专利名称：中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗及其制备方法。
背景技术：
由于我国“一优两高”农业的发展，鳖等名特优水产品养殖业迅速发展，但随着鳖人工养殖规模的扩大和集约化程度的提高，鳖病日趋增多。气单胞菌(Aeromonas)病是目前养殖鳖主要的病害之一，其在鳖的各个生长阶段均会发生，发病率在50％以上，使养鳖业蒙受了巨大的经济损失。由于鳖特殊的生理特点、生态习性以及鳖病防治研究的相对滞后，目前鳖病防治主要依赖抗菌药和化学消毒剂。这些药物长期大量滥用、乱用，不仅收效甚微，而且产生一系列严重后果抗药菌株增加，鳖病防治难度加大，环境污染，药物残留，鳖肉质下降，给人类健康构成极大的威胁。使用疫苗进行免疫预防是一种廉价的防治手段，不仅能有效地控制疾病的发生，克服鳖病给药和治疗的困难，而且还能保持环境的质量和鳖的品质。因此，研制新型、高效气单胞菌疫苗成为当今鳖病防治研究的热点。
目前中华鳖气单胞菌疫苗研究已有不少报道，免疫途径有注射和口服两种。注射接种免疫效果虽较好，但会损伤鳖体，且操作麻烦，在实际生产中实施十分困难，而口服免疫接种简单易行，对机体不产生应激作用，但迄今研制的疫苗，由于抗原在机体消化道内能被消化酶和胃酸破坏，免疫效果甚差，且疫苗消耗量大。故迄今为止，在生产上尚未有疫苗正式用于鳖病防治。鳖气单胞菌疫苗商品化有待解决的主要问题(1)寻求简便、经济、高效的疫苗接种途径；(2)气单胞菌病在鳖的各个生长阶段均可发生，设法延长免疫持续期对成功地预防该病尤为重要。采用生物降解性高分子材料包裹抗原制成新型的微球疫苗，可达到实现口服免疫(微球在胃中不分解，而在肠道中可释放出抗原，通过肠道吸收)、增强免疫效果、延长免疫保护期(微球疫苗可在相当一段时间内缓慢释放抗原，较长时间刺激免疫系统产生免疫应答，具有佐剂作用，能增强和延长免疫应答反应)以及减少接种剂量和次数等目的。然而，迄今未见有关鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗研究的文献报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗及其制备方法。
中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗是由中华鳖常见病原——温和气单胞菌的灭活全菌液，以海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮生物降解性高分子材料为载体，喷雾干燥法包裹制成的口服缓释微球疫苗。制备方法的步骤如下(1)菌种制备从患溶血性腹水病的中华鳖肝、心血、腹水物中分离出温和气单胞菌；(2)扩大培养在营养肉汤中添加5.0～10.0ppm硫酸铜、100～200ppm磷酸二氢钾、2.5～5.0ppm硫酸锰和2500～5000ppm硫酸铵，接种1～2％的种子液，在20～37℃振荡培养24～48h；(3)计数用平板计数法进行活菌计数，调整菌液含温和气单胞菌为6.0～7.5×109CFU/ml；(4)灭活温和气单胞菌全菌液(6.0～7.5×109CFU/ml)以28～37℃、0.2～0.4％福尔马林作用36～48h；(5)微球制备温和气单胞菌灭活全菌液，采用海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮生物降解性高分子材料为载体，以喷雾干燥法制成微球疫苗。
本发明的优点(1)使用简便、安全，耐受性好，对鳖体无损伤，便于大规模使用；(2)微球疫苗可在相当一段时间内缓慢释放抗原，较长时间刺激免疫系统产生免疫应答，具有佐剂作用，能增强和延长免疫应答反应，减少接种剂量和次数等；(3)口服疫苗的纯度和质量标准要求较注射疫苗低，生产成本低；(4)微球疫苗为干燥粉末，性质较稳定，贮运成本较低；(5)生产工艺简便，易于工厂化生产。
该成果在养鳖业生产发展中有重要实用价值和良好的社会经济效益。缓释微囊化技术的应用对其他水产动物口服疫苗的研制有重要借鉴意义。
