沉淀.粗精子提取物与饱和硫酸铵混合至50％饱和度。离心(10,000×g，15分钟，在4℃)收集沉淀，沉淀保存在-20℃直到使用时。沉淀重悬于注射缓冲液(75mM KCl和20mM HEPES，pH＝7.0)中，在相同的缓冲液中洗涤，检测Ca2+释放活性前，使用Centricon-30超滤膜浓缩。
层析.快速蛋白质液相层析(FPLC)的分离步骤中使用的柱(全部来自Phamacia；Pitscataway，NJ)根据Reduth等，J.Eukaryot.Microbiol.4195-103(1994)；Morgan等，Molec.Biochem.Parasitol 57241-52(1993)；Muranjan等，Infect.Immun.65380614(1997)；Wu等，Dev Biol.203369-81(1998))使用。所有分级分离前，用无水乙醇冲洗层析系统中服务的泵和管，随后用无菌PBS冲洗。柱是无菌的并与叠氮化物共同保存以预防污染。所有缓冲液高压灭菌并在使用前过滤。收集管是无茵的并用硅包裹以降低蛋白非特异性损失。FPLC、馏分收集器和所有缓冲液收藏在4℃房间以进一步降低细菌生长和酶活性。
HiTrap蓝亲和FPLC层析.硫酸铵沉淀稀释在缓冲液A中(20mMHEPES，1mM EDTA，pH＝7.0)，使用4℃FPLC系统填入5ml HiTrap蓝(HiTrap blue)亲和柱(Pharmacia)上。用15ml缓冲液A洗涤后，蛋白以20ml线性梯度从0至500mM KCl，最后以20ml 1M KCl洗脱。在3号峰观察到活性(见图1A)。浓缩这个馏分(将累积12个峰)、洗涤并倒入羟基磷灰石柱中。
羟基磷灰石FPLC层析.使用HiTrap蓝亲和FPLC层析柱从3号峰得到的蛋白稀释在含200μM苯甲磺酰氟(PMSF)的10mM磷酸钾缓冲液(pH＝6.8)中，并以0.4ml/分使用4℃FPLC系统填入5ml羟基磷灰石柱中。用10ml 10mM磷酸缓冲液洗涤后，通过增加硫酸钾缓冲液(pH＝7.2含200μM PMSF)的摩尔浓度以分步方式以相同流速洗脱蛋白。每步的磷酸钾浓度如下88mM，127mM，185mM，244mM，302mM和400mM。收集3号峰的馏分(Wu等，Dev.Biol.203369-81(1998))、洗涤、浓缩并倒入Superose 12柱中。
Superose 12 FPLC层析.在4℃将羟基磷灰石得到的活性馏分(3号峰浓缩到总体积小于250μl)填入与FPLC系统连接的Superose 12HR 10/30柱。用含200μM PMSF的缓冲液(75mM KCl和20mM HEPES，pH＝7.0)以0.1ml/分的流速洗脱蛋白并用UV-M监测器在OD280检测。收集每一各个馏分(0.25ml)，检测Ca2+释放活性前浓缩。用β-淀粉酶(200kDa)、乙醇脱氢酶(150kDa)、牛血清白蛋白(68kDa)和碳酸酐酶(29kDa)(Sigma)校准Superose 12 HR10/30柱。
实施例2Oscillogenin蛋白的表征这个实施例表征了SF提取物活性卵回收和培养如以前描述(Wu等，Dev.Biol.203,369-81(1998))从8-20周龄CD-1雌性小鼠的输卵管中回收小鼠卵或最近受精的合子。注射5I.U.妊娠母马血清促性腺激素(PMSG；Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo；所有试剂来自Sigma除非特别说明)过度刺激小鼠，注射5I.U.人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma)40-48小时后诱导排卵。为了得到受精合子，在注射hCG后，雌性和雄性一起过夜。注射hCG后(phCG)14小时将卵收集到添加了5％热处理的胎牛血清(FCS；Gibco，Grand Island，NY)的HEPES缓冲液(TL-Hepes)中。与牛睾丸透明质酸酶培养5-10分钟去除颗粒细胞，选择无退化征象和第一极体挤出的卵母细胞用于这些研究。卵转移到50μl KSOM(专门培养基，Phillipsburg，NJ)滴中，在活化前和后它们在那里在石蜡油下36.5℃含7％CO2的潮湿空气中培养可变的一段时间。
显微注射技术如前描述(Wu等，Dev.Biol.203369-81(1998))实施显微注射步骤。简言之，卵放在添加了2.5％蔗糖和20％FCS的50μl IL-Hepes小滴中石蜡油下并用安装在Nikon Diaphot显微镜(Nikon，Inc.，Garden City，NY)上的操作器(Narishige，Medical Systems Corp.，Great Neck，NY)注射。注射吸管吸入2-3μl含下列化合物之一的液滴0.5mM fura-2右旋糖酐(fura-2 D；分子探针，Eugene，OR)，1mg/ml蛋白浓度的公猪精子级分(SF)，或10μM的IP3R有力激动剂adenophostin A(Dr.K.Tanzawa惠允，Sankyo CO，Tokyo，日本)。所有试剂用含75mM KCl和20mM HEPES，pH7.0的缓冲液稀释并使用PLI-100微注射器(Medical Systems Corp.)通过气压输送到卵质中。注射体积大约5-10pl，这使得细胞内浓度大约10ng/μl SF(2.5-5精子当量；Wu等，1998)和100nM adenophostin A。
