专利名称：含sa脂质体作为药物载体的药物新剂型的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和药物学领域，更具体地涉及将SA脂质体作为药物载体的用途，以及含有SA脂质体作为药物载体的药物组合物。
背景技术：
药物传递系统能极大地改善药物使用的安全性和效率，并使新的治疗成为可能。理想的药物传递系统应具有的优点包括(1).在治疗允许的范围内维持药物水平。(2).减少靶向传递时对非靶向细胞或组织的伤害。(3).降低用药的有效剂量，减少药物副反应。(4).促进体内半衰期较短的药剂(如蛋白质、多肽)等的应用。
药物传递系统按其功能特点大致可分为三种类型聚合体-药物传递系统、脂质体药物传递系统和智能传递系统。近年来，药物传递系统有不小发展但尚有不少亟待改进之处(1).释放药物的传递系统材料及其分解产物可能存在的毒性和副作用。(2).由系统本身或导入方法所引起的不便与不适。(3).新的传递系统价格昂贵。
随着生物技术的发展，多肽和蛋白质药物的数量将会迅速增长。近年来各类多肽药物在全球的销售额增加了20％。多肽和蛋白质药物一般是注射给药的，对这类药物来说，其药物传递系统的应用具有巨大的潜力。
长久以来人们一直梦想能够有把药物专一地导向作用位点，并能精确地控制药物释放，使药效最大的传递系统。近年来，这个梦想已开始变成事实并对医学的各个分支包括心脏学、眼科学、内分泌学、肿瘤学、肺科学、免疫学等产生了巨大影响。药物传递系统在美国的年销售额超过了10亿美元，尚在飞速增长。药物传递原理，也已被应用到农药、肥料、除草剂、香料、调味剂等多个领域。药物传递系统已成为药物竞争的主要方面。
许多药物，特别是抗癌药物，在作用于靶细胞的同时，对正常细胞具有相当的毒性，对机体会产生较强的副作用，因而其使用和剂量常被限制在一定的范围内，减少药物剂量、提高药效与降低毒副作用显得十分重要。多数多肽药物在体内的半衰期短，在治疗时就需反复给药，而这会使体内药物浓度起伏，从而造成自我调节系统的紊乱。
药物与脂质体结合后会明显增强药物疗效，降低毒性，减少副反应。脂质体作为药物载体，最初是用于对遗传缺陷性疾病的治疗研究，之后又扩大到对癌症的治疗，抗细菌、真菌感染，免疫性疾病的治疗，金属螯合疗法等方面。目前已有一些以脂质体为载体的药物进入临床。
脂质体作为药物载体，具有以下优点1)由于主要由天然磷脂和胆固醇组成的脂质体，进入体内后可被生物降解，不会积累在体内，而且免疫原性小，易于被机体所接受。2)水溶性和脂溶性药物都可包埋在脂质体内从脂质体中缓慢释放，使药效持续较长时间。3)通过与细胞内吞和融合相互作用，脂质体可直接将药物送入细胞内而发挥作用，从而避免使用高浓度游离药物作用机体。4)脂质体在体内的分布可以控制，从而使它在病变组织处释放药物，减少对正常组织的毒性，减少副反应，增强药效。
脂质体应用于药物小分子的体内输送的报道，它主要是起稳定药物分子结构、药物抗降解从而延长药物分子体内的半衰期和有一定的缓释作用，此外它的脂质成分通过与受药组织和器官的细胞表面产生融合，又利于药物的释放和吸收。
目前脂质体的药物制剂有针剂、口服和外用药剂等各种形式。与其它载体系统相比较，脂质体与所载药物之间不需共价交联，药物不经化学修饰。脂质体可以通过膜融合将所载药物送入细胞，使吞噬能力较差的细胞如癌细胞也易于摄取药物，这是脂质体脂双层所特有的功能。各种结构的脂质体可用于不同的条件。
脂质体与其它载体系统一样，进入体内后，将很快被网状内皮系统的细胞所吞噬，从外周血液循环中被清除，而集中于肝、脾组织，这虽然对治疗肝、脾组织的某些疾病有利却不利于其它治疗目的。
目前，Doxoribicin，MTP-PE，Cisplatin和Amphotericin B等药物的脂质体制剂在临床I期和II期的治疗中取得较好疗效，展示了脂质体作为药物载体用于治疗的光辉前景。
脂质体药物载体用于常规治疗，还需解决一些技术问题。一是脂质体制剂如何长期保存。二是现在的制备方法常涉及蒸馏、温度控制，甚至透析等过程，不利于工业化生产或医院日常快速制备。三是制备的重复性必须好。四是如何准确计算药物的包埋率。随着这些问题的解决，药物脂质体制剂将成为有效的常规用药。
