人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物的制作方法

专利名称：人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的人源化抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体。另外，本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及含有该单克隆抗体的药物组合物。
背景技术：
一百多年前人们就已发现，肿瘤组织较正常组织富含血管，但人们一直在争论肿瘤是由已经存在的血管提供营养，还是由新生血管提供营养，并且普遍认为这种血管反应只是一种炎症反应，并非肿瘤生长所必需。1971年，Folkman最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，但当时这种观点并未为人所接受。随着8年后毛细血管内皮细胞培养技术的建立，11年后第一个血管生成抑制剂的发现，13年后第一个血管生成活性蛋白的纯化等一系列工作的完成，这一观点为越来越多的证据所支持，并使这一领域成为肿瘤研究的热点及肿瘤治疗的新策略。
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2mm3。
肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因。肿瘤侵袭转移是一复杂的多阶段过程，可以概括为原发瘤增殖、肿瘤新生血管生长；瘤细胞侵袭基底膜；穿入血管或淋巴管；在循环系统中存活，形成瘤栓并转运到远隔靶器官；滞留于靶器官的微小血管中；穿出血管并形成微小转移灶；肿瘤血管形成，转移癌灶增殖。可见在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，无论肿瘤转移的起始或终末阶段，血管生成均发挥着重要作用。
肿瘤组织中微血管密度的测定有助于肿瘤的诊断及预后判断，如乳腺肿瘤微血管密度与其转移性能呈正相关。对于淋巴结阴性的乳腺癌患者，多因素分析表明，微血管密度相对于肿瘤的分级、肿瘤大小、雌激素受体阳性或其他标志物来说，是判断乳腺癌转移潜能的更好指标，这一结果已进一步为5年前瞻性研究所证实。此外，其他多种肿瘤微血管密度亦与转移、复发、预后关系密切，如头颈鳞状细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、脑瘤、非小细胞肺癌、直肠癌、骨髓瘤等。值得注意的是，新生血管的存在并不能用于良性、恶性肿瘤的鉴别，如肾上腺腺瘤属于良性肿瘤，但却是富血管的。由此可见，肿瘤的生长、转移、复发、预后与血管生成密切相关，以肿瘤的血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂，有可能使实体瘤的治疗效果得到较大提高。
肿瘤血管形成是肿瘤生长、转移的基础(Folkman J.N Engl J Med，1971，285(21)1182)。自从Weidner等(Folkman J.J Biol Chem，1992，267(16)10931)报道了肿瘤组织微血管密度(MVD)是乳腺癌患者的一个独立的预后指标以来，在许多肿瘤，包括原发性肝癌中MVD的预后价值都得到了肯定(王东，高奉浔，陈俐等，骨肉瘤微血管密度与预后的研究，中华病理学杂志，1997，26(5)266)。肿瘤新生血管的形成是其生长、浸润、转移的重要条件。实体瘤的生长和转移是依赖于血管生成的，因此干扰和阻断肿瘤血供是有效的治疗方法。许多研究表明肿瘤内微血管密度(Intratumoral microvessel density，MVD)与骨肉瘤的转移和预后有关(王东等，同上)，在多种血管生成相关因子中，血管内皮生长因子(VEGF)持续高表达，这证明VEGF是人体骨肉瘤重要的血管生成相关因子之一。
业已证明大多数实体恶性肿瘤能分泌多种促血管生长因子，诱导血管生成，支持肿瘤生长(Folkman J，Science，1987，235(4787)442)。肿瘤诱生的血管无论在病理、生理还是形态功能上都有着特征性，这些都为传统的化疗药物构成了“血瘤屏障”，使得肿瘤细胞得以逃逸化疗药物的杀伤(Hori K L.J Cancer Res，1991，82(1)109)。识别肿瘤血管生成过程与正常血管生成过程的差异，选择性攻击肿瘤血管特异性靶部位，将大大加速肿瘤治疗进程。
VEGF最初是从牛垂体滤泡星状细胞培养物中纯化分离出来的强烈的内皮细胞有丝分裂原，通过与内皮细胞上的酪氨酸激酶受体fltl和KDR/flkl特异性结合，使受体自身磷酸化而激活细胞内信号传导通路，产生生物效应如诱导内皮细胞增殖、迁移，调节内皮细胞整合素及蛋白酶激活因子的表达，增加微血管通透性，促进血浆蛋白外漏，基底膜降解，导致新的基质及新生血管腔形成。在迄今发现的20多种多肽类血管生长因子中，VEGF是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子(Ferrara N.Endocr Rev，1997，18(1)4)，在多种原发性恶性肿瘤组织中均呈高表达(Brown L F等Human Pathol，1995，26(1)86)；新近Takahashi(Cancer Res，1995，55(18)3964)发现VEGF高表达与结肠癌转移的发生有密切联系，提示VEGF在原位肿瘤的形成和生长及转移瘤的形成中均起着举足轻重的作用。已经证实其它多种血管生长因子是通过直接或间接诱导、刺激VEGF表达而发挥作用的，如TGF-α、bFGF、TGF-β、TNF-α、KGF等均可上调VEGF的表达(Li J，Hampton T等，J Clin Invest，1997，100(1)18；Brown L F等，Detmar M，Claffey K，et al.Vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factora multifunctional angiogenic cytokine.Exs，1997，79233)。因此，VEGF是阻断肿瘤血供的理想靶点。Kim KJ利用VEGF单抗成功地抑制了横纹肌肉瘤、恶性胶质瘤、平滑肌肉瘤在裸鼠体内的生长；Asano(Asano M等，Cancer Res，1995，55(22)5196)利用VEGF121单抗MV303不仅抑制了体外培养的人脐静脉内皮细胞生长及BALB/C鼠体内人纤维肉瘤细胞株HT-1080的生长，而且抑制了BALB/C鼠转移瘤的形成。我们的实验证实VEGF多克隆抗体对骨肉瘤细胞OS-732的血管生成及肿瘤细胞的生长也有抑制作用，且VEGF多克隆抗体作用较VEGF单抗可能更全面，较小剂量时即能比较完全地阻断VEGF的作用。