SF制备如Swann，Development 1101295-1302(1990)；和Wu etal.，Dev.Biol.203369-81(1998)描述从公猪精液中制备胞质SF提取物。简言之，精液样品首先用TL-Hepes洗涤两次，沉淀重悬于含75mM KCL，20mM HEPES，1mM EGTA，10mM甘油磷酸酯，1mM DTT，200μM PMSF，10μg/ml胃蛋白酶抑制剂和10μg/ml亮抑酶肽，pH7.0的溶液。使用小探头，设置3次，15-25分钟，4℃超声处理(XL2020，Heat Systems Inc.，Farmingdale，NY)溶解精子悬液。超声处理的悬液在10,000×g旋转两次，两次收集上清，然后在10,000×g，4℃离心45分钟。收集所得清晰上清作为胞质成分。用超滤膜(Centricon-50，Amicon，Beverly，MA)洗涤上清(75mM KCl和20mMHEPES，pH7.0)。然后提取物接触硫酸铵饱和溶液(50％终浓度)而沉淀，随后在10,000×g，4℃离心15分钟。收集沉淀并保存在-80℃直到使用时。
单性生殖活化这些研究过程中，使用几种通常使用的单性生殖剂，包括诱导单一[Ca2+]i升高的乙醇和离子霉素(Cuthbertson，JExp.Zool.226311-14(1983)；和Shiina等，J Reprod.Fert 97143-50(1993))，和其它物质如激发[Ca2+]i振荡的adenophostin A，SF，硫柳汞和SrCl2(Kline等，Dev.Biol.14980-9(1992)；Swann，Biochem J.28779-84(1992)；and Sato等，Biol.Repro.58867-73(1998))。活化化合物注射给卵(如adenophostin A和SF，详见显微注射步骤)或加入卵培养基中(如硫柳汞、SrCl2)。所有情况下，在给予hCG后(phCG)16小时开始活化，两小时后(phCG18小时)观察到第二极体挤出，处理后5小时估计前核形成而肉眼评价卵。活化步骤和指定的培养期(1，2，4或8小时)后，卵收集在5μlDulbecco’s硫酸缓冲液(DPBS)/聚乙烯吡咯烷酮(3mg/ml，PVP)中并-80℃保存。除了用硫柳汞处理的卵，在处理后8小时收集的大部分卵表现前核形成。
卵在TL-Hepes加3mg/ml牛血清白蛋白(BSA)中，37℃接触7％乙醇溶液5分钟进行乙醇活化。处理后，卵在TL-Hepes中洗涤数次，培养8小时(phCG24小时)。离子霉素和6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)-激酶抑制剂活化(Susko-Parrish等，Dev.Biol.166729-39(1994))是通过卵和5μM离子霉素在无Ca2+DPBS加3mg/ml BSA中培养5分钟而完成。然后，卵在TL-Hepes/1mg/ml BSA中洗涤，在DMAP/KSOM(2mM)中放4小时并小心洗涤除去DMAP后培养4小时。用SrCl2活化的卵在添加了10mM SrCl2的无Ca2+M-16样培养基中培养2或4小时。然后处理的卵在添加了5％FCS的IL-Hepes中洗涤，并根据实验培养2，4或6小时。对于硫柳汞活化，卵接触新鲜制备的含200μM硫柳汞的KSOM溶液30分钟。使用添加了5％FCS的IL-Hepes洗涤硫柳汞处理的卵以除去该试剂，并培养30分钟、1.5、3.5或7.5小时。
荧光记录和[Ca2+]i测定如前所述(Wu等，1998)用fura-2 D负荷卵监测[Ca2+]i水平。UV照射用75瓦特氙弧灯提供，利用340和380nm刺激波长。用中密度滤片使UV光的强度减弱32倍，光电倍增管测量通过500nm屏障滤片后发射的光。荧光信号时整个卵平均。486 IBM兼容体系运行改进Phoscan 3.0软件程序控制滤片轮的旋转和快门装置改变波长。340nm/380nm荧光比确定游离[Ca2+]i。计算添加2mM EDTA(Rmin)或2mM CaCl2(Rmax)和60％蔗糖以校正细胞内粘性的无Ca2+DPBS中10μMfura-2 D的Rmin和Rmax(Grynkiewicz等，J.Biol.Chem.2603440-50(1985)；和Poenie，Cell Calcium 1185-91(1990))。也单独使用相同的溶液作为背景消减。340nm/380nm刺激波长的荧光比代表细胞外SrCl2存在下测定的Ca2+。在这种情况下不计算[Ca2+]i浓度，因为fura-2也对Sr2+具有一些亲和性。因此，细胞内存在Sr2+阻碍和妨碍获得精确的Ca2+和/或Sr2+细胞内浓度(Hajnoozky等，EMBO J，163533-43(1997))。