阳离子脂质体也曾作为药物载体。目前，阳离子脂质体一般用于携带负电荷的核酸物质转送，鲜有被用作多肽药物的载体。阳离子脂质体与通常的脂质体作用原理不同，阳离子脂质体表面带有正电荷。药物和阳离子脂质体相互作用时，不仅部分可包埋于脂质体的囊泡内，也可由于阳离子脂质体表面的正电荷与带负电荷的药物分子产生静电相互作用，而且多肽类药物分子中的疏水部分可插入脂双层、而得到稳定。阳离子脂质体与带负电的细胞表面有很强的亲合作用，有利于药物进入细胞。
因为阳离子脂质体操作简单，因此受到越来越多的重视。但现有的商品阳离子脂质体均含人工合成的阳离子成份，并且价格昂贵，而且对细胞的毒性较大，不利于体内的药物输送。
理想的药物转运载体，不仅需要在离体培养的细胞中有很高的导入效率，更要有合适的体内的转运能力，要有抗降解能力，能自然代谢，并且对机体不产生毒副作用。尽管有的由合成脂构成的阳离子脂质体已被应用于体外细胞转染上并且开始在体内基因治疗上获得初步成功，但它们尚存在以下缺陷(1).血清对大多数阳离子脂质体有明显的抑制作用，体内药物转送的效率低。(2).人工合成的阳离子脂质易被体内免疫系统识别，产生较强的排异作用。(3)不同的阳离子脂质体转染对细胞有选择性，适用范围以及转染细胞的效率是不同的。
本发明迫切需要开发新的药物载体，所述的药物载体可有效地携带多肽、蛋白或核酸等药物活性成分，不受血清抑制，免疫原性低，适用范围广。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种有效的、不受血清抑制，免疫原性低，适用范围广的药物载体，即SA脂质体。
本发明的另一目的是提供含有SA脂质体作为药物载体的药物组合物。
本发明的另一目的是提供SA脂质体在基因治疗等方面的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，它含有药物活性成分和作为药物载体的SA脂质体。
在一优选例中，所述的药物活性成分选自多肽、蛋白质、核酸。
在另一优选例中，所述的药物活性成分是多肽或蛋白，且多肽或蛋白与SA脂质体的重量比为1∶10～1∶300。
在另一优选例中，所述的药物活性成分是核酸，且其与SA脂质体的重量比为1∶10～1∶300。
在另一优选例中，所述的SA脂质体是CH3-(CH2)16-CH2-+NH3∶C41H78NO8P(DOPE)＝0.8∶1～1∶0.8，更佳地为1∶1(w/w)。
在另一优选例中，所述的活性成分选自降钙素、人降钙素类似物I、人降钙素类似物II、成骨生长肽。
在本发明的第二方面，提供了所述SA脂质体的用途，它作为药物载体用于制备药物。
在一优选例中，所述药物中的活性成分选自多肽、蛋白质、核酸。
在本发明的第三方面，提供了一种转染方法，将核酸与SA脂质体脂质体以重量比1∶10.-1∶20混合，然后转染。
较佳地，所述的核酸选自DNA、RNA、寡核苷酸、反义核酸、或其混合物。
图1鲑鱼降钙素(sCT)和SA脂质体-sCT复合物的时间-剂量曲线的比较。
图2人降钙素类似物I和SA脂质体复合物的降血钙作用的时间曲线。
图3人降钙素类似物II和SA脂质体的复合物的降血钙作用与游离人降钙素类似物II的比较。
图4游离成骨生长肽与其和SA脂质体复合物对细胞增殖效率的活度曲线(以游离成骨生长肽的量计算)。
图5不同剂量游离的SA脂质体对NIH3T3细胞生长的影响。
图6在不全血清浓度下SA脂质体与Lipofectin转染NB-1细胞的能力。
图7在不全血清浓度下SA脂质体与Lipofectin转染P19细胞的能力。