图1是温和气单胞菌口服缓释微球疫苗的显微镜图；图2是受免和对照小鼠血清中凝集抗体效价变化图(—◆—灭活菌液注射组；—■—微球疫苗口服组；—▲—灭活菌液口服组)；图3是受免和对照中华鳖血清中凝集抗体效价变化图(—◆—灭活菌液注射组；—■—微球疫苗口服组；—▲—对照组)。
具体实施例方式
下面详述本发明的具体步骤和过程1 菌种的制备筛选从患溶血性腹水病的中华鳖肝、心血、腹水物中分离出温和气单胞菌，将其在营养琼脂培养基上连续传代至第35代，分别检测不同代次菌株的培养特性、菌体抗原性及毒力。温和气单胞菌在营养琼脂培养基上连续传代至35代，其生化特性没有发生变化。以不同代次菌株作为基础种子制备菌液的细菌数量、胞外产物的溶血价、毒力以及灭活后的菌体抗原性无显著差异。表明温和气单胞菌可作为良好的疫苗生产株。2 生产菌株培养条件以培养菌液含菌量和胞外产物溶血性为指标，考察培养温度、培养时间、振荡与否、培养基pH等因素对温和气单胞菌繁殖和产毒的影响，并采用正交试验方法，对培养基配方进行优化试验。确定了温和气单胞菌最佳的培养温度、培养时间以及最优的培养基配方。2.1 温度对细菌生长的影响，温度(4、20、28、37℃)对培养菌液含菌量和溶血性有明显的影响，其中28℃培养菌液的OD值和溶血价均最高。2.2 培养基pH对细菌生长的影响 培养基pH在6～9之间，菌液OD值和溶血价基本稳定；当pH小于6时，随着pH的下降，细菌繁殖及产毒能力下降，pH4.5时，细菌基本不生长。2.3 时间及振荡与否对细菌生长的影响 振荡条件下，培养24h，OD值已达到较高的水平，并维持至36h；胞外产物溶血价48h达到峰值(28)。静置状态下，OD值36h到达高峰，并维持至96小时；胞外产物溶血价60h达到最高值(27)。由此可见，振荡培养能明显促进细菌繁殖和产毒，缩短OD值和溶血价达峰时间；振荡培养与静置培养，两者菌液OD值和溶血价的达峰时间均不一致，OD值达峰时间比溶血价达峰时间均提前24h。2.4 培养基配方筛选试验结果2.4.1 对菌液OD值的影响 硫酸铜(P＜0.05)、磷酸氢二钾(P＜0.05)、硫酸铵(P＜0.10)和硫酸锰(P＜0.05)均能依次不同程度地促进细菌繁殖；氯化钙(P＜0.10)和硫酸钴(P＜0.10)可抑制细菌繁殖；其它成分影响不显著。2.4.2 对胞外产物溶血性的影响 硫酸铜((P＜0.05)、氯化钙(P＜0.05)和硫酸锰(P＜0.10)对胞外产物分泌依次有不同程度的有促进作用；氯化锌(P＜0.01)呈现极显著地抑制作用；其它成分影响不显著。2.4.3 培养基最优配方确定 通过对上述筛选得到的较佳培养基处方进行验证试验，结果表明培养基最优配方为基础营养肉汤加5.0～10.0ppm硫酸铜、100～200ppm磷酸二氢钾、2.5～5.0ppm硫酸锰和2500～5000ppm。
温度、pH、时间、微量元素及其它营养成分等均可调节细菌有关基因的表达，从而影响细菌繁殖与产毒的能力。不同气单胞菌及其菌株所需的培养条件可能有差异。温和气单胞菌最佳培养条件为在营养肉汤中添加5.0～10.0ppm硫酸铜、100～200ppm磷酸二氢钾、2.5～5.0ppm硫酸锰和2500～5000ppm硫酸铵，接种1～2％的种子液，在20～28～37℃振荡培养24～36～48h。3 计数用平板计数法进行活菌计数，调整菌液含温和气单胞菌为6.0～7.5×109CFU/ml。4 生产菌株灭活方法以灭活后细菌残存数、胞外产物溶血性及菌体抗原性为指标，考察不同的福尔马林浓度、不同的温度、不同的灭活时间对中华鳖温和气单胞菌灭活的影响，确定温和气单胞菌灭活的理想条件。4.1 菌体的灭活 在4℃，0.05％、0.1％、0.2％和0.4％福尔马林分别需144h、120h、96h以及72h才可使菌体完全失活；28℃时，灭活时间缩短至96h、72h，48h和36h；而37℃则分别为72h、48h，36h与36h。4.2 胞外产物(ECP)的灭活 在37℃，0.05％、0.1％、0.2％与0.4％福尔马林分别需13d、9d、6d以及3d使胞外产物完全失活；28℃时，0.1％、0.2％与0.4％福尔马林分别需13d、9d和6d，而0.05％福尔马林灭活15d，其胞外产物仍有溶血性(溶血价为21)；4℃时，15天内仅0.2％和0.4％福尔马林能使胞外产物灭活(灭活时间分别14d和9d)。