分别测定塑料培养皿底部石蜡油下放在玻璃盖片上的35μl滴TL-Hepes培养基中的卵。每6秒测定荧光比，每个波长读数1秒。卵母细胞首先监测10-120秒，建立基线[Ca2+]i值，之后，停止记录2-6分钟以允许显微注射或添加试剂。然后重新开始记录并持续10-30分钟。
抑制剂制备用蛋白酶体抑制剂Laetaeystin(100uM；Calbiochem，La Jolla，CA)(Mellgren，J.Biol.Chem.27229899-903(1997)；和Fenteany等，J.Biol.Chem.2738545-48(1998))测定蛋白酶体是否参与SF造成的IP3R-1下调。注射前，卵在抑制剂中孵育30分钟，在抑制剂存在下注射SF。然后，卵在新鲜添加lactacystin的KSOM新滴中培养2小时。
Western印迹技术如前所述(He等，Biol.Reprod.571245-55(1997))将15或20只小鼠卵的等体积粗溶解产物和两倍强度样品缓冲液(Laemmli，Nature 227680-5(1970))混合。样品煮沸3分钟并加入4％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。使用Mini Trans Blot Cell(Bio-Rad；Hercules，CA)将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(Micron Separation；Westboro，MA)上，4℃进行2小时。膜首先在PBS和0.05％Tween(PBS-T)中洗涤，然后在PBS-T中用6％无脂干奶粉封闭1小时。在PBS-T中洗涤几次后，膜与在PBS-T中稀释1∶3,000的抗IP3R-1亚型(RbtO4)C末端15肽序列的兔多克隆抗体孵育过夜(Parys等CellCalcium，17239-49(1995))。洗几次之后，膜与连接辣根过氧化物酶并在PBS-T中稀释1∶3,000的二抗孵育1小时。使用Western印迹化学发光试剂(NEN Life Science Products；Boston，MA)使膜显影并曝光1-3分钟到最大敏感性胶片上(Kodak，Fisher Scientific；Springfield，NJ)。广范围、预先染色的SDS-PAGE分子量标准(Bio-Rad)平行泳动估计免疫反应条带的分子量。使用AdobePhotoshop(Mountain View，CA)基本如Cameron等，Cell 83463-72(1995)所述测定IP3R-1条带的强度，并使用Sigma绘制软件进行绘制(Jandel Scientific Software；San Rafael，CA)。得到含每条IP3R条带的所选组区域内的平均象素强度，将同一组区域应用于特定胶片的所有泳道。同一组区域也放在胶片中无条带的区域内，采取背景数。然后从所有胶片的IP3R-1强度中减去背景数。来自中期II(MII)卵的条带作为参考并指定值为1。计算用几个不同的单性生殖试剂处理后的卵相对于1的IP3R-1条带强度并统计学比较。为了避免定量系统可能饱和并确保定量在线性范围内进行，每个胶片曝光4或5次并定量。丢弃曝光不足和过度曝光的胶片。重复Western印迹步骤至少三次，收集几种不同时期的卵。
统计学分析使用单因素ANOVA对IP3R-1条带强度和Ca2+参数进行统计学比较。如果观察到组间有差异，采用Tukey Kramer方法使用JMP IN软件(SASInstitute；Cary，NC)进行各处理间的比较。显著性是p＜0.05。
结果卵成熟和受精对IP3R-1下调具有不同的作用已表明卵老化(aging)或其受精可诱导卵对注射IP3的Ca2+反应明显降低(Jones等，Development 1213259-66(1995)；和Jones等，Dev.Biol.178229-37(1996))。为了证明IP3R系统诱导的反应性降低是否由于IP3R-1数量降低，在排卵后收集小鼠卵并在体外老化，或受精后很快收集并在体外培养可变的一段时间。未受精的卵培养10小时(phCG 24小时)，或16小时(phCG 30小时)，合子培养到前核期(phCG 24小时)，到恰在第一次有丝分裂前(phCG 30小时)，或到2细胞期(phCG 40小时)。Western印迹估计这些卵中IP3R-2的存在和量。如图2A，B所示，卵在体外老化对IP3R-1的量没有明显影响。相反，到前核形成时受精诱导IP3R-1明显下调(图2C，D)。在这个时间后没有观察到受体另外明显下调(图2C，D)。