图8在不全血清浓度下SA脂质体与Lipofectin转染PC12细胞的能力。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现SA脂质体特别适合作为多肽、蛋白质和核酸等药物活性成分的药物载体。SA脂质体不仅免疫原性小，在体内有较强的稳定性。对于多肽药物，SA脂质体能延长其半衰期且具有一定的药物缓释作用。对于核酸药物，SA脂质体可在血清存在下高效转染各类哺乳动物真核细胞和昆虫细胞。因此，SA脂质体是一种安全、高效的药物载体。在此基础上，完成了本发明SA脂质体如本文所用，术语“SA脂质体”、“SA阳离子脂质体”、“硬脂胺阳离子脂质体”、或“硬脂胺脂质体”可互换使用，都指由硬脂胺(Stearylamine，SA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl-phosphatidylethanolamine，DOPE)构成的混合物/复合物。SA与DOPE之比一般为约0.8∶1～1∶0.8，较佳地约为1∶1(w/w)。SA脂质体表面带有正电荷，通过静电作用与带负电荷的DNA、RNA、寡核苷酸及蛋白质、多肽的带负电部分等形成复合物，阳离子脂质体可有效保护所传送的分子不被降解。复合物会通过静电作用被吸附在细胞表面，通过细胞的融合及内吞作用将所复合的分子导入细胞内。
SA脂质体的主要阳离子亲水脂分子成份硬脂胺(SA)为一条18个碳原子的饱和脂肪酸的疏水锚着链和一个氨基的亲水极性头，化学式为CH3-(CH2)16-CH2-+NH3在SA脂质体中，DOPE起“分子伴侣”作用，是形成稳定的脂双层的脂质体结构所必需的。二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的化学式为 一种优选的SA脂质体是由带阳离子的硬脂胺脂质SA(Stearylamine)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按约1∶1重量比(w/w)构成的复合脂质。其分子结构CH3-(CH2)16-CH2-+NH3∶C41H78NO8P(DOPE)＝1∶1(w/w)。
SA脂质体的制备方法是已知的，例如可通过水浴超声法制备成小的单脂双层脂质体。
SA脂质体通常可保存于4℃，稳定期大于6个月。一种常用的脂质形式是水相悬液、浓度为2mg/ml，无菌。
药物组合物可用于本发明的药物活性成分没有特别限制，可以是本领域已知或未知的药物活性成分。特别优选的活性成分是多肽、蛋白质和核酸。
当活性成分是多肽或蛋白质时，它们可以是天然的、重组的或人工合成的。在本发明的药物组合物中，多肽或蛋白质与SA脂质体的重量比通常为1∶10～1∶300(w∶w)，较佳地为1∶10～1∶100。如本文所用，术语“核酸”包括DNA、RNA、寡核苷酸、反义核酸、或其混合物。当活性成分是核酸时，它们可以是分离的、抽提的或人工合成的。在本发明的药物组合物中，核酸与SA脂质体的重量比通常为1∶10～1∶300(w∶w)，较佳地为1∶10～1∶100(w∶w)，更佳地为1∶10～1∶50(w∶w)。
本发明药物组合物的制备方法没有特别限制，只要将所需比例的SA脂质体与多肽药物混合形成复合物即可。SA脂质体对药物本身不会造成任何破坏。
当然，在本发明的药物组合物中，还可含有其他药学上可接受的载体和添加剂，例如水、缓冲液，甘油、抗氧化剂等。这些添加剂都是制药领域中熟知的。
本发明药物组合物的剂型没有特别限制，如针剂、溶液、片剂和胶囊等。一种优选方式是制成针剂、例如液体溶液或悬液；或制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
给药方法一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是动物；尤其可以治疗人对象。
药物组合物的直接输送通常可通过皮下、皮内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括血管阻流给药；呼吸道喷雾给药；肝、肾等内脏器官的定点注射转染；腹股沟淋巴系统给药、口服、肺给药、栓剂和透皮或经皮肤施用、用针、基因枪。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。在给药操作中应尽量避免各种去垢剂、强电解质、有机溶剂、高温、氧化剂等。
应用性本发明已证明了SA阳离子脂质体不仅可用于多肽或蛋白质类活性成分，还可作为非病毒型药物载体可应用于基因治疗。SA脂质体具有运送和保护DNA、RNA、寡核苷酸等进入细胞的能力，有着多方面的用途。
此外，本发明的实验还证明了SA脂质体可在血清存在下高效转染各类哺乳动物真核细胞和昆虫细胞。