4.3 灭活条件对菌体抗原性的影响灭 活的温度、福尔马林浓度及时间均可对菌体抗原性造成一定的损失；尤其在温度升高、福尔马林浓度增大或其作用时间延长的情况下，其抗原性均相应减弱。各种灭活方式中，以28℃、0.2％福尔马林作用2d的菌体抗原性为最佳。4.4 安全性试验 安全性试验显示腹腔注射灭活菌液5只中华鳖全部健活，无异常反应。温和气单胞菌较理想的灭活方法全菌液(6.0～7.5×109CFU/ml)以28～37℃、0.2～0.4％福尔马林作用36～48h5 中华鳖温和气单胞菌口服缓释微球疫苗的制备温和气单胞菌灭活菌液经不同方法(超声、冻融)处理后，采用生物降解性高分子材料为载体，制成微球疫苗，分别口服免疫ICR小鼠，通过测定血清中凝集抗体效价、血液中白细胞杀菌百分率以及对活菌攻击的免疫保护力比较评价三种疫苗的免疫效果。5.1 疫苗的制备 三种微球的粒径均小于10μm，平均粒径约3μm；显微镜观察结果表明微球表面光滑，为圆整球形，粒径分布窄，分散性好(图1)。经显微镜计数法测定，微球中菌体包封率约为70～80％。微球疫苗安全性试验显示灌胃5只小白鼠全部健活，无异常反应。5.2 凝集抗体效价 受免小鼠血清中凝集抗体效价测定结果见表1。从表1可见，小鼠口服免疫后第4周，三种微球疫苗均能产生一定的凝集抗体，其中以灭活菌液直接制备微球疫苗组的抗体效价最高，灭活菌液冻融处理微球疫苗组次之，灭活菌液超声处理微球疫苗组最低。对照组小鼠血清中检测不到凝集抗体。可见灭活菌液经超声或冻融处理均可一定程度降低疫苗的免疫原性。
表1受免小鼠血清中凝集抗体效价Tab.1 The agglutinating antibody titers in the serum of immunized mice(n＝6，X±SD)组别groupA B C凝集抗体效价(log2) 8.67±0.52 7.83±0.75 6.33±0.82agglutinating antibody titers注A组与B组间差异显著(P＜0.05)，C组与A、B组间差异极显著(P＜0.01)。5.3 白细胞的杀菌活性 受免和对照小鼠血液中白细胞的杀菌活性测定结果见表2。从表2可见，受免小鼠的白细胞杀菌百分率显著高于对照组(P＜0.01)，其中以灭活菌液直接制备微球疫苗组最高，灭活菌液冻融处理微球疫苗组次之，灭活菌液超声处理微球疫苗组最低。说明三种微球疫苗口服免疫后均可显著提高小鼠白细胞的杀菌活性。5.4 免疫保护试验 对照和受免小鼠经温和气单胞菌活菌攻击后的死亡情况见表3。由表3可见，三种微球疫苗口服免疫对温和气单胞菌活菌攻击均有一定的保护作用，其中以灭活菌液直接制备微球疫苗组的免疫保护力最高，达85.7％；其次灭活菌液冻融处理微球疫苗组，其免疫保护力为71.4％，灭活菌液超声处理微球疫苗组最低，仅为50.0％。从攻击致死的受免小鼠的肝、肾、心等处分离到与攻击所用完全相同的细菌。
表2 受免和对照小鼠血液白细胞的杀菌活性Tab.2 Bactericidal acticity of the blood leucocytes of immunized and controlmice(X±SD)组别 杀菌百分率(％)(X±SD)A 66.27，64.73，63.31，64.50，63.67，62.96 64.24±1.20cB 61.42，62.13，64.73，61.90，61.78，61.3 62.21±1.27bcC 60.24，61.30，63.67，59.41，60.59，62.72 61.32±1.60bD 35.74，36.10，32.90，35.98，34.32，32.9 34.66±1.50a注A、灭活菌液直接制备微球疫苗组；B、灭活菌液冻融处理微球疫苗组；C、灭活菌液超声处理微球疫苗组；D、对照组；a，b，c不同字母间表示差异极显著(P＜0.01)；a，b，c相同字母间表示差异不显著(P＞0.05)。