乙醇和离子霉素诱导的单一[Ca2+]i升高不使IP3R-1下调为了理解受精过程中IP3R-1下调的机制，我们研究了诱导单一[Ca2+]i升高是否对IP3R-1降解具有影响。已证明，单一Ca2+反应，如乙醇和离子霉素诱导的，可激发高比率活化和启动老化卵母细胞发育(Cuthbertson，J.Exp.Zool.226311-14(1983)；Shiina等，J.Reprod.Fert.97143-50(1993)；和Susko-Parrish等，Dev.Biol.166729-39(1994)。此外，加入激酶抑制剂DMAP检测振荡缺失时另外的激酶活性下调可以刺激IP3R-1降解的可能性。因此，我们研究了小鼠卵接触70％乙醇或5μm离子霉素+2mM DMAP并在前核期(phCG 24小时)收集，是否表现IP3R-1下调。接触这些试剂不能指示IP3R-1降解(图3)，尽管它们诱导高比率活化。然而，受精和注射SF诱导受体下调(图3C，D)。这些结果表明[Ca2+]i振荡可能是诱导受精样IP3R-1下调所需的。
注射SF和adenophostin A，但不接触SrCl2所诱导的[Ca2+]i振荡诱导IP3R-1降解为了验证多个[Ca2+]i升高是IP3R-1下调所需的想法，用作用于Ca2+信号途径中不同分子靶的三种不同化合物启动小鼠卵振荡。注射SF，推测它通过刺激IP3产生而激发受精样振荡(Jones等，FEBS Lett.437297-300(1998))，可诱导IP3R-1明显下调(图4A，B)。IP3R-1下调是持久的，尽管在注射后1小时内见到明显降解(图4A，B)。注射不可水解的IP3R激动剂adenophostin A也可诱导该受体明显下调(图4C，D)。有趣的是，这种下调始终大于受精或注射SF诱导的降解(p＜0.05)(图4C，D)。最后，卵接触SrCl22或4小时不能诱导IP3R-1量发生任何改变(图5A，B)。总之，这些结果表明小鼠卵受精期间IP3R-1下调不仅仅由于存在多个[Ca2+]i升高，但是可能与磷酸肌醇途径活化启动Ca2+振荡有关。
硫柳汞诱导IP3R-1下调已经表明巯基氧化试剂硫柳汞可诱导[Ca2+]i升高，不刺激IP3产生(Hecker等，Biochem.Biophys.Res.Comm.159961-68(1989)；Bootman等，J.Biol.Chem.26725114-9(1992)；和Missiaen等，J.Physiol.London 455623-40(1992))。因此，我们研究了卵与这种化合物共同孵育启动振荡是否诱导IP3R-1降解。硫柳汞介导的Ca2+反应可诱导受体快速和持续下调(图5C，D)。这些数据表明小鼠卵IP3R-1下调可能不仅仅是由磷酸肌醇途径活化传递信号所致。i振荡模式是激动剂特异性的由于测试的不同激动剂对IP3R-1下调的作用不同，我们研究了这些激动剂的每一种激发的Ca2+反应。如所期望的，注射SF(n＝4只卵)和adenophostin A(n＝6只卵)诱导[Ca2+]i升高类似于受精启动的升高，但频率更高(p＜0.05；分别是图6A和B)。相反，接触SrCl2的卵(n＝5只卵)显示振荡频率较低，且这些升高与第一次升高和后来的升高延迟很久的其它激动剂启动的不同(表1；p＜0.05；图6C)。用硫柳汞刺激的卵(n＝9只卵)显示低频率的Ca2+反应(p＜0.05)。然而，硫柳汞诱导的峰形幅度与SF和adenophostin A诱导的具有可比性，尽管第一次升高幅度较低(表1；p＜0.05)。SrCl2诱导的升高幅度不能与其它激动剂诱导的进行比较，因为在本研究中，fura-2 D被校正以报告细胞内Ca2+水平，可能观察到的荧光改变代表了两种阳离子浓度的改变(Hajnoczky等，EMBO J.163533-43(1997))。尽管Ca2+框架(profiles)不同，所有激动剂诱导的Ca2+反应看来是生理性的，因为90％以上的卵被活化并显示前核形成(数据未显示)。
表1几种普通激动剂诱导小鼠卵[Ca2+]i升高的特性诱导[Ca2+]i振荡的 卵数5分钟内升高数*1st升高的 3rd升高的1st升高持 3rd升高持激动剂 幅度(nM)幅度(nM) 续时间(秒) 续时间(秒)Adenophostin A6 3.9±1.5a*，*620±30a，b530±100a260±65a70±22aSF4 5.0±1.0a870±40a440±35a330±90a，b60±18aSrCl25 1±0.0bND***ND 740±290b360±70b硫柳汞9 1±0.4b330±30b640±90a180±44a70±16a
*振荡频率在第一次升高回到基线值后立即(Adenophostin A或SF)5分钟时间内或在添加SrCl2或硫柳汞后5分钟时间内监测。所有类型是平均数±平均数的标准误(SEM)。3rd升高是任意选取的，代表全部处理中任何后来的峰形。
栏中不具有共同上标的**值具有显著性差异(p＜0.05)。