血管生成过程涉及一系列形态学及生化学改变。形态学改变包括内皮细胞降解母体小静脉的基底膜、内皮细胞的定向运动、发生有丝分裂、血管腔形成、芽式生长并形成血管襻、产生新的基底膜、外膜细胞的形成等一系列步骤。通常情况下，内皮细胞处于休眠状态，是体内极度静止的细胞。内皮细胞的更新需要数百天，而骨髓细胞的更新平均只需5天，分裂速率约6×109细胞/小时。血管生成中，微血管内皮细胞的增殖速度同骨髓细胞相同，其生化学机制涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡。
目前已分离和纯化了20多种血管生成因子和相关因子，至少15种血管生成抑制因子。血管生成因子包括血管内皮细胞生长因子(VPF/VEGF)、酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、血管生成素、胎盘生长因子(PIGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-8、肿瘤坏死因子α(TNFα)等。在所有的血管生成因子中，对VEGF及bFGF的研究最为深入。VEGF具有增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促使内皮细胞的迁移等多种作用，是已知的最强的血管通透剂。VEGF选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种型酪氨酸激酶受体flt-1和KDR，通过磷酸肌醇特异性磷酯酶C使胞内IP3浓度升高而发挥作用。
以血管生成的各个环节及其发生过程中的生化改变为靶点，研制血管生成抑制剂，控制肿瘤生长和转移，将成为肿瘤防治的一个重要途径。总体来说，血管生成抑制剂的研究主要有如下4种策略(1)阻断内皮细胞降解周围基质的能力；(2)直接抑制内皮细胞的功能；(3)阻断血管生成因子的合成和释放，拮抗其作用；(4)阻断内皮细胞表面整合素的作用。
目前发现的具有抗血管生成能力的因子主要有VEGF等的受体和抗VEGF单克隆抗体。广泛的研究证明，抗VEGF单抗具有明显的抑制肿瘤血管生成的功能。单克隆抗体能抑制人血管内皮细胞的增殖，在体内能抑制肿瘤新生血管形成，从而抑制肿瘤的生长和转移，其抑制率可达49％-70％。
综上所述，抗VEGF单克隆抗体在肿瘤治疗上显示出有巨大的应用前景。
然而，目前本领域中生产该VEGF单克隆抗体的细胞株的表达水平仅为50-100毫克/升，这远不能满足大规模生产单克隆抗体的需要。而且，目前市售的VEGF单克隆抗体制品的活性也不高。因此，本领域中仍迫切需要提供一种活性和表达量有所改善的VEGF单克隆抗体。
发明目的本发明的目的是提供一种重组抗人VEGF单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供编码上述抗VEGF单克隆抗体的DNA分子。
本发明的另一目的是提供一种含有上述单克隆抗体的药物组合物。
本发明还有一个目的是提供制备上述单克隆抗体的方法。
为达到上述发明目的，本发明一方面提供了一种抗人VEGF单克隆抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其中轻链可变区具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。
在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO4所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO2所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其中该宿主细胞被上述表达载体转化。该宿主细胞优选哺乳动物细胞，更优选CHO细胞。
本发明第五方面提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，该药物组合物含有药学上有效量的上述人单克隆抗体以及药学上可接受的载体。
本发明第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA编码序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
本发明的优点在于本发明的单克隆抗体的生理活性和在宿主细胞(如CHO细胞)中的表达量比现有的单克隆抗体有显著提高。本发明的其它目的和优点可通过下面的详细描述得知。


图1显示了本发明所用pMG18载体的酶切图谱。图中Ck表示抗体kappa轻链的恒定区基因；IgG1恒定区表示人抗体IgG1的重链恒定区基因；pA表示SV40加poly A位点。
发明详述本发明涉及一种重组的抗人VEGF单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中轻链可变区具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQID NO1所示的氨基酸序列。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。
本发明还提供了编码本发明人源化抗VEGF单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO4所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO2所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。
在获得编码本发明人源化抗VEGF单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。