因此，SA脂质体具有稳定性好、抗降解性强，免疫原性弱等众多优点，是基因操作与基因治疗、体内和体外多肽传递的有效手段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1SA阳离子脂质体的制备取5mg SA(SIGMA)和5mg DOPE(SIGMA)(10mg/ml)于磨口圆底烧瓶内，高纯氮气吹干有机溶剂(约2～3小时)，冷冻干燥(Labconco，美国)2～3小时，加入20ml Millipore无菌水，充氮气加塞封口，冰水浴超声(上海超声波仪器四厂CQ-50超声波发生器)20分钟，然后用探头式超声仪(Branson Sonifer CellDisruptor B15超声仪)探头超声30分钟，超声过程中覆盖氮气。100,000g 4℃超离心30分钟(Centrikon超离心机)，取上清，159,000g 4℃超离心5小时，取中间层，用0.22μm孔径的微孔无菌滤膜过滤(Millipore)，充氮分装，于4℃保存。
实施例2SA脂质体-降钙素复合物的缓释及延长半衰期作用2.1 SA脂质体-降钙素复合物的形成1μg鲑鱼降钙素(SIGMA)用生理盐水稀释至300μl，含60μg的SA脂质体用生理盐水稀释至300μl，两者混匀，室温放置20～30分钟，再用生理盐水稀释至24ml。
2.2 SA脂质体-降钙素类似物I或II复合物的形成将1μg人降钙素类似物I(hCT-I)或人降钙素类似物II(hCT-II)，分别用生理盐水稀释至300μl。将含60μg的SA脂质体用生理盐水稀释至300μl，两者混匀，室温放置20～30分钟，再用生理盐水稀释至24ml。
2.3测试方法腹腔注射法比较SA脂质体作用前后的人降钙素类似物I、II效价和半衰期禁食18hr，仅喂食双蒸水的雄性Wistar大鼠按体重随机分组，每组8只，分别腹腔注射生理盐水稀释的SA脂质体(对照组)、鲑鱼或人降钙素类似物溶液和SA脂质体-鲑鱼或人降钙素类似物复合物溶液，每鼠注射0.4ml(16.6ng)。按不同时间取血样，按以下方法(OCPC法)测定血钙值。
每鼠取血约1ml，血液凝固后4000rpm/min离心10分钟。取血清50μl，加钙显色剂4.0ml，混匀，立即在570nm波长处测定吸收度(Hitachi，U-2000分光光度计spectrophotometer)。每次测试均伴钙标准曲线。
2.4实验结果(a)Wistar大鼠腹腔注射鲑鱼降钙素(sCT)以及注射SA脂质体-鲑鱼降钙素(sCT)复合物后降钙素体内半衰期的比较该实验中，分别以生理盐水和用生理盐水稀释的SA脂质体作为对照。
实验结果如见表1和图1所示。在注射鲑鱼降钙素后1小时的大鼠血钙值降到最低，但4小时时降钙作用已完全结束。比较注射SA-sCT复合物的结果发现，1小时的降钙作用较单纯注射sCT的略小，2小时的效果稍显著，而且SA-sCT复合物在4小时仍有一定降钙作用。
表1.腹腔注射鲑鱼降钙素(sCT)和SA脂质体-鲑鱼降钙素复合物后不同时间大鼠的血钙水平
(b)Wistar大鼠腹腔注射SA脂质体-人降钙素类似物I(hCT-I)复合物后的药效和时效该实验中，以生理盐水稀释的SA脂质体作为对照。
实验结果如见表2和图2所示。大鼠在注射SA-hCT-I复合物后血钙浓度即下降，2小时达最低值，SA-hCT-I复合物在注射4小时后的血钙值与对照组比较有显著差异(P＜0.01)，且在6小时尚有一定的降钙作用。
表2.与SA脂质体作用的人降钙素类似物I(hCT-I)对大鼠体内不同时间血钙鼠水平的比较
(c)Wistar大鼠腹腔注射人降钙素类似物II(hCT-II)及SA-hCT-II复合物后血钙水平变化的比较该实验中，以生理盐水稀释的SA脂质体作为对照。
实验结果如见表3和图3所示。在注射游离的人降钙素类似物II后1小时的大鼠血钙值降到最低，但5小时后的血钙值恢复正常。注射SA-hCT-II复合物后1小时的降血钙作用较单纯注射hCT-II的略差，2小时相同，而注射后5小时时仍可维持一定降钙作用。注射SA-hCT-II复合物3小时后的血钙值与对照组比较有显著差异(P＜0.0015)，且与注射游离hCT-II 3小时时的血钙值比较也有显著差异(P＜0.005)。