***未测定(“ND”)，由于Sr2+可以结合fura-2 D和潜在阻碍正确报告细胞内Ca2+值。
蛋白酶体介导的IP3R-1下调已经表明体细胞中IP3R-1下调是由蛋白酶体介导的(Bokkala等，J Biol.Chem.，27212454-61(1997)；和Oberdorf等，BiochemJ.339453-61(1999))。蛋白酶体可能也参与允许受精的哺乳动物卵退出MII静息期的特定蛋白下调(Kubiak等，EMBO J 123773-8(1993)；综述见Whitaker，Rev.Reproduction 1127-135(1996))。因此，我们确定了注射SF诱导的IP3R-1下调是否参与类似的途径。为了完成这个任务，预温育卵并在一种蛋白酶体抑制剂lactacystin存在下用SF注射。允许活化进行2小时，此时取出注射过的卵并准备用于Western印迹。选择2小时的时间点是由于到注射后1小时时，已经观察到IP3R-1明显下调(图4A，B)。在lactacystin存在下孵育的注射了SF的卵中受体降解显著抑制(图7)。此外，用抑制剂预处理和共同孵育的注射SF卵中，极体挤出估计出的细胞周期进展清楚地被延迟(未显示)的发现也可以推断出抑制剂对蛋白酶体活性的有效性。
讨论小鼠卵中本研究的结果表明a)接触乙醇或离子霉素/DMAP引起单一[Ca2+]I升高而诱导的单性生殖活化不诱导IP3R-1下调；b)注射SF、adenophostin A或接触硫柳汞引起的振荡开始激发IP3R-1水平显著降低，类似于受精期间观察到的；c)接触SrCl2引起的Ca2+振荡开始不引起IP3R-1降解；和d)IP3R-1下调可能是由蛋白酶体介导的，因为蛋白酶体抑制剂lactacystin可防止下调。总之，这些资料表明小鼠卵受精后IP3R-1下调与磷酸肌醇/IP3R系统活化有关，本研究中受精期间精子诱导的或注射SF诱导的IP3持续产生可以调节IP3R-1下调。
哺乳动物卵母细胞和卵紧密控制受精前后IP3R-1的数量。卵母细胞成熟期间，IP3R-1蛋白的增加和重新分布旨在使精子穿透后Ca2+释放的量和间隙分布达到最大(Fujiwara等，Dev.Biol.15669-79(1993)；Mehlmann等，Biol.Reprod.511088-98(1994)；和Shiraishi等，Dev.Biol.170594-606(1995))。然而，未完全阐明受精后IP3R-1数量下降的作用和调节，尽管这种下降可能是特异性的，因为在未受精的老化卵(Parrington等，Dev.Biol.203451-61(1998)或接触乙醇或离子霉素而活化的卵中没有观察到。这些结果指出IP3R-1下调不是卵活化本身的结果，可能跟[Ca2+]i升高量或启动振荡的机制联系更密切，本研究均检测了二者。
体细胞中IP3R下调研究表明受体降解需要PLC耦联细胞表面受体的持续刺激，因为引起IP3短暂产生的这些受体活化不能诱导受体降解(Oberdorf等，Biochem J.339-453-461(1999))。为了在我们的研究中产生长期刺激，用SF注射小鼠卵。以前已经表明SF可诱导密切地模拟受精启动的延长[Ca2+]i振荡。(Swann，Development 1101295-1302(1990)；Wu等，Mol.Reprod.&Dev.46176-89(1997)；和综述见Swann等，BioEssays 1979-84(1997))。注射IP3R-1阻滞性单克隆抗体18A10可抑制IP3R介导的这些振荡如Ca2+反应(Oda等，Dev.Biol.209172-85(1999))。在本研究中，SF诱导IP3R-1明显和持续下降，类似于受精后观察到的。近来已经表明SF可刺激来自海胆卵的无细胞提取物中IP3的产生，因此，可能它可以通过刺激IP3长期产生而诱导IP3R-1下调。
我们的发现-注射adenophostin A激发IP3R-1下调，支持这个假说。来自Penicillium brevicoapactum的产物adenophostin A是IP3R的完全激动剂，比IP3效力大约强100倍。此外，adenophostin A具有与IP3R更大的亲和力且不被IP3代谢酶降解(Takahashi等，J Biol.Chem.269369-72(1993))。可能允许这个激动剂结合受体维持更长的一段时间的这些特性可能负责注射adenophostin A卵中几乎全部的IP3R-1下调。硫柳汞也诱导IP3R-1下调的发现表明磷酸肌醇途径的刺激可能不是引起哺乳动物卵中IP3R-1下调的唯一机制。已经表明不激发IP3产生的氧化试剂-硫柳汞可增加IP3R-1与IP3的亲和力(Poitras等，J.Biol.Chem.26824078-82(1993)；Kaplin等，J.Biol.Chem.26928972-8(1994)；and Vanlingen等，CellCalcium 25107-14(1999))，可能通过这个机制，它可以诱导IP3R降解。可供选择地，已证明硫柳汞氧化受体中关键的半胱氨酸残基诱导IP3R构象状态发生改变(Sayers等，Biochem.J 289883-7(1993))，并且通过这种方式，它可以诱导IP3R-1下调。已表明构象改变在IP3R结合IP3后发生，引起通道开放(Mignery等，EMBO J.93893-9(1990))。这种结构改变也可能是受体降解所需的(Zhu等，J.Biol.Chem.2743476-84(1999))。因此，尽管硫柳汞不刺激IP3产生，它可能通过诱导相似的受体改变引起IP3R-1降解。
