心脏毒素的制备方法及用途的制作方法

专利名称：心脏毒素的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和生物医药领域，更具体地，本发明涉及一类化合物，心脏毒素(Cardiotoxin)的制备方法及用途。
背景技术：
动物和昆虫毒腺分泌的毒液，90％以上是蛋白质，含有数十种复杂的蛋白和多肽成分。在中国的传统医学中用这些毒液镇静、止痛已经具有相当长的历史。研究表明，动物和昆虫的毒液的成份可分为神经毒素、心脏毒素、肌肉毒素、细胞毒素以及系列酶类。
关于动物毒素的医疗用途，1981年和1988年的美国专利(US 4341762，US4741902)描述了蛇毒中突触后和突触前神经毒素在治疗神经系统疾病方面的应用。1998年的美国专利(US 5714468)描述了利用肉毒素(Botulinum toxin)，尤其是肉毒素A(Botulinum toxin A)在医学方面的应用。
在熊郁良等人的中国专利申请93121051.8(1995年6月28日申请)，以及PuXC等人，“A novel analgesic toxin(hannalgesin)from the venom of king cobra(ophiophagus hannah)”.Toxicon，1995，111425-1431；以及Giorgi R等人，″Analgesic effect evoked by low molecular weight substances extracted from crotalusdurissus terrificus venom″，Toxicon，1993，101257-1265中公开了某些蛇类神经毒素的镇痛等用途。
蛇毒中最具毒性的成分是心脏毒素和神经毒素。这些成分是具有60到80多个氨基酸残基的多肽类物质，分子量在6500-7000道尔顿之间。这两类毒素的一级结构高度同源，全部是β-折叠，并由四对二硫键稳定结构。它们在眼镜蛇毒液中占多肽和蛋白总量的10～20％。令人惊奇的是，心脏毒素和神经毒素尽管三级结构大体上类似，但这两类毒素的生物活性有巨大的差异。神经毒素结合在突触后的乙酰胆碱受体上，与之不同的是，心脏毒素表现出比较广泛的生理活性。心脏毒素能够引起细胞膜去极化，高浓度的心脏毒素能够最终导致许多组织的发生细胞溶解，尤其是心脏。鉴于心脏毒素的毒性，在本发明之前尚没有将心脏毒素用于药学的报道。
此外，如何分离心脏毒素也是本领域亟待解决的难题。毒液中的磷酸二酯酶具有溶血能力，类胰蛋白酶能够降解血浆和细胞中的功能成份，引起副作用。从医疗的角度来看，应该尽量除去。这些成分可以严重干扰药学实验和医疗用途。
因此，本领域迫切需要开发对心脏毒素的新用途。

发明内容
本发明的一个目的是提供心脏毒素在药学方面的用途。
本发明的另一目的是提供一类分离纯化心脏毒素的新技术。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，它含有治疗有效量的心脏毒素和药学上可接受的载体。
较佳地，所述的心脏毒素是蛇心脏毒素，更佳地选自下组眼镜蛇心脏毒素I、II、III、V、VII、N、1、1a、1d、1e、2、3、3b、3d、4、4N、5、7、10，海蛇的心脏相关毒素，anthopleurin A、anthopleurin B、anthopleurin C及其混合物。
在一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自生理盐水，含白蛋白的生理盐水，含脂质体的生理盐水、重蒸水。
在另一优选例中，药物组合物中所述的治疗有效量是0.001-0.1毫克心脏毒素/千克体重。
在本发明的第二方面，提供了蛇心脏毒素的用途，它被用于制备镇痛、增强记忆、治疗老年痴呆病的药物。
在本发明的第三方面，提供了一种分离纯化蛇心脏毒素的方法，它包括步骤(a)将含蛇心脏毒素的原料上样于装有亲和介质的亲和层析柱，从而使蛇心脏毒素吸附于亲和柱；(b)洗去亲和层析柱未吸附的杂质；
(c)对吸附于亲和层析介质上的蛇心脏毒素进行洗脱，从而获得纯化的蛇心脏毒素；其中，该亲和层析柱中含有一亲和层析介质，该亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的式I所示的亲和配位体 式中，R1选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，巯基，羟甲基，羟乙基，羟丙基；R2选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；X选自CH2，CH，O，S，N，NH；Y选自CH，C；n选自2，3，4，5。
在一优选例中，式I所示的亲和配位体选自下组对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸。
在另一优选例中，在步骤(a)中，亲和介质吸附心脏毒素的条件为pH5.0-9.0的缓冲液，其中盐浓度为NaCl0.0-0.03M；在步骤(c)中，心脏毒素的洗脱条件为pH5.0-9.0的缓冲液，其中盐浓度为NaCl30mM到0.5M。
在另一优选例中，该方法还可以包括步骤(d)对步骤(c)中获得的纯化的心脏毒素进行分子筛凝胶过滤，从而进一步精制心脏毒素。
在本发明的第四方面，提供了一种人工食品，它含有对延缓老年痴呆和改善记忆有效量(较佳地，0.001-0.1毫克心脏毒素/千克体重)的的心脏毒素。


