一种多肽——人rna解螺旋酶44和编码这种多肽的多核苷酸的制作方法

专利名称：一种多肽——人rna解螺旋酶44和编码这种多肽的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种多肽——人RNA解螺旋酶44，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。
RNA解螺旋酶根据其结构上的特征分为不同的亚家族，亚家族I和亚家族II。所有的解螺旋酶均含有两个Walker型NTP结合结构域---A结构域(或叫ATP酶A结构域)和B结构域(或称ATP酶B结构域)。亚家族I中的成员含有保守的ATP酶A结构域GXXXXGKT。后发现，有一些RNA解螺旋酶的ATP酶结构域A在一些氨基酸位点上有突变，其ATP酶A结构域的保守序列为AXXGXGKT，因而将这些蛋白分为一类，即亚家族II。在亚家族II中，有部分蛋白在ATP酶结构域B中含有保守的DEAD盒，后发现该亚家族中的成员按其DEAD盒的不同又可分为三种不同的亚类，即DEAD盒蛋白、DEAH盒蛋白及DEXH盒蛋白[Angelika Luking，UlfStahl et al.，1998，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，33259-296]。
研究发现，RNA解螺旋酶的不同的结构域在生物体内有着保守的功能。ATP酶结构域A为RNA解螺旋酶N末端的高度保守的结构域序列，其是RNA解螺旋酶与ATP结合的保守位点，是ATP结合所必需的；而ATP酶B结构域中保守的DEAD盒序列调节着ATP的水解与否。A结构域与B结构域在解螺旋酶中总是协同作用，ATP水解所释放的能量是RNA解螺旋酶发挥生物学功能所必需的。SAT区域是RNA解螺旋酶的又一重要保守区域，该区域氨基酸的突变将一致RNA解螺旋酶的活性。该酶C末端的HRIGRXXR保守序列对于RNA的结合与ATP的水解也是必需的[Angelika Luking，Ulf Stahl et al.，1998，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，33259-296]。
本发明的新人RNA解螺旋酶44与已知的人解螺旋酶在蛋白水平上有41％的同一性和59％的相似性，并与其它的RNA解螺旋酶相似，含有N末端及C末端的高度保守的序列及各保守的基序。因而认为其与人RNA解螺旋酶相似，有相似的生物学特征。
本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供含有编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸的重组载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供生产人RNA解螺旋酶44的方法。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——人RNA解螺旋酶44的抗体。
本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽——人RNA解螺旋酶44的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。
本发明的另一个目的是提供诊断治疗与人RNA解螺旋酶44异常相关的疾病的方法。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的人RNA解螺旋酶44，该多肽是人源的，它包含具有<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、类似物。较佳地，该多肽是具有<210>2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述人RNA解螺旋酶44的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有<210>2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有<210>1中173-1384位的序列；和(b)具有<210>1中1-2348位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的人RNA解螺旋酶44”是指人RNA解螺旋酶44基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人RNA解螺旋酶44。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。人RNA解螺旋酶44多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明提供了一种多肽——人RNA解螺旋酶44，其基本上是由<210>2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人RNA解螺旋酶44的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的人RNA解螺旋酶44相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括<210>1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为2348个碱基，其开放读框(173-1384)编码了403个氨基酸。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与人RNA解螺旋酶有59％的同源性，可推断出该人RNA解螺旋酶44具有人RNA解螺旋酶相似的结构和功能。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与<210>1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有<210>2的蛋白质或多肽，但与<210>1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与<210>2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码人RNA解螺旋酶44的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定人RNA解螺旋酶44的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测人RNA解螺旋酶44基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法(Sangerer et al.PNAS，1977，745463-5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用人RNA解螺旋酶44编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码人RNA解螺旋酶44的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的人RNA解螺旋酶44(Science，1984；2241431)。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人人RNA解螺旋酶44的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的多肽以及该多肽的拮抗利、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗癌症、神经系统及免疫系统疾病等。