相比之下，SrCl2不能诱导IP3R-1下调，尽管可诱导持续振荡。已表明SrCl2可通过致敏Ca2+诱导的Ca2+释放(CICR)机制而诱导[Ca2+]i振荡，尽管机制尚不清楚(Cheek等，Development 119179-89(1993))。SrCl2诱导的反应对IP3R-1降解的作用缺乏与这个激动剂诱导卵高比率活化形成鲜明对比。这证明SrCl2诱导的Ca2+振荡能够引起特殊卵蛋白降解，已知它的下降是退出MII所需的(Whitaker，Reviewsih Reproductioh 1127-35(1996))。这清楚表明，与其它卵蛋白的情况相比，[Ca2+]i振荡的存在和引起卵活化不足以诱导IP3R-1下调。
已表明IP3与其受体结合诱导的构象改变可通过增强IP3R遍在蛋白化并因此通过蛋白酶体引起降解而引起IP3R降解(Bokkala等，J.Biol.Chem.27212454-61(1997)；和Oberdorf等，Biochem.J339453-61(1999))。在体细胞中，已表明磷酸肌醇途径的持续刺激导致IP3R-1多遍在蛋白化(Bokkala等，JBiol.Chem.27212454-61(1997)；and Oberdorf等，(1999))，使用表达不能结合IP3的突变IP3Rs-1的细胞的研究表明这些受体不被降解或遍在蛋白化(Zhu等，J.Biol.Chem.2743476-84(1999))。这些研究也证明遍在蛋白化的IP3Rs被蛋白酶体降解，因为添加半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶体抑制剂N-乙酰基-Leu-Leu-正亮氨酸和蛋白酶体高度特异性抑制剂lactacystin都阻断受体降解(Wojcikiewiczetal.，J.Biol.Chem.27116652-5(1996)；(Bokkala等，(1997)；和Oberdorf等，(1999))。我们对小鼠卵的研究表明lactacystin阻断注射SF诱导的IP3R-1下调是蛋白酶体途径参与卵中IP3R-1数量下降的证据。不知道IP3与其受体结合是否是卵中受体降解的唯一信号。在活化中都起作用的Ca2+或蛋白激酶C(PKC)(Gallicano等，BioEssays 1929-36(1997))也可能参与引起IP3R-1降解。我们的发现-不刺激磷酸肌醇途径的硫柳汞可激发IP3R降解，以及诱导振荡的SrCl2不影响受体降解，表明Ca2+或Ca2+依赖性PKC在小鼠卵IP3R-1死亡中都不关键或足够。
仍未确定IP3R-1数量下降如何可以影响[Ca2+]i振荡的频率和持续时间。然而，可能它可以参与受精/激动剂诱导的[Ca2+]i振荡终止或频率/幅度下降，观察作为活化卵进展导前核期(Fissore等，Dev.Biol.166634-42(1994)；Jones等，Development 1213259-66(1995)；和Parrington等，Dev.Biol.203451-61(1998))。重要的是要指出与IP3R-1的这些改变伴发的是卵中两种关键的激酶-促进成熟因子的活性和有丝分裂活化蛋白激酶的活性也下降(Moos等，Biol.Reprod.53692-9(1995))。因此，需要确定这些改变之一在振荡的调节/终止中是否比其它的更重要，或是否同等重要。使用IP3R-1数量不同但细胞周期阶段/激酶水平相似的卵/合子，现在可使用本研究报道的不同激动剂而产生，它允许我们区分IP3R数量和细胞周期阶段对哺乳动物卵中振荡模式的影响。
总之，这里提供的数据表明小鼠卵中IP3R-1下调是由受精和持续刺激磷酸肌醇途径/IP3R系统的激动剂而诱导的。数据也表明蛋白酶体促经可能介导IP3R-1降解。
实施例3使用oscillogenin诱导卵母细胞单性生殖活化的方法卵得自CD-1雌性小鼠(6-12周龄)或其它动物的输卵管，腹膜内注射5IU妊娠母马血清促性腺激素(PMSG；Sigma，St.Louis，MO)引起过度排卵，48小时后注射5I.U.人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma)诱导排卵。hCG后14小时卵回收到添加10％热处理牛血清(CS；Gibco，Grand Island，NY)的Hepes缓冲液(TL-Hepes；Parrish等，Biol.Reprod.381171-80(1988))中。用牛睾丸透明质酸酶去除丘细胞(Sigma)。
如Wu等，Mol.Reprod.Dev.46176-89(1997)和Wu等，Mol.Reprod.Dev.4937-47(1998)所述使用显微注射步骤。简言之，用固定在Nikon Diphot显微镜(Nikon，Inc.，Garden City，NY)上的Narishige操作器(Medical Systems Corp.；Great Neck，NY)给卵显微注射。玻璃微量吸管吸出含0.5mM fura 2右旋糖酐(fura 2D，右旋糖酐10kDa，分子探针；Eugene，OR)或精子提取物(1-20mg/ml蛋白浓度)的微滴。通过气压(PLI-100，picoinjector；MedicalSystems Corp.，NY)将溶液挤到卵细胞质中。注射体积大约5至大约10pl并使得注射化合物在注射吸管中的细胞内终浓度为大约1％。注射精子因子(SF)引起Ca2+振荡和卵母细胞发育完全活化。