表3.与SA脂质体作用的人降钙素类似物II(hCT-II)大鼠体内不同时间血钙水平的比较
上述结果表明，SA脂质体可延长降钙素或其类似物的半衰期，并起缓释作用。
实施例3SA脂质体对成骨生长肽(OGP)作用的影响3.1 SA脂质体的制备按与实施例1中相同的方法制备SA脂质体。
3.2成骨肽的合成以常规固相合成法中Boc系统，将各种侧链和N端保护的氨基酸按成骨肽序列从C端向N端逐个合成，然后用干燥氟化氢切割下肽并脱去保护基，经Sephadex D10去盐和HPLC纯化，得产物氨基酸组成符合理论值。
3.3细胞培养细胞NIH3T3(Embryo，contact-inhibited，NIH Swiss)细胞株是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得的。细胞用含10％FBS的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2的细胞培养箱(Herarus)中培养。二天换液，三天传代。
3.4测试方法通过以下方法测定游离成骨肽对NIH3T3细胞的作用接种细胞约5×103于24孔塑料培养板(Corning)中，每孔加500ul含10％FBS胎牛血清的DMEM/F12培养液培养24小时。OGP用PBS稀释成系列不同的浓度(10-5至10-15M)。NIH3T3与OGP作用前，换450ul含10％FBS胎牛血清的DMEM/F12培液，加入不同浓度的OGP溶液50ul，使最终与细胞作用的OGP在培液的浓度为10-6～10-16M，每2天换一次含相应原来OGP浓度的培液。
按以下方法测定SA脂质体-成骨肽复合物对NIH3T3细胞的作用每孔取SA脂质体(2ug/ul)1ug与不同浓度的OGP在室温孵育30分钟，并用1×PBS稀释成50ul，使0GP的系列浓度为10-6至10-6M。NIH3T3用450ul含10％FBS胎牛血清的DMEM/F12培液保温，加入不同浓度的SA-OGP溶液，使最终与细胞作用的OGP在培液中的浓度为10-6～10-16M，每2天换一次含相应浓度的SA-OGP溶液。
用结晶紫法测定细胞生长值，方法如下吸除待测24孔板中的细胞培养液，加250ul，4％甲醛溶液(配于1×PBS中，pH7.2)固定1小时，用ddH2O洗三次，空气干燥。每孔再加入200ul 0.01％结晶紫染色液(配于0.2M磷酸缓冲液中，pH6.8)染色30分钟，用ddH2O洗三次，空气干燥。每孔加500ul 10％HAC，溶解2小时后测OD590值(Beckman DU650分光光度计)。
3.5实验结果结果如图4和5所示。
图4是不同浓度的游离OGP和不同浓度OGP经与1ugSA脂质体作用后处理NIH3T3细胞增长第三天的细胞生长曲线。实验发现，当游离的OGP浓度为10-11～10-7M时有助于促进细胞增殖，而在10-9M时为最佳，进一步加大OGP浓度时，细胞的生长反而受到抑制。当不同浓度的OGP与SA脂质体孵育后，细胞的生长曲线明显发生改变，峰值发生位移，与SA脂质体结合的OGP浓度在10-12～10-16M时有助于促进细胞增殖，在10-14M时为最佳，然后随着OGP浓度的增加细胞，生长又渐趋缓。与SA脂质体结合的OGP促进细胞生长达到峰值的浓度只是游离OGP的十万分之一。
图5是不同剂量游离的SA脂质体对24孔板中NIH3T3细胞生长的影响，每孔接种5×104细胞。结果表明，不同剂量的游离的SA脂质体对NIH3T3细胞生长无不良影响。
实施例4SA脂质体应用于基因治疗4.1SA脂质体的最适条件在不同条件下，将SA脂质体应用于DNA转染真核细胞，得到了表4所示的SA脂质体体外介导DNA转染的最适条件。在SA脂质体-DNA复合物中，优选的SA脂质体与DNA之比约为10-50/1。
表4.SA脂质体体外介导DNA转染的优选条件
4.2 SA脂质体体外转染(in vitro)的步骤1)细胞接种接种细胞于培养瓶/培养皿内，培养24小时后，细胞密度达80％～90％。
2)SA-DNA复合物的形成以转染2.5×105个细胞为例，0.1～10μg DNA用超纯水稀释至50μl，5～30μg脂质体用超纯水稀释至50μl，两者混合均匀，室温放置25～30分钟。