RNA解螺旋酶在癌症组织、脑及神经组织和与炎症及免疫反应相关的组织中均有表达。因而，RNA解螺旋酶在癌症、神经系统疾病及免疫系统疾病中起重要作用。特别的，RNA解螺旋酶在癌症及免疫系统疾病中表达量明显增加；而在神经系统相关的疾病中，其表达量减少或活性减弱。
具体就本发明的新的人RNA解螺旋酶44而言，该酶及其片段或衍生物可用于诊断及治疗神经系统相关的疾病，这些疾病包括但不限于以下所述，静坐恐慌症、早老性痴呆、记忆顺行性遗忘、肌萎缩性脊髓侧索硬化、两极神经细胞紊乱症、紧张症、脑瘤、痴呆症、抑郁、延迟性运动障碍、张力障碍、癫痫、遗传性慢性舞蹈症、多发性脊髓侧索硬化、神经纤维瘤、帕金森氏病、偏执狂神经病、神经分裂症、图雷特氏病等。
本发明的新人RNA解螺旋酶44及其片段或衍生物还可用与诊断及治疗一些癌症，这些癌症包括但不限于以下所述，腺瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肉瘤等；特别的，包括以下这些组织的癌症，甲状腺、膀胱、骨、骨髓、脑、乳房、子宫颈、腱鞘囊肿、心脏、肾脏、肺、肝、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、前列腺、子宫、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、阴茎、胸腺、胆囊、胃肠道等。
本发明的新人RNA解螺旋酶44及其片段或衍生物还可用于诊断及治疗与免疫系统相关的疾病，这些疾病包括但不限于以下所述，类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、原发性干燥综合症、强直性脊柱炎、血色素沉着症、免疫复合物型肾小球肾炎、淋球菌感染后心肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、多发性肌炎、口眼干燥综合症、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、重症肌无力、格林-巴利综合症、自身免疫性溶血性贫血、免疫性血小板减少性紫癜、胰岛素自身免疫性综合症、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性心脏病、Down综合症、短肢性侏儒症、遗传性转钴胺H缺乏伴低丙种球蛋白血症、生物素依赖性羧化酶缺乏症、Dun Can综合症、胸腺瘤、慢性病皮肤粘膜念球菌病、再生障碍性贫血、Di George综合症、Wiscott-Aldrich综合症、伴共济失调毛细血管扩张的免疫缺陷病等。
本发明的新人RNA解螺旋酶44及其片段或衍生物还可用于诊断及治疗与免疫系统相关的疾病，这些疾病包括但不限于以下所述，肺嗜酸粒细胞增多症、结节病、风湿样关节炎、类风湿样关节炎、骨关节炎、胆囊炎、肾小球性肾炎、免疫复合物型肾小球肾炎、急性前葡萄膜炎、骨质疏松症、皮肤肌炎、荨麻疹、特异性皮炎、血色素沉着症、多肌炎、阿狄森氏病、格雷夫斯氏病、慢性活动性肝炎、肠应急性综合症、萎缩性胃炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力、脑脊髓多发性硬化、格林-巴利综合症、颅内肉芽肿、Wegener肉芽肿病、自体免疫甲状腺炎、自身免疫性间质性肾炎、溃疡性结肠炎、贫血、胰腺炎、节段性回肠炎、心肌炎、动脉粥样硬化、多发性硬皮病等。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人RNA解螺旋酶44的药剂的方法。激动剂提高人RNA解螺旋酶44刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人RNA解螺旋酶44的膜制剂与标记的人RNA解螺旋酶44一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
人RNA解螺旋酶44的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人RNA解螺旋酶44的拮抗剂可以与人RNA解螺旋酶44结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将人RNA解螺旋酶44加入生物分析测定中，通过测定化合物对人RNA解螺旋酶44和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与人RNA解螺旋酶44结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对人RNA解螺旋酶44分子进行标记。
本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对人RNA解螺旋酶44抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用人RNA解螺旋酶44直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备人RNA解螺旋酶44的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohler andMilstein. Nature，1975，256495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗人RNA解螺旋酶44的单链抗体。
抗人RNA解螺旋酶44的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人RNA解螺旋酶44。
与人RNA解螺旋酶44结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人RNA解螺旋酶44高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人RNA解螺旋酶44阳性的细胞。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人RNA解螺旋酶44相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人RNA解螺旋酶44的产生或活性。