如Wu等，(上面1997和1998)前所述监测Fura 2 D荧光，它监测Ca2+振荡。简言之，激发波长在340和380nm，通过500nm屏障滤器，光电倍增管测量发射的光。中密度滤器减弱激发光的强度，荧光信号对整个卵平均。根据Grynkiewickz等，J.Biol.Chem.2603440-50(1985)；Poenie，Cell Calcium 1185-91(1990)；Fissore等，Dev.Biol.159122-30(1993)和Wu等，(1997和1998)计算[Ca2+]i浓度(Rmin和Rmax)。通过观察细胞是否形成前核或经历第一次分裂事件确定单性生殖活化。也可采用生物化学方法通过估计组蛋白H1是否下调，DNA合成是否上调，或本领域技术人员所知的其它方法估计单性生殖活化。
监测[Ca2+]i确定小鼠卵单性生殖活化在注射fura 2D后30-45分钟开始，大约是给予hCG后15小时。监测50μl培养基中放在玻璃盖片上培养皿底部用石蜡油覆盖的各个卵。每隔4秒得到荧光比，进行15至30分钟。注射osillogenin前，利用荧光记录建立基线值。每个波长读数1秒。在卵达hCG后22小时前完成[Ca2+]i监测。所有精子提取级分在1mg/ml蛋白浓度下检测。
实施例4抗oscillgenin抗体将oscillogenin cDNA亚克隆进基于谷胱苷肽S转移酶(GST)基因的表达载体pGEX 3系统也可以制备抗体。在转录起始位点核苷酸测序证实Oscillogenin插入的正确方向和位置。然后，构建体转化大肠杆菌BL21株，加入IPTG刺激GST-oscillogenin融合蛋白表达。亲和层析纯化表达的GDT融合蛋白并用蛋白酶因子Xa(Pharmacia)切割从GST融合伙伴中分离。然后，用苄脒Sepharose 6B珠从制品中去除因子Xa。注射给兔前，用SDS-PAGE和考马斯兰染色检查蛋白纯化。
纯化的重组体或提取的oscillogenin注射给兔以产生多克隆抗体。免疫步骤包括初始注射(40μg oscillogenin)，随后是间隔3至4周20μg蛋白两次加强注射。
可通过亲和纯化、pH梯度洗脱由此产生的多克隆抗体并保存在硼酸盐缓冲液中。
尽管已经根据上面实施例详细描述了本发明，应该理解的是可进行各种修改而不背离本发明的精神。本申请提及的全部引用专利和出版物在这里以其完整形式引入作为参考。
权利要求
1.从精子中分离oscillogenin的方法，包括(A)制备精子胞质级分；(B)将精子胞质级分经过HiTrap蓝亲和FPLC层析柱、羟基磷灰石FPLC柱和Superose 12 FPLC层析柱顺序处理而分离oscillogenin；和(C)获得具有[Ca2+]i释放活性的级分。
2.增强卵母细胞活化的方法，包括步骤(a)在用精子或其它细胞核注射或融合卵母细胞之前、同时或之后立即将oscillogenin注射给卵母细胞，其中在oscillogenin注射前或后已经对所述的卵母细胞进行了处理，去除或灭活了其内源核。
3.权利要求2的方法，其中卵母细胞是哺乳动物卵母细胞。
4.权利要求3的方法，其中哺乳动物卵母细胞是人卵母细胞。
5.权利要求2的方法，进一步包括在含Ca2+的培养基中孵育注射过的卵母细胞。
6.权利要求2的方法，其中精子是哺乳动物精子。
7.权利要求6的方法，其中哺乳动物精子从灵长类、牛、猪、绵羊、马、猫、犬、鼠和山羊中选择。
8.权利要求2的方法，进一步包括用至少一种额外地增强二价阳离子释放的试剂或这类试剂的组合注射卵母细胞的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述试剂选自钙离子载体、蛋白激酶抑制剂和磷酸酶。
10.权利要求9的方法，其中钙离子载体选自离子霉素和A23187。
11.权利要求9的方法，其中蛋白激酶抑制剂选自6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)、星形孢菌素、丁内酯、roscovitine、p34(cdc2)抑制剂、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
12.权利要求9的方法，其中磷酸酶选自磷酸酶2A和磷酸酶2B。
13.权利要求2的方法，进一步包括允许所述活化卵母细胞发育为胚胎。
14.权利要求13的方法，其中所述的胚胎是非人的，并移植给雌性代理母亲。
15.权利要求14的方法，其中允许所述的移植胚胎发育为成活的非人后代。
16.权利要求2的方法，其中培养所述的活化卵母细胞产生胚泡。