3)换培液细胞换无血清培液。有的细胞株换用含适量小牛血清的培液效果更好。
4)转染将SA-DNA复合物滴加入培养皿，轻轻摇匀，37℃培养18小时，换正常含血清培液培养48小时，然后测其定转染活力。
4.3 SA脂质体体内转染(in vivo)的步骤将SA∶DNA＝10∶1(w/w)的混合物加入10倍体积(视实验需要可适当增减)的超滤水或各类佐剂，混匀，室温放置25分钟，形成SA-DNA复合物。然后进行动物实验。
实施例5有血清条件下的SA脂质体介导DNA对昆虫细胞的转染采用SA脂质体(2mg/ml)介导DNA对昆虫细胞进行转染。按照文献的方法，从感染病毒的细胞培养上清中的病毒颗粒子中提取苜蓿丫纹夜蛾(Autographa califbrnica)核型多角体病毒(AcMNPV)基因组DNA。转移载体pBlueBacEPO质粒DNA按文献碱法提取后，经Sepharose 2B柱分离纯化而得。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-21细胞株用含10％胎牛血清(FBS)(Sigma Co.，)的TC-100培液(GIBCO-BRL Co.，)，于27℃恒温培养。
138kb的野生型AcMNPV含有多角体蛋白基因，多角体蛋白在感染晚期可达整个细胞中总碱性可溶蛋白的17％以上，感染晚期所形成的病毒多角体充斥整个细胞核，在显微镜下非常容易识别。
在直径35mm的塑料培养皿中接种约1×105Sf-21细胞，细胞密度约为70％，贴壁生长过夜。第二天换1ml含10％胎牛血清TC-100培液。病毒DNA和SA脂质体用无菌水分别稀释，两者混匀，共100μl作转染液，室温静置15min，逐滴加入培养细胞的培养皿中，27℃培养6h后，补加培液到3ml。继续置27℃培养72h，在200倍倒置显微镜下，每培养皿随机检查10个视野，统计含有多角体的细胞数量。可见共有2796个细胞的核中出现明显的多角体，占细胞总量的69％。
结果说明，SA脂质体可以在10％血清条件下仍可有效地介导长达138kb的病毒基因组DNA转染昆虫细胞。而Lipofectim试剂只能在无血清存在条件下介导DNA转染细胞。
实施例6用SA脂质体包裹的vEGF反义核酸对裸鼠人肝癌生长的抑制1.动物4周龄的Balb/cA裸鼠。预先在其侧腹部缝制一个直径约1.0cm皮囊，将5×106LC1-D20人肝癌细胞悬液接种在皮囊内。
2.反义核酸5′-GCA GTA GCT GCG CTG ATA AGT GC-3′3.SA脂质体300μg在生理盐水中和60μg反义核酸在室温混合，放置15min。
4.动物及分组、剂量A组，共8只，注射生理盐水B组，共6只，注射300μg SA脂质体C组，共10只，注射反义核酸100μgD组，共8只，注射60μg反义核酸+300μg SA脂质体5.注射方法及效果观察在接种动物的次日，开始将寡核苷酸注射在皮囊内，隔日一次，共7次。在接种5周后，处死动物，称取瘤重。
在接种5周后，单纯注射反义核酸的瘤重是对照组的53％，而注射SA脂质体-反义核酸复合物的瘤重为对照组的37％，SA-脂质体-反义核酸组的反义核酸用量为单纯注射时的五分之三。
结果显示用SA脂质体合并给药的vEGF反义核酸对裸鼠人肝癌生长的抑制更显著。
实施例7SA脂质体在有血清存在时转染COS细胞1.pCH110质粒DNA的制备按文献[Birnboim，H.C.，and Doly，J.1979，Nucleic Acids Research，71513]进行。
2.细胞COS细胞株是从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)获得的。
3.Lipofectin(GIBCO BRL Co.，)介导DNA转染
Lipofectin试剂转染按文献[Whitt，M.A.et al.，1991，Focus，138-12]进行；COS细胞用含10％FCS(GIBCO BRL Co.)的DMEM/F12(GIBCO BRL Co.，)培养液在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