本发明还涉及定量和定位检测人RNA解螺旋酶44水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人RNA解螺旋酶44水平，可以用作解释人RNA解螺旋酶44在各种疾病中的重要性和用于诊断人RNA解螺旋酶44起作用的疾病。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于人RNA解螺旋酶44的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的人RNA解螺旋酶44，以抑制内源性的人RNA解螺旋酶44活性。例如，一种变异的人RNA解螺旋酶44可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的人RNA解螺旋酶44，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗人RNA解螺旋酶44表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸转移至细胞内。构建携带编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸可包装到脂质体中转移至细胞内。
多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
抑制人RNA解螺旋酶44mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸可用于与人RNA解螺旋酶44的相关疾病的诊断。编码人RNA解螺旋酶44的多核苷酸可用于检测人RNA解螺旋酶44的表达与否或在疾病状态下人RNA解螺旋酶44的异常表达。如编码人RNA解螺旋酶44的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断人RNA解螺旋酶44的表达状况。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人RNA解螺旋酶44特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人RNA解螺旋酶44的转录产物。
检测人RNA解螺旋酶44基因的突变也可用于诊断人RNA解螺旋酶44相关的疾病。人RNA解螺旋酶44突变的形式包括与正常野生型人RNA解螺旋酶44 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomesa Manualof Basic Techniqucs，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。人RNA解螺旋酶44以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人RNA解螺旋酶44的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。


图1是本发明人RNA解螺旋酶44和人RNA解螺旋酶的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是人RNA解螺旋酶44，下方序列是人RNA解螺旋酶。相同氨基酸在两个序列间用单字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
图2为分离的人RNA解螺旋酶44的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。44kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。
实施例2cDNA克隆的同源检索将本发明的人RNA解螺旋酶44的序列及其编码的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。与本发明的人RNA解螺旋酶44同源性最高的基因是一种已知的人解螺旋酶，其编码的蛋白在Genbank的准入号为AJ223948。蛋白质同源结果示于图1，两者高度同源，其相同性为41％；相似性为59％。实施例3用RT-PCR方法克隆编码人RNA解螺旋酶44的基因用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增Primer15’-GGAAAATTTGTTTTTTGAAAAA-3’ (<210>16)Primer25’-ATTGAAGAATATTTAATGATAT-3’(<210>17)
Primer1为位于<210>1的5’端的第1bp开始的正向序列；Primer2为<210>1的中的3’端反向序列。
扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA转合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94℃30sec；55℃30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与<210>1所示的1-2348bp完全相同。实施例4Northern印迹法分析人RNA解螺旋酶44基因的表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为图1所示的PCR扩增的人RNA解螺旋酶44编码区序列(173bp至1384bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。实施例5重组人RNA解螺旋酶44的体外表达、分离和纯化根据<210>1和图1所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下Primer35’-CCCCATATGATGTTAACATCAAATTTAAAGATA-3’(<210>18)Primer45’-CCCGGATCCTCAGTTAAAATTGTAACTCACATG-3’(<210>19)此两段引物的5’端分别含有NdeI和BamHI酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NdeI和BamHI酶切位点相应于表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-0167c02质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为总体积50μl中含pBS-0167c02质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数94℃20s，60℃30s，68℃2min，共25个循环。用NdeI和BamHI分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-0167c02)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-0167c02)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白人RNA解螺旋酶44。经SDS-PAGE电泳，在44kDa处得到一单一的条带(图2)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与<210>2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。实施例6抗人RNA解螺旋酶44抗体的产生用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述人RNA解螺旋酶44特异性的多肽NH2-Met-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Lys-Ile-Thr-Asn-Glu-Asp-Thr-Asn-Tyr-COOH。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与人RNA解螺旋酶44结合。