首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。但是，本领域普通技术人员也能预计到，将编码本发明单抗重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列分别插入不同的表达载体中进行共表达也能获得本发明的抗VEGF单克隆抗体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一读框内。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体，以及可购得的表达载体pMG18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具开发》(DEVELOPMENT OF TOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES)，A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belams State University Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)。
随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，优选哺乳动物细胞。通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press，Kruseand Patterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。尽管在下文实施例中，本发明仅列举了以CHO细胞作为宿主细胞的例子，但是本领域技术人员在阅读了本发明的详细描述和具体实施例可以知道，本发明也能采用上述这些细胞系。
用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染诸如CHO细胞等宿主细胞。
然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的人源化抗VEGF单克隆抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明单抗以及药学上可接受的载体。例如，本发明的药物组合物可用来治疗胃癌、肝癌。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的突变蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用灌注和其它治疗方式。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例1从抗体库中筛选VEGF的抗体可变区基因1)人源抗体库的构建按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法构建人源抗体库。
2)筛选将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。
12000rpm高速离心10分钟，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，保存备用。其滴度应在2×1011以上。以纯化的VEGF蛋白(购自深圳晶美公司)为抗原，包被25毫升细胞培养瓶。在包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体颗粒，37℃温育1小时。然后，倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。
重复上段所述步骤共4次。
将上述获得的细胞稀释至100000细胞/毫升，然后在加入0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4度备用。
取96孔板10块，每孔中加入VEGF(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
通过上述过程共筛选出415个阳性克隆，根据读数确定其中5个亲和力最强的克隆。将这5个克隆分别接种在100毫升LB培养基中，在37℃260rpm条件下震荡培养9小时后加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养10小时。然后用Pharmacia的“重组人scFv纯化系统”参照厂家说明书分离纯化重组scFv抗体蛋白。抽提纯化的重组scFv蛋白质用于亲和力研究。亲和力研究证明，在这415个阳性克隆中有3个具有较高的亲和力，它们分别命名为5H4、9D2和3G6。其中，3G6即具有最高的表达量，又具有最高的亲和力，将此克隆将用在后续的研究。
3)抗体可变区编码序列向表达载体的克隆将上述3G6克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒纯化质粒DNA。
用XbaI和NheI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取350bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区编码序列。
用HindlII和Bsi WI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取320bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区编码序列。
然后首先将上述重链可变区编码序列插入到表达载体pMG18-3K(参见DEVEIOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASED ONINCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B152TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State University ScorinaAv.4，Minsk 220080 Belarus)的XbaI/NheI位点中，再用Hind III和Bsi WI将上述抗体轻链可变区编码序列插入到插入有重链可变区编码序列的pMG18-3K的HindIII/BsiWI位点中，构建成人源化抗VEGF抗体基因的表达载体。