图1是纯化的心脏毒素的12％SDS-PAGE电泳图。从左到右各泳道分别为A泳道为低分子量标准蛋白，从上到下为16,949、14,404、10,700、8,159、6,214、2,512；B泳道为眼镜蛇毒粗品，C为亲和分离时的未吸附组分，D为亲和分离的专一洗脱组分，E、F为Superdex分子筛精制时去除的杂质，G为精制后的眼镜蛇心脏毒素。
图2是利用HPLC对纯化的心脏毒素的纯度鉴定层析图谱。
具体实施例方式
本发明的发明点在于，通过对心脏毒素纯化方法的改进，获得高纯度的心脏毒素，并发现了心脏毒素在镇痛、改善记忆，治疗老年性痴呆方面的用途。
在本发明的一个优选例中，心脏毒素在小鼠的镇痛模型中获得明显的镇痛效果。在热板法、扭体法模型中，心脏毒素的生理盐水溶液(0.03，0.06，0.3mg/kg，三个剂量组)表现出比盐酸吗啡(6mg/kg)镇痛效果更强、持续时间更长的作用特点。
在另一个优选例中，心脏毒素在多个损伤模型中获得明显的改善学习记忆效果。在跳台模型、穿梭箱模型、Y型迷宫、水迷宫中，心脏毒素生理盐水溶液(0.06，0.12mg/kg)表现出改善学习记忆功能的效果。
本发明的亲和生产工艺的特点是低成本、高效率和步骤简便，产品的纯度达到95％以上，产品回收率90％。同时具有生产快速、工艺稳定的特点，所用的亲和配位体可以耐受医药生产中必需的现场在线清洗和消毒，方便地满足药品生产管理规范(GMP，Good Manufacturing Practice)。
亲和层析，又称为生物选择性吸附层析，已经成为纯化生物大分子活性物质不可缺少的分离技术。随着对生物制品中活性成分的纯度和需求量的增加，杂质含量的降低，传统分离技术如凝胶过滤和离子交换层析技术再也不能满足工业生产和学术研究的要求。
与其它方法相比，亲和层析方法具有以下几个明显的特点。亲和层析介质允许对生物分子选择地吸附和解离，可以取得很高的纯化倍数，常常为1000多倍。此外，蛋白在纯化过程中不仅得到浓缩，当结合到亲和配位体上时，蛋白的性质也更加稳定；其结果又提高了目标产品的活性回收率。因此，亲和分离技术非常适用于处理体积大，浓度低的生物活性物质。
在大规模生产的纯化工艺中，采用亲和层析技术可以大大减少纯化过程的步骤，从而减少了合格产品的生产时间和成本。当下游生产成本占总生产成本的80％时显得更加重要。在纯化过程的任何环节都可以使用亲和层析技术，但采用的越早，获得的经济效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology，4，954-958，1986)对生物制品生产工艺调查的结果显示，在所有被考察的工艺中，一步纯化效果最佳的单元操作中，有45％是利用亲和步骤获得的。
亲和分离介质的关键是亲和配位体(也可称为“亲和配位体”)。亲和配位体必须能够选择性地和可逆地吸附生物大分子。传统的亲和配位体为亲和介质的成功使用奠定的基础。然而，在工业生产中，天然的亲和配位体，如抗体、辅酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺点最突出的因素是成本昂贵，生物和化学性质不稳定，生产中难于维持结合活性，也不能经受在线清洁和消毒。此外，还可能被其它物质，如病毒和内毒素污染。
根据眼镜蛇心脏毒素的结构和性质，本发明人筛选出一种成本低，亲和力高的亲和配位体。将该类亲和配位体固定于固相载体后形成的分离材料，不仅能够提供高效的纯化倍数、重复性的结果，而且配位体极少脱落。更适合工业化、大规模生产医用和试剂用蛇心脏毒素，尤其是眼镜蛇心脏毒素。
发明人通过合成组合化学亲和配基库，亲和筛选，得到可以专一纯化心脏毒素的亲和配位体，其结构如式I所示。
在结构上，式I化合物具有以下特征围绕环状中心，一个碱性和酸性基团以间位或对位连接于中心环上。其中R1可以是任何碱性基团，较佳地，R1选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，巯基，羟甲基，羟乙基，羟丙基；R2可以是任何的酸性基团，如羧基，磺酸基，磷酸基等。