序列表<110> 上海博德基因开发有限公司<120> 一种多肽--人RNA解螺旋酶44和编码这种多肽的多核苷酸<130> 0167c02<160> 19<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2061<212> DNA<213> Homo sapiens<220><221> CDS<222> (173)..(1384)<223><400> 1cctctgagaa atccaagttt attatagatg atcacacaga ctaccaaaca ccccagggag60aaaatgcaaa aataatggaa atggcaagag attttcttcc atcactgaag aatctttttg120gaaacccagt atacttccta tatttatgta caagcactgt tcagttcaat tc tct gtt178Ser Val1cgg cat ggt gac gta caa acc aaa gta cat tga gca gca gta tgg aca 226Arg His Gly Asp Val Gln Thr Lys Val His Ala Ala Val Trp Thr5 10 15gtc atc ctc cag ggc caa ctt tgt gat cgg gct cat caa cat tcc agc 274Val Ile Leu Gln Gly Gln Leu Cys Asp Arg Ala His Gln His Ser Ser20 25 30agt ggc cct tgg gat att ctc tgg ggg gat agt tat gaa aaa att cag322Ser Gly Pro Trp Asp Ile Leu Trp Gly Asp Ser Tyr Glu Lys Ile Gln35 40 45aat cag tgt gtg tgg agc tgc gaa act cta ctt ggg atc atc tgt ctt370Asn Gln Cys Val Trp Ser Cys Glu Thr Leu Leu Gly Ile Ile Cys Leu50 55 60 65tgg tta cct cct att tct ttc cct gtt tgc act ggg 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1.一种分离的多肽-人RNA解螺旋酶44，其特征在于它包含有<210>2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与<210>2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有<210>2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种(a)编码具有<210>2所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或(c)与(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含编码具有<210>2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有<210>1中173-1384位的序列或<210>1中1-2348位的序列。
7.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成的重组载体。
8.一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞(a)用权利要求7所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；或(b)用权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
9.一种具有人RNA解螺旋酶44活性的多肽的制备方法，其特征在于所述方法包括(a)在表达人RNA解螺旋酶44条件下，培养权利要求8所述的工程化宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人RNA解螺旋酶44活性的多肽。
10.一种能与多肽结合的抗体，其特征在于所述抗体是能与人RNA解螺旋酶44特异性结合的抗体。
11.一类模拟或调节多肽活性或表达的化合物，其特征在于它们是模拟、促进、拮抗或抑制人RNA解螺旋酶44的活性的化合物。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于它是<210>1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列。
13.一种权利要求11所述化合物的应用，其特征在于所述化合物用于调节人RNA解螺旋酶44在体内、体外活性的方法。
14.一种检测与权利要求1-3中的任一权利要求所述多肽相关的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于其包括检测所述多肽的表达量，或者检测所述多肽的活性，或者检测多核苷酸中引起所述多肽表达量或活性异常的核苷酸变异。
15.如权利要求1-3中的任一权利要求所述多肽的应用，其特征在于它应用于筛选人RNA解螺旋酶44的模拟物、激动剂，拮抗剂或抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定。
16.如权利要求4-6中的任一权利要求所述的核酸分子的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
17.如权利要求1-6及11中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模拟物、激动剂、拮抗剂或抑制剂以安全有效剂量与药学上可接受的载体组成作为诊断或治疗与人RNA解螺旋酶44异常相关的疾病的药物组合物。
18.权利要求1-6及11中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制备用于治疗癌症、神经系统疾病及免疫系统疾病的药物。
全文摘要
本发明公开了一种多肽—人RNA解螺旋酶44，编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法，如癌症、神经系统疾病及免疫系统疾病等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种新的人RNA解螺旋酶44的多核苷酸的用途。
文档编号A61K38/43GK1477198SQ0213663
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月23日 优先权日2002年8月23日
发明者毛裕民, 谢毅 申请人:上海博德基因开发有限公司