17.权利要求16的方法，进一步包括在饲养层上培养所述胚泡的内细胞团的全部或部分以产生培养的内细胞团。
18.权利要求17的方法，其中将所述的培养的内细胞团转移到不同的饲养层上以防止所述的培养的内细胞团分化。
19.权利要求18的方法，其中培养所述的培养的内细胞团产生培养的内细胞团细胞系。
20.增强胞质内精子注射(ICSI)的方法，包括在精子或精子核插入到卵母细胞之前或之后，用oscillogenin注射卵母细胞的步骤。
21.权利要求20的方法，进一步包括在含Ca2+的培养基中孵育注射过的卵母细胞。
22.权利要求20的方法，其中卵母细胞和精子是哺乳动物的。
23.权利要求22的方法，其中卵母细胞从灵长类、牛、猪、绵羊、马、猫、犬、鼠和山羊中选择。
24.权利要求22的方法，其中精子从灵长类、牛、猪、绵羊、马、猫、犬、鼠和山羊中选择。
25.权利要求20的方法，进一步包括用至少一种增强二价阳离子释放的试剂注射卵母细胞的步骤。
26.权利要求25的方法，其中所述试剂选自钙离子载体、蛋白激酶抑制剂和磷酸酶。
27.权利要求26的方法，其中钙离子载体选自离子霉素和A23187。
28.权利要求26的方法，其中蛋白激酶抑制剂选自6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)、星形孢菌素、丁内酯、roscovitine、p34(cdc2)抑制剂、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
29.权利要求26的方法，其中磷酸酶选自磷酸酶2A和磷酸酶2B。
30.单性生殖活化卵母细胞的方法，包括将oscillogenin注射给卵母细胞的步骤。
31.权利要求30的方法，其中卵母细胞是哺乳动物卵母细胞。
32.权利要求31的方法，其中哺乳动物卵母细胞选自哺乳动物组人、灵长类、牛、猪、绵羊、马、猫、犬、鼠和山羊。
33.预测精子[Ca2+]i释放活性的方法，包括测定精子样品中oscillogenin的浓度。
34.预测精子[Ca2+]i释放活性的试剂盒，包含识别和结合oscillogenin或编码oscillogenin的核酸的被标记试剂。
35.权利要求34的试剂盒，其中所述试剂是抗oscillogenin抗体。
36.权利要求31的试剂盒，其中所述试剂是与Oscillogenin mRNA结合的核酸探针。
37.编码Oscillogenin的核酸。
38.权利要求37的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO.1。
39.包含权利要求37的核酸的载体。
40.权利要求37的核酸，其中Oscillogenin是哺乳动物Oscillogenin。
41.权利要求40的核酸，其中哺乳动物Oscillogenin从人、灵长类、牛、猪、绵羊、马、猫、犬、鼠和山羊中选择。
42.权利要求38的核酸编码的Oscillogenin蛋白。
43.Oscillogenin蛋白，包含SEQ ID NO2。
44.Oscillogenin蛋白，包含SEQ ID NO2的至少二十(20)个连续的氨基酸残基。
45.由权利要求1的方法得到的分离的Oscillogenin。
46.由下列步骤得到的重组Oscillogenin蛋白(A)将权利要求39的载体插入合适的宿主中；(B)在适合产生Oscillogenin的条件下培养所述的宿主；和(C)从所述宿主中分离Oscillogenin蛋白。
47.活化卵母细胞的组合物，包含Oscillogenin蛋白和可药用载体。
48.权利要求46的组合物，至少进一步包含磷酸酶、钙离子载体或蛋白激酶抑制剂。
49.识别和结合Oscillogenin的抗体或其免疫原性片段(immunogenic fragment)。
50.权利要求48的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
51.权利要求48的抗体或免疫原性片段，其中免疫原性片段选自Fab，scFv，F(ab’)2和Fab’。
52.权利要求48的抗体或免疫原性片段，其中抗体或免疫原性片段是被标记的抗体。
53.权利要求51的抗体或免疫原性片段，其中抗体或免疫原性片段被同位素或荧光标记标记。
54.权利要求52的抗体，其中荧光标记是碱性蕊香红、荧光素或碱性蕊香红Green。
55.抑制精子生育力的方法，包括给予抑制精子中Oscillogenin活性的试剂的步骤。
全文摘要
本说明书描述了一种新的化合物,Oscillogenin,它是促进卵母细胞被精子受精或卵母细胞单性生殖活化中的活性试剂。说明书公开了分离Oscillogenin调节生育力和增强卵母细胞单性生殖活化用于核转移或ICSI步骤的方法,以及使用Oscillogenin检测精子中它的量和由此检测精子生育力的方法。
文档编号A61P15/16GK1423565SQ01808017
公开日2003年6月11日 申请日期2001年3月21日 优先权日2000年3月22日
发明者R·A·菲索勒 申请人:马萨诸塞大学