较佳地，该中心环是五元环或六元环，构成的环的原子选自下组碳原子、氮原子、氧原子和硫原子。更佳地，该中心环选自苯环和环己烷环。
一些代表性的可用于本发明的亲和配位体例子包括(但并不限于)对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸。它们是已知的化合物，可用常规方法合成或购得。
可用于本发明的固相载体可以是亲和层析领域中任何具有活性连接基团(如羟基、氨基、羧基、环氧基、卤素等)的固相载体。本发明的新颖的亲和层析配位体还可通过桥连分子而连接于常用的固相载体上。代表性的固相载体包括(但并不限于)葡聚糖凝胶如Sephadex，交联的葡聚糖珠如PDX，烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)的交联共聚物如Sephacryl，琼脂糖凝胶如Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF，琼脂糖和葡聚糖的交联共聚物如Superdex、高度交联的琼脂糖和葡聚糖如Superose，N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟基化交联接头的共聚物珠如Trisacryl、Trisacryl plus，琼脂糖珠如UltrogelA，聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠如Ultrogel AcA，纤维素珠如高孔隙度的再生纤维素珠、涂有聚合物的硅胶，或它们的混合物。
将本发明的亲和配体偶联于或固定于固相载体的方法可选用本领域常规的方法，这取决于所用的固相载体种类。例如用环氧氯丙烷作为交联剂或马来酸酐等进行偶联。对固定化技术的一般综述，可参见Turkova，J.(1993)″Bioaffinity Chromatography″，Elsevier Science，London，U.K。
在本发明的新工艺中，可用本发明方法分离纯化的含心脏毒素的原料可以是任何含心脏毒素的原料，例如采集的眼镜蛇粗毒、基因工程表达产物。
首先将含眼镜蛇心脏毒素的原料作适当稀释，例如配成1-12％(较佳地2-10％，最佳地4-8％)的溶液。
为了提高亲和层析的效率，可以对含眼镜蛇心脏毒素的原料或其稀释液进行换缓冲液处理。例如经过Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，将缓冲液交换为结合缓冲液，如磷酸缓冲液(20mM，pH6.0)。
之后，对于经过换缓冲液处理之后的样品，进行亲和层析，从而获得纯化的眼镜蛇心脏毒素。具体地，眼镜蛇心脏毒素的亲和层析可以包括上样(吸附)、洗涤和洗脱步骤。此外，对于亲和层析后的眼镜蛇心脏毒素洗脱液，还可用阴离子交换、阳离子交换或凝胶过滤层析以及超滤等方法对眼镜蛇心脏毒素进行进一步纯化。
在眼镜蛇心脏毒素的亲和层析步骤中，一种结合条件是使用如下结合缓冲液缓冲液的盐浓度为0.005-0.03M，pH5.0-9.0；更佳地，0.01-0.02M，pH5.5-7.0；最佳地，结合缓冲液是5mM磷酸缓冲液(pH6.0)或Tris-HCl缓冲液(6.0)。常用的盐包括氯化钠、氯化钾等。
一种洗脱条件是使用如下的洗脱缓冲液缓冲液的盐浓度为0.005-2.0M，pH2.0-5.0或9.5-11.0；较佳地，盐浓度为0.01-0.50M，pH3.5-4.8；最佳地是15mM醋酸缓冲液(pH4.6)(如果需对眼镜蛇心脏毒素进行进一步精制，就不必再换缓冲液)。
在本发明的一个具体优选例中，将原料上样于装有亲和分离材料的亲和层析柱，在磷酸缓冲液(20mM，pH6.0)的条件下吸附眼镜蛇心脏毒素。用足够量的磷酸缓冲液(20mM，pH6.0)洗去未吸附的杂质后，再用醋酸溶液(15mM，pH4.6)专一洗脱眼镜蛇心脏毒素。这个工艺制备的眼镜蛇心脏毒素半成品的纯度为95％左右。产品回收率在90％以上。