表3 对照和受免小鼠经As Z-1株活菌攻毒后的的免疫保护力Table 3 Relative percent survival of control and immunized mice against challengewith live Aeromonas sobria Z-1 strain组别 供试鼠数存活鼠数死亡率免疫保护group number of number of survival survival/％ 力RPS*/％challenged mice miceA 14 12 14.3 85.7B 14 10 28.6 71.4C 14 7 50.0 50.0对照组 14 0 0.0注A、灭活菌液直接制备微球疫苗组；B、灭活菌液冻融处理微球疫苗组；C、灭活菌液超声处理微球疫苗组；D、对照组； ×100%Relative percent survival=(1-mortality of immunized micemortality of controls)×100%]]>三种微球疫苗的免疫效果以灭活菌液直接包囊制备微球组最佳，其次为灭活菌液冻融处理微球疫苗组，灭活菌液超声处理微球疫苗组最差。可见中华鳖温和气单胞菌口服缓释微球疫苗以灭活菌液直接包囊制备为佳。6 检验检验包括无菌检验和安全性检验。无菌检验是将抽取样品接种于营养琼脂培养基上，在28℃培养48h，观察是否有菌落生成。安全性检验是用5倍于使用剂量的微球疫苗灌胃5只中华鳖和小白鼠，观察10d是否有异常反应。7 免疫效果分析7.1 小鼠对温和气单胞菌口服缓释微球疫苗的免疫应答研究以中华鳖温和气单胞菌灭活全菌液，采用生物降解性高分子材料为载体，制成微球疫苗，口服免疫ICR小鼠，测定血清中凝集抗体，血液中单核—巨噬细胞的吞噬活性以及对活菌攻击的免疫保护力，研究其免疫应答反应。7.1.1 凝集抗体效价测定结果 小鼠免疫后不同时间血清凝集抗体效价测定结果见图2(—◆—灭活菌液注射组；—■—微球疫苗口服组；—▲—灭活菌液口服组))。从图2可见，鼠免疫后第1～3周，灭活菌液注射组小鼠血清中凝集抗体效价高于微球疫苗口服组，有显著差异(P＜0.05)；免疫后第4～5周，二组受免小鼠血清中凝集抗体效价均趋于稳定，两者无显著差异(P＞0.05)；而免疫后第7～12周，微球疫苗口服组小鼠血清中凝集抗体效价显著高于灭活菌液注射组(P＜0.05)；灭活菌液口服组小鼠血清中凝集抗体效价一直维持较低水平，与灭活菌液注射组、微球疫苗口服组比较，差异极显著(P＜0.01)。对照组小鼠血清中检测不到凝集抗体。7.1.2 碳廓清试验结果 对照和受免小鼠血液中单核-巨噬细胞的吞噬指数测定结果见表4。小鼠免疫后第4周，灭活菌液注射组和微球疫苗口服组小鼠血液中单核-巨噬细胞的吞噬指数高于灭活菌液口服组和对照组，差异极显著(P＜0.01)；灭活菌液注射免与微球疫苗口服组、灭活菌液口服组与对照组比较，差异无显著意义(P＞0.05)。可见，微球疫苗口服后可以显著提高单核-巨噬细胞的吞噬活性。7.1.3 免疫保护试验 对照和受免小鼠经温和气单胞菌活菌攻击的死亡情况见表5。由表5可见，灭活菌液注射组和微球疫苗口服组小鼠对温和气单胞菌活菌攻击的免疫保护力均为87.5％，而灭活菌液口服组对腹腔注射攻击不能提供有效的保护，与对照组一样全部死亡，但死亡时间比对照组晚。从攻击致死的受免小鼠的肝、肾、心等处分离到与攻击所用完全相同的细菌。
表4 受免和对照小鼠单核-巨噬细胞的吞噬指数Table 4 Phagocytic index of monocytes and macrophages in immunized and controlMice组别吞噬指数 X±SDA 4.0437，4.4576，4.4634，4.0386，3.8598，4.5665 4.2383±0.2924bB 4.2195，4.2971，4.7380，3.9859，4.2394，3.6565 4.1894±0.3582bC 3.2270，2.5420，3.0381，3.0383，3.9716，3.4010 3.2030±0.4737aD 2.9832，3.1796，3.0893，2.9542，2.5175，2.8975 2.9369±0.2289a注A、灭活菌液注射组；B、微球疫苗口服组；C、灭活菌液口服组；D、对照组。a，b不同字母间表示差异极显著(P＜0.01)；a，b相同字母间表示差异不显著(P＞0.05)。