4.SA脂质体介导DNA转染接种细胞约7.5×105个于Φ60mm塑料培养皿(Corning)中，含10％FBS胎牛血清的DMEM/F12培液培养24小时。换无血清和含不同浓度(分别为1％至20％)胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培液3ml，此时培养的细胞密度应为80～90％。3μl浓度为1mg/ml的质粒DNA用无菌水稀释至150μl，含60μl(浓度2mg/ml)脂质的SA脂质体用无菌水稀释至150μl，两者混匀，室温放置15～30分钟形成SA-DNA复合物，滴加入培养皿中，37℃、CO2培箱培养18小时。换4ml 10％FCS DMEM/F12培养液，培养48小时。
5.基因表达的测定收获细胞，细胞用PBS漂洗三次，加含10mM EDTA的PBS消化，收集的细胞在液氮-37℃水浴冻融三次，裂解细胞，离心，按文献[Hall，C.V.et al.，1983，J.Mol.Appl.Genet.，2101-109]取细胞抽提液测转入的pCH110基因表达的β-半乳糖苷酶活力(OD420)。
6.蛋白含量用Folin酚法(Lowry法)测定[Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.，and Randall，R.J.，1951，J.Biol.Chem.，193265]7.结果转染是在直径60mm的培养皿中进行，培养皿中细胞数用细胞抽提液总蛋白来表示。转染分别在SA脂质体和Lipofectin试剂的最佳脂质/DNA浓度下进行。转染效率以细胞抽提液中β-半乳糖苷酶活力来表示。
血清对SA脂质体或Lipofectin试剂转染COS细胞效率的影响是截然不同的。SA脂质体对于COS细胞的转染效率随着血清浓度的增高而增大(20％FBS时为最佳值，为无血清条件的230％)；在血清存在下Lipofectin转染COS细胞的效率明显地被抑制，在20％FBS时转染效率只有无血清时对照的11％。
实施例8SA脂质体在有血清存在时转染NB-1细胞1.pCH110质粒DNA同实施例7。
2.细胞NB-1(Neuroblastoma，Human)细胞株是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的。
3.Lipofectin(GIBCO BRL Co.，)介导DNA转染同实施例7。
4.SA脂质体介导DNA转染同实施例7，不同点仅在于用NB-1替换COS细胞。
5.基因表达的测定同实施例7。
6.蛋白含量用Folin酚法(Lowry法)测定同实施例7。
7.结果NB-1属于神经胶质瘤细胞株，它通常较难被转染。血清对SA脂质体和Lipofectin转染NB-1细胞有完全不同的影响，两种方法的剂量-反应曲线的走向相反，在20％FBS SA脂质体存在下有十五倍于无血清条件的转染活力，而Lipofectin则下降到无血清时的20％。(见图6)。
实施例9SA脂质体在有血清存在时转染P19细胞1.pCH110质粒DNA同实施例7。
2.细胞P19(Embryonic carcinoma，mouse)细胞株是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的。
3.Lipofectin(GIBCO BRL Co.，)介导DNA转染同实施例7。
4.SA脂质体介导DNA转染同实施例7，不同点仅在于用P19细胞替换了COS细胞。
5.基因表达的测定同实施例7。
6.蛋白含量用Folin酚法(Lowry法)测定同实施例7。
7.结果P19是一株胚胎性癌细胞，是畸胎瘤中的干细胞，具有发育的多潜能，通过诱导可模拟多种组织的胚胎发育过程，被许多实验室用作神经系统发生的体外研究模型。在不同血清浓度梯度存在下的SA脂质体和Lipofectin转染的比较实验发现，SA脂质体在10％FBS时获得了最佳值，且所有在含有血清时的转染值均大于无血清；而Lipofectin的转染随血清浓度的增高，转染活力下降(20％FBS时为无血清时的60％)(见图7)。