纯化的心脏毒素可用常规配制成药物组合物，用于镇痛、改善记忆力等用途。此外，还可添加在食品中，制成保健食品。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果例如可通过化学标记或抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，治疗有效量为给予个体约0.001-0.2毫克/千克，更佳地0.001-0.21毫克/千克。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是动物；尤其可以治疗人对象。
直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括口服、透皮给药等。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以及本发明所附录的参考资料上载明的公开方法。
实施例1制备亲和分离材料将化合物间氨基苯甲酸(20g)，溶解于50-400ml Na2CO3(0.2-0.8M，pH8.0-12.0)，加入到盛有环氧基琼脂糖分离介质(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃摇振过夜。在停止之前，加入10ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中珠状纤维素，经0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的琼脂糖基质的亲和分离材料SK 4，加入用20％乙醇储存待用。
实施例2眼镜蛇心脏毒素的纯化(1)换缓冲液处理取5g眼镜蛇蛇毒素粗品溶解于20ml的，过滤除去沉淀。上样到已经用柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2)平衡的Sephadex G-25柱(5×20cm)上，继续用磷酸缓冲液(20mM，pH6.0)洗脱。收集280nm的吸收峰，得到30ml样品。
(2)亲和层析取亲和分离材料(10ml)装入一次性聚丙烯层析柱(2×16.0cm)中，用150ml柠檬酸(5mM)、Na2HPO4(20mM)缓冲液(pH6.5-7.2)，NaCl(0.01-0.03M)平衡柱后，加入10ml眼镜蛇粗毒(10mg/ml)样品，用20ml平衡液洗去未吸附的物质后，再用含NaCl 0.5M的甘氨酸缓冲液(50mM，pH9.6)100ml洗脱层析柱上的吸附的心脏毒素成份，然后用SDS-PAGE检测结果。
同时，用HPLC检测纯度，所用条件如下仪器HP1100 HPLC系统。
柱C18，0.5×20cm；流速为1.0ml/min，60min，Minotor0.8A.X 2mV缓冲液A.HO2CCF3(0.3％)；B.乙腈HO2CCF3(0.3％)(90∶10)如图1和图2所示，结果表明，心脏毒素回收率达到眼镜蛇粗毒的25％。一步亲和纯化的心脏回收率可达到94％以上，纯度为90.4％，而再经一步Superdex分子筛精制后可达到99％。测定纯化后的心脏等电点pI值为9.468，与文献值(9.5)相符合；用质谱(ESI)测得的分子量为6700-6800道尔顿之间。N-端测序得到的15个氨基酸序列为LKCNKLVPLFYKTCP。
实施例3镇痛实验——热板法调节水温，控制热板温度在55±0.5℃，热板预热30分钟以平衡温度。将筛选合格的小鼠(清洁级昆明种小鼠，雌性，体重18-22克，购自上海中医药大学(医动字第02-24-3号))。按每只小鼠0.1ml/10g体重的给药量腹腔注射(ip)给药。分别测定给药前、给药后15、30、60、75、90、105、120分钟的小鼠痛域值。如60秒仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛域值以60秒计算。
如下表所示，结果表明心脏蛇毒(0.03，0.06mg/kg)腹腔注射给药具有明显的镇痛效果。
表1心脏蛇毒对小鼠镇痛的效果——热板法