表5 对照和受免小鼠经As Z-1株活菌攻毒后的的免疫保护力Table 5 Relative percent survival of control and immunized mice against challengewith live Aeromonas sobria Z-1 strain组别 供试鼠数 存活鼠数 免疫保护力group number of challenged mice number of survival mice RPS*/％A87 87.5B87 87.5C80 0.0D80注A、灭活菌液注射组；B、微球疫苗口服组；C、灭活菌液口服组；D、对照组； mortality of immunized micemortality of controls)×100%]]>微球疫苗小鼠口服免疫后第4周，不仅血清中凝集抗体效价、血液中单核—巨噬细胞的吞噬指数以及对活菌攻击的免疫保护力均可达到灭活菌液注射免疫相当的水平(P＞0.05)，明显高于灭活菌液口服组(P＜0.01)，而且能在较长时期内维持较高的凝集抗体效价。微球疫苗口服可达到注射常规疫苗的免疫效果。7.2 中华鳖对温和气单胞菌口服微球缓释疫苗的免疫应答研究以中华鳖温和气单胞菌灭活全菌液，采用生物降解性高分子材料为载体，制成微球疫苗，口服免疫中华鳖，通过测定血清中凝集抗体，血液中白细胞杀菌百分率以及对活菌攻击的免疫保护力研究中华鳖对温和气单胞菌口服缓释微球疫苗的免疫应答反应。7.2.1 凝集抗体效价测定结果 受免和对照鳖血清中的凝集抗体效价测定结果见图3(—◆—灭活菌液注射组；—■—微球疫苗口服组；—▲—对照组)。从图3可见，中华鳖微球疫苗口服免疫后，血清中凝集抗体效价与灭活菌液注射组相当，无显著差异(P＞0.05)，极显著高于对照组(P＜0.01)。7.2.2 白细胞的杀菌活性 受免和对照中华鳖血液中白细胞的杀菌活性测定结果见表6。从表6可知，中华鳖微球疫苗口服免疫后，血液中白细胞的杀菌百分率极显著高于对照组(P＜0.01)，可见，微球疫苗口服后可以显著提高血液中白细胞的杀菌活性。微球疫苗口服组和灭活菌液注射组比较，二者差异无显著意义(P＞0.05)。
表6 受免和对照中华鳖血液中白细胞的杀菌活性Tab.6 Bactericidal acticity of the blood leucocytes in immunized and control soft-shelled turtle(Trionyx sinensis)(X±SD)组别 受免后周数和杀菌百分率weeks and Bactericidal percentgroup 12 3 4A 39.19±1.30b48.65±1.32b56.81±1.85b62.66±2.09bB 37.12±1.46b45.78±1.96b53.73±1.82b60.94±1.72bC 29.91±3.26a31.36±2.00a31.38±1.25a30.60±2.35a注A、灭活菌液注射组；B、微球疫苗口服组；C、对照组；a，b不同字母间表示差异极显著(P＜0.01)；b相同字母间表示差异不显著(P＞0.05)。7.2.3 免疫保护试验 对照和受免中华鳖经温和气单胞菌活菌攻击的死亡情况见表7。由表7可见，微球疫苗口服组和灭活菌液注射组中华鳖对温和气单胞菌活菌攻击的免疫保护力率分别为94.7％和89.5％，两者差异不显著(P＞0.05)，而对照组小鼠100％死亡。从攻击致死的受免中华鳖的肝、肾、心等处分离到与攻击所用完全相同的细菌。