4)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选上述步骤3)中构建的带有抗体基因的表达载体在大肠杆菌DH5a菌株接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(UltrapurePlasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在RPMI 1641培养基上进行培养，对上清进行Western印迹实验，根据染色反应判断表达强度，挑选出10个表达较强的克隆作为候选细胞株(见表1)。
5)单克隆抗体的纯化上述单抗的纯化采用Protein A(Pharmacia公司)亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化，并用SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。以上亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。将这些样品用于以下的进一步分析与研究。
实施例2抗体基因在CHO细胞中表达强度的研究将上述筛选得到的高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，采用ELISA法测量抗体的表达量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。测得上述10个候选克隆的表达量如下表1抗体基因在CHO细胞中表达强度细胞株编号 3E95D74C65H86A63B44D84F65G76G2表达量(ug/毫升) 116.7 128.9 366.7 343.2 408.6 372.1 332.1 176.4 231.4 146.9从上表可以看出，编号为4C6、5H8、6A6和3B4的细胞株的表达水平具有很高的表达水平(340-410毫克/毫升)，已经远远超出了国内外单抗类的表达水平(50～100mg/毫升)。
实施例3单克隆抗体生理活性和亲和力研究1)生理功能研究由于至今只发现血管内皮细胞对VEGF有特异的增殖反应，本试验根据Gospodarowicz D等的方法(PNAS，1989，867311)检测抗VEGF单抗的生物学活性。具体方法如下取96孔细胞培养板一块，每孔中加入0.5毫升含有1×104牛肾上腺血管内皮细胞(可从中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库获得)培养液和200 IU的VEGF(购自深圳晶美公司)，在第4天单独加入同样量的VEGF以持续刺激牛肾上腺内皮细胞增殖。
待测样品和阳性对照储存液浓度均为500微克/毫升。阳性对照为Genentech公司的RhuFab V2。用含有0.2％明胶的PBS稀释液系列稀释待测样品和阳性对照后，每孔中加入0.5毫升待测样品和阳性对照。阴性对照孔加入0.5毫升细胞培养液。每个处理设3次重复。在37℃5％CO2培养箱中培养4～5天。
取经过上述处理的细胞0.2毫升，加入1/10体积浓度为5毫克/毫升的MTT溶液，37℃培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的光吸收。参考波长为630nm。
试验结果显示在下表2中。
表2 VEGF生物活性分析

从表2可以看出，本发明的人源抗人VEGF单克隆抗体具有很高的生物活性，比阳性对照RhuFab V2高出约8倍。
B)小鼠肝癌灌注治疗效果研究大鼠移植性肝癌模型的建立将皮下荷瘤大鼠断颈处死后，局部消毒，取皮下瘤块，拨去纤维组织，挑选无出血、无坏死肿瘤组织，用利刀片切成0.2mm3大小的小块备用。
另取Wistar大鼠，以戊巴比妥钠按40毫克/千克腹腔注射麻醉，取仰卧位，四肢固定于手术板上，手术区用75％酒精消毒后，在腹正中切开皮肤lO毫米左右，用显微组织镊子将肝包膜戳一小口，将肿瘤块沿隧道嵌入。移植完毕后逐层缝合腹壁，饲养待用，整个过程在无菌条件下进行。
治疗方法动脉插管参照Lindell等(转引自周梅芳，蒙坚1999，肝动脉插管化疗与lak/il-2联合治疗晚期肝癌的护理，护理经验，V18(6))的方法，肝脏接种瘤块后第7天，大鼠腹腔麻醉后固定，再次剖腹(开口约2～3厘米)，暴露肝脏，测量肿瘤表面最大径(a)和最小径(b)，分离胃十二指肠动脉、肝动脉及肝固有动脉，结扎胃十二指肠动脉的远端。以银夹暂时阻断肝总动脉，于手术显微镜下在胃十二指肠动脉上切一小口，由此将外径约0.3mm的特制导管上行插入肝固有动脉。待回血后，按以下分组及剂量(表3)分别灌注盐水和本发明的上述单抗制剂。灌注后拔管、结扎胃十二指肠动脉近端，放开肝总动脉上的银夹，逐层缝合切口后擦净伤口、外涂金霉素软膏，分笼恒温、自动供水供食饲养。
肿瘤生长率测定每组部分大鼠于治疗后第7天处死，再次测量肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，按公式计算肿瘤体积V＝ab2/2，再根据治疗前后的肿瘤体积计算肿瘤生长率(GR)GR＝(治疗后的肿瘤体积/治疗前的肿瘤体积)。
5组大鼠灌注前后的肿瘤体积及肿瘤生长率方差分析结果见表3。治疗前各组肿瘤体积之间均无显著性差异，肝动脉灌注生理盐水后(阴性对照)，所有大鼠的肿瘤均明显增大，平均肿瘤体积显著大于灌注前。灌注抗VEGF单克隆抗体后，肿瘤体积较治疗前亦明显增大，但肿瘤生长率低于对照组。这说明，灌注抗VEGF单克隆抗体可以明显抑制肝肿瘤的生长。
表3大鼠动脉灌注抗VEGF单抗后肝肿瘤体积及肿瘤增长率(x±s，n＝l0)

c)胃静脉灌注治疗大鼠胃癌的研究用上述类似方法对大鼠胃癌模型进行研究，结果显示在表4中。
表4大鼠动脉灌注抗VEGF单克隆抗体治疗前后肿瘤体积及平均肿瘤生长率(x±s，N＝12)

从表4可以看出，该灌注该单克隆抗体可以明显抑制胃癌的生长，效果比对肝癌还要好。