注与给药前相比，aP＜0.001；bP＜0.01；cP＜0.05小鼠热板法镇痛实验中，给药15分钟后，心脏毒素(0.03，0.06mg/kg)与盐酸吗啡(6mg/kg)一样，表现镇痛作用(p＜0.01)，且有量效关系，延长观察时间发现，吗啡的镇痛作用只出现在给药后的30分钟以内。40分钟以后不再具有镇痛作用。而眼镜蛇心脏毒素(0.06mg/kg)在第75分钟后出现第二次镇痛效果峰值(p＜0.001)。
实施例4镇痛实验——醋酸扭体法小鼠(清洁级昆明种小鼠，体重18-22克，购自上海中医药大学(医动字第02-24-3号))，雌雄各半，按体重随机分组。小鼠分别按每只0.1ml/10g体重的给药量ip给药。15分钟后，按每只小鼠0.1ml/10g体重的给药量腹腔注射2％冰醋酸。以5分钟为间隔累计记录小鼠扭体次数，持续记录120分钟。
如下表所示，结果表明心脏蛇毒(0.06，0.3mg/kg)腹腔注射给药具有明显的镇痛效果。
表2心脏蛇毒对小鼠镇痛的效果——钮体法

注和生理盐水组相比aP＜0.001，bP＜0.01，cP＜0.05)
在醋酸扭体法模型中，给药30分钟后，眼镜蛇心脏毒素(0.06，0.3mg/kg)能显著减少醋酸引起的扭体次数(p＜0.001)，与盐酸吗啡(6mg/kg)相似，并表现量效关系，约40分钟后蛇毒镇痛强度高于盐酸吗啡组。
实施例5急性毒性测定小鼠(清洁级昆明种小鼠，体重18-22克，购自上海中医药大学(医动字第02-24-3号))，雌雄各半，按体重随机分为5组，按“近似LD50测定法”方法，采用腹腔注射给药，观察小鼠的反应和变化。按BLISS法计算LD50值。
小鼠急性毒性实验表明，眼镜蛇心脏毒素的LD50值为2.2mg/kg，用于眼镜蛇心脏毒素分离的分离介质SK4的LD50值为65mg/kg。
实施例6学习记忆实验-Y型电迷宫法中心辐射状三臂迷宫，将小鼠(清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22克，购自中国科学院上海实验动物中心(实验动物证号中科沪动管D99-004))放入起步区，适应环境1-2分钟，打开起步区挡板，同时底部铜栅开始通电，通以35v交流电。小鼠第一次到达安全区时，关闭安全区挡板，小鼠在安全区内适应环境1分钟左右。将小鼠轻柔的重新放置在起步区，适应环境30秒钟左右，打开起步区挡板，通电。小鼠在起步区挡板打开后直接进入安全区为反映正确。以小鼠连续连续10次中正确8次为训练至学会的标准。24小时后，将已经学会的小鼠随机分组。按照给药方案给药，并测试记忆成绩。以固定测试10次中的正确次数作为评价指标。以石杉碱甲(中科院上海药物研究所供应)为阳性对照，采用东莨菪碱形成损伤模型(氢溴酸东莨菪碱购自上海禾丰制药有限公司)。所有数据以x±SD表示，以t检验统计组间差异。
表3、方案给药