表7 对照和受免中华鳖经As Z-1株活菌攻毒后的的免疫保护力Tab.7 Relative percent survival of control and immunized soft-shelledturtle(Trionyx sinensis)against challenge with live Aeromonas sobria Z-1 strain组别 供试鳖数 存活鳖数免疫保护力groupnumber of challenged turtle number of survival turtleRPS/％A20 19 94.7B20 18 89.5C20 1注A、灭活菌液注射组；B、微球疫苗口服组；C、对照组；a，b不同字母间表示差异极显著(P＜0.01)；b相同字母间表示差异不显著(P＞0.05)；免疫保护力＝ mortality of immunized micemortality of controls)×100%]]>微球疫苗中华鳖口服免疫后，血清中凝集抗体效价、血液中白细胞杀菌百分率以及对活菌攻击的免疫保护力均可达到灭活菌液注射组相当的水平(P＞0.05)，极显著高于对照组(P＜0.01)；说明微球疫苗口服可达到注射常规疫苗的免疫效果。7.3 中华鳖温和气单胞菌口服微球缓释疫苗的预防试验中华鳖温和气单胞菌口服缓释微球疫苗预防试验结果见表8。中华鳖温和气单胞菌口服缓释微球疫苗免疫鳖和未免疫鳖死亡率分别为4.285％和15.49％，二者差异极显著(P＜0.01)。免疫鳖比未免疫鳖平均死亡率下降72.37％。
表8对照和受免鳖的存活率和死亡率Tab.8 Mortality of control and immunized soft-shelled turtle(Trionyx sinensis)组别 供试鳖数 存活鳖数死亡率 平均死亡率group number of turtle number of survivalmortality/％ averageturtlemortality/％试 1428 1359 4.83验 430413 3.954.28组 734709 3.41对 836691 17.34照 240207 13.75 15.49组 758652 13.98
权利要求
1.一种中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗，其特征在于它是由中华鳖常见病原——温和气单胞菌的灭活全菌液，以海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮生物降解性高分子材料为载体，喷雾干燥法包裹制成的口服缓释微球疫苗。
2.一种中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗的制备方法，其特征在于它的步骤如下(1)菌种制备从患溶血性腹水病的中华鳖肝、心血、腹水物中分离出温和气单胞菌；(2)扩大培养在营养肉汤中添加5.0～10.0ppm硫酸铜、100～200ppm磷酸二氢钾、2.5～5.0ppm硫酸锰和2500～5000ppm硫酸铵，接种1～2％的种子液，在20～37℃振荡培养24～48h；(3)计数用平板计数法进行活菌计数，调整菌液含温和气单胞菌为6.0～7.5×109CFU/ml；(4)灭活温和气单胞菌全菌液(6.0～7.5×109CFU/ml)以28～37℃、0.2～0.4％福尔马林作用36～48h；(5)微球制备温和气单胞菌灭活全菌液，采用海藻酸钠和聚乙烯吡咯烷酮生物降解性高分子材料为载体，以喷雾干燥法制成微球疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种中华鳖气单胞菌口服缓释微球疫苗及其制备方法。它是由中华鳖常见病原——温和气单胞菌的灭活全菌液,以生物降解性高分子材料为载体,喷雾干燥法包裹制成的微球疫苗。其制备方法包括菌种制备、扩大培养、计数、灭活、微球制备、检验、免疫效果分析等七个步骤。本发明的疫苗免疫保护力高,效果确切,使用方便、安全,对鳖体无损伤,便于大规模应用,制备工艺简单,易于工厂化生产,生产和贮运成本低,性质稳定,可有效地防止中华鳖及其它水产动物由气单胞菌引起的病害。
文档编号A61K9/52GK1371748SQ0211109
公开日2002年10月2日 申请日期2002年3月18日 优先权日2002年3月18日
发明者孙红祥 申请人:浙江大学