d)亲和力鉴定亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107220)进行。结果表明，4C6、5H8、6A6和3B4四种单克隆抗体的亲和力分别为6.8×10-9、3.21×10-8、7.1×10-9和6.64×10-6。其中4C6和6A6两株单克隆抗体的亲和力均已达到0.1nM的水平。与阳性对照相比(见表2)，6A6比阳性对照的明显高。这很可能是由于阳性对照的分子结构为Fab(抗原结合片段)，而本发明的6A6是具有完整分子结构的单克隆抗体。
实施例4.VEGF单克隆抗体基因的DNA测序根据系谱，对上述细胞株6A6的抗VEGF单克隆抗体基因进行DNA测序。结果显示在序列表中，其中SEQ ID NO2和SEQ ID NO4分别是本发明获得的高活性高表达VEGF单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列；SEQ ID NO1和SEQ ID NO3分别是根据上述DNA编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表<110>上海中信国健药业有限公司<120>人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物<130>020773<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>122<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val100 105 110Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser115 120<210>2<211>366<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2gaggtgcagc tgctggagtc cggcgccgag ctggtgaagc ccggcgcctc cgtgaagctg 60tcctgcaccg cctccggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gaagcagcgc 120cccgagcagg gcctggagtg gatcggccgc atcgaccccg ccaacggcaa caccaagtac 180gaccccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca cctcctccaa caccgcctac 240ctgcagctgt cctccctgac ctccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcccctcc 300atctactacg gctccaacca ctggtacttc gacgtgtggg gcgccggcac ctccgtgacc 360gtgtcc 366<210>3<211>11l<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Ala Ser Leu Ser Val Phe Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>4<211>333<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4gacatcgtgc tgacccagtt ccccgcctcc ctgtccgtgt tcctgggcca gcgcgccacc 60atctcctgcc gcgcctccca gtccgtgtcc acctacggct actcctacat gcactggaac 120cagcagaagc ccggccagcc cccccgcctg ctgatctacc tggtgtccaa cctggagttc180ggcgtgcccg cccgcttctc cggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaacatccac240cccgtggagg aggaggacgc cgccacctac tactgccagc acatccgcga gctgccctac300accttcggcg gcggcaccaa gctggagatc aag 33权利要求
1.一种抗人血管内皮生长因子单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQID NO1所示的氨基酸序列。
2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO4所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO2所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的表达载体转化。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是CHO细胞。
8.一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求1所述的人单克隆抗体以及药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤选自胃癌和肝癌。
10.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了一种抗人VEGF单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。该单克隆抗体的生物活性和宿主细胞中表达量有显著提高。本发明还提供了编码该抗体的DNA分子、该抗体的制备方法和含有该抗体的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK1445242SQ0211109
公开日2003年10月1日 申请日期2002年3月20日 优先权日2002年3月20日
发明者李博华, 钱卫珠, 刘庆法, 王皓 申请人:上海中信国健药业有限公司