如下表所示，结果表明心脏蛇毒(0.06，0.12mg/kg)腹腔注射给药能明显提高小鼠在Y型电迷宫模型中的记忆能力。表4心脏蛇毒对东莨菪碱诱发的小鼠学习记忆障碍的影响——Y型电迷宫法

(注c-P＜0.01；b-P＜0.05；a-P＜0.1)实施例7学习记忆实验-穿梭箱法小鼠(清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22克，购自中国科学院上海实验动物中心(实验动物证号中科沪动管D99-004))适应环境2分钟左右。在小鼠所在一侧给蜂鸣声刺激，延迟5秒以后同侧35v交流电刺激。小鼠逃至对侧安全区时，蜂鸣声与电刺激同时停止。小鼠在蜂鸣声开始后5秒之内，到达安全区为正确反映。训练至小鼠在连续5次中正确4次为学会的标准。24小时后，将已学会的小鼠随机分组，用秒表记录下每只小鼠从蜂鸣声开始到到达安全区的时间作为反应时，和重新训练至5次中正确4次所需要的训练次数作为评价指标。以石杉碱甲(中科院上海药物研究所供应)为阳性对照，采用东莨菪碱形成损伤模型(氢溴酸东莨菪碱购自上海禾丰制药有限公司)。所有数据以x±SD表示，以t检验统计组间差异。
表5方案给药

如下表所示，结果表明心脏蛇毒(0.06，0.12mg/kg)腹腔注射给药能明显提高小鼠在穿梭箱实验模型中的记忆能力。
表6心脏蛇毒对东莨菪碱诱发的小鼠学习记忆障碍的影响——穿梭箱法

(注c-P＜0.01；b-P＜0.05；a-P＜0.1)实施例8学习记忆实验-跳台法将小鼠放至箱中熟悉环境30-60秒。将小鼠(BABL/C小鼠，雌雄各半，体重18-25克，购自中科院上海实验动物研究中心(实验动物证号中科沪动管D99-004))头朝角落放在平台上，同时开始记时，至小鼠两只前足同时接触底部铜栅，重复记时3次。小鼠第3次跳下平台时，开始电击(30v，50Hz)，至小鼠逃回平台。记录小鼠受到电击后跳下平台的潜伏期，超过3分钟，以3分钟记。训练至小鼠在平台上3分钟不下来，为学会的标准。24小时后按给药方案给药，记录潜伏期和连续通电5分钟小鼠受电击次数。所有数据以x±SD表示，以t检验统计组间差异。以石杉碱甲(中科院上海药物研究所供应)为阳性对照，采用东莨菪碱形成损伤模型(氢溴酸东莨菪碱购自上海禾丰制药有限公司)。所有数据以x±SD表示，以t检验统计组间差异。
表7方案给药

如下表所示，结果表明，心脏蛇毒(0.03，0.06，0.12mg/kg)腹腔注射给药能明显提高小鼠在跳台实验模型中的记忆能力。
表8心脏蛇毒对东莨菪碱诱发的小鼠学习记忆障碍的影响——跳台法

(注c-P＜0.01；b-P＜0.05；a-P＜0.1)实施例9学习记忆实验-Morris水迷宫实验所用水迷宫标准如下(cm)直径74，深度48，水深25，平台直径7.3，平台高度24。先将小鼠(清洁级C57BL/6J小鼠，雌雄各半，体重18-22克，购自中科院上海实验动物研究中心[动物证号中科动管第003号])放置于平台上30秒。将小鼠分别从四个不同方位(SW，NW，NE，SE)面朝壁放入水中，至寻找到平台，并在平台上停留30秒。每只小鼠允许最长游泳时间为120秒，超过120秒则用筛引导只平台，并停留30秒。每只小鼠每天训练4次(分别以4个不同方位为出发点)，每次间隔30秒。记录小鼠寻台时间，作为学习成绩。连续训练5天后，按学习成绩将小鼠分为6组，每组10只。各组间寻台时间不存在统计学差异(P＞0.05)。24h后按给药方案给药。将所有小鼠从同一起点(与平台所在位置相对)出发，记录寻台时间，游泳路程。以石杉碱甲(中科院上海药物研究所供应)为阳性对照，采用东莨菪碱形成损伤模型(氢溴酸东莨菪碱购自上海禾丰制药有限公司)。所有数据以x±SD表示，以t检验统计组间差异。
表9方案给药

如下表所示，结果表明，心脏蛇毒(0.06，0.12mg/kg)腹腔注射给药能明显提高小鼠在水迷宫实验模型中的记忆能力。
表10心脏蛇毒对东莨菪碱诱发的小鼠学习记忆障碍的影响——水迷宫法

(注c-P＜0.01；b-P＜0.05；a-P＜0.1)实施例10剂量换算本发明所举证之实例为动物实验结果，按经验剂量换算公式dB＝dA*RB/RA*(WA/WB)1/3式中，dA和dB是A、B两种动物的每公斤体重剂量(mg/kg)，RARB是动物体型系数，WAWB是动物的体重(kg)。经验数据为小鼠体型系数为59，人体型系数为100，成年小鼠体重20g，成人体重70kg。
本发明所涉及之心脏毒素在小鼠的有效剂量为0.03-0.12mg/kg，按此公式推算，人的剂量为0.0034-0.0136mg/kg。考虑到生物实验10％的误差和多种小鼠的差异，本发明保护在心脏毒素在人的有效使用剂量为0.001-0.1mg/kg。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于， 它含有治疗有效量的心脏毒素和药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的心脏毒素选自下组眼镜蛇心脏毒素I、II、III、V、VII、 N、1、1a、1d、1e、2、3、3b、3d、4、4N、5、7、10，海蛇的心脏相关毒素，anthopleurin A、anthopleurin B、anthopleurin C及其混合物。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体选自生理盐水，含白蛋白的生理盐水，含脂质体的生理盐水、重蒸水。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的治疗有效量是0.001-0.1毫克心脏毒素/千克体重。
5.心脏毒素的用途，其特征在于，用于制备镇痛、增强记忆、治疗老年痴呆病的药物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的心脏毒素选自下组眼镜蛇心脏毒素I、II、III、V、VII、N、1、1a、1d、1e、2、3、3b、3d、4、4N、5、7、10，海蛇的心脏相关毒素，anthopleurin A、anthopleurin B、anthopleurin C及其混合物。
7.一种分离纯化蛇心脏毒素的方法，它包括步骤(a)将含蛇心脏毒素的原料上样于装有亲和介质的亲和层析柱，从而使眼镜蛇心脏毒素吸附于亲和柱；(b)洗去亲和层析柱未吸附的杂质；(c)对吸附于亲和层析介质上的蛇心脏毒素进行洗脱，从而获得纯化的蛇心脏毒素；其特征在于，该亲和层析柱中含有一亲和层析介质，该亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的式I所示的亲和配位体 式中，R1选自下组的碱性基团氨基，单取代氨基，巯基，羟甲基，羟乙基，羟丙基；R2选自下组的酸性基团羧基，磺酸基，磷酸基；X选自CH2，CH，O，S，N，NH；Y选自CH，C；n选自2，3，4，5。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，式I所示的亲和配位体选自下组对氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、3-氨基环己烷羧酸、4-氨基环己烷羧酸；和/或所述的固相载体选自葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖的交联共聚物、交联的琼脂糖和葡聚糖、N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟基化交联接头的共聚物珠、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠、和涂有聚合物的硅胶。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，亲和介质吸附心脏毒素的条件为pH5.0-9.0的缓冲液，其中盐浓度为NaCl0.0-0.03M；在步骤(c)中，心脏毒素的洗脱条件为pH5.0-9.0的缓冲液，其中盐浓度为NaCl30mM到0.5M。
10.一种人工食品，其特征在于，它含有对延缓老年痴呆和改善记忆有效量的心脏毒素。
全文摘要
本发明提供了一种药物组合物，它含有治疗有效量的心脏毒素和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可有效地镇痛和改善学习记忆。本发明还提供了心脏毒素的亲和纯化方法。
文档编号A61P25/04GK1444991SQ02111090
公开日2003年10月1日 申请日期2002年3月20日 优先权日2002年3月20日
发明者王霆 申请人:上海拟生生物科技有限公司