实施例10
SA脂质体在有血清存在时转染PC12细胞按实施例7所述的方法进行试验，不同点仅在于用PC12(Adrenalpheochromocytoma，rat)细胞株(从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)获得)替换COS细胞。
PC12是一种大鼠肾上腺嗜铬癌细胞，常被用作细胞模型。PC12细胞的转染中，SA脂质体在6％的FBS+HS混合血清时获得最佳转染值，且所有血清条件下的转染值均大于无血清；而Lipofectin随血清浓度转染活力递减(20％FBS时为无血清条件的10％)(图8)。
讨论为了阐明SA脂质体体外转染的机制和适用范围，在实施例7-10等试验中选择了不同来源有代表性的常用的二十多种细胞株(部分数据未示出)，用SA脂质体结合磷酸钙共沉淀法、Lipofectin法分别介导质粒PCH110或质粒PSK110进入细胞，测定其β半乳糖苷酶的活力以进行比较，结果发现不同的转染方法有明显不同的细胞选择性，每种转染方法都有最适合高表达的细胞株。总体结果表明，SA脂质体有较理想的转染能力。
一般说来，硬脂胺脂质体与Lipofectin试剂的效果比磷酸钙来得好。而SA脂质体应用范围及效果更好一些。SA脂质体的绝对最佳选择率和相对最佳选择率均比Lipofectin法和磷酸钙共沉淀法高，对一些细胞如CV-1、CHO等细胞有特异性的高表达，且PA-1、NRK49F等细胞只能用SA法转染，考虑到不同转染方法的互补性、稳定性以及潜在的价格因素，SA阳离子脂质体是介导基因进入真核细胞的一种有效的新的转染技术。
实施例11体外SA脂质体对寡核苷酸转染效率的影响1.寡核苷酸的制备按“分子克隆实验指南”中的方法。
2.SA脂质体(2mg/ml)的制备。
制法同实施例1。
3.细胞7721人肝癌细胞株是从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)获得的。
4.转染方法处于指数生长期的人肝癌7721细胞以1×104/每毫升接种在1000微升含10％胎牛血清(FBS)(GIBCO Co.，)的1640培养液(GIBCO Co.，)的24孔培养板中，37℃、5％二氧化碳培养24小时。用无血清的1640培养液洗2次。分别以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20比率(寡核苷酸和SA脂质体的重量比)包裹5×104dpm32P标记的寡核苷酸及4微克未标记的寡核苷酸，继续在37℃、5％CO2培养12小时。用冷的Hank′s液洗3次，加1000微升1％SDS(SIGMA Co.，)溶解细胞。经LS-6500液闪仪计数dpm值。5.结果
结果显示，SA脂质体能显著提高寡核苷酸的转染效率，在1∶15时已接近达最高转染效率。体外SA脂质体对寡核苷酸转染效率的影响结果显示，SA阳离子脂质体能提高寡核苷酸的转染效率达60倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，它含有药物活性成分和作为药物载体的SA脂质体。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的药物活性成分选自多肽、蛋白质、核酸。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的药物活性成分是多肽或蛋白，且多肽或蛋白与SA脂质体的重量比为1∶10～1∶300。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的药物活性成分是核酸，且其与SA脂质体的重量比为1∶10～1∶300。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的SA脂质体是CH3-(CH2)16-CH2-+NH3∶C41H78NO8P(DOPE)＝0.8∶1～1∶0.8(w/w)。
6.如权利要求1所述的组合物，所述的活性成分选自降钙素、人降钙素类似物I、人降钙素类似物II、成骨生长肽。
7.SA脂质体的用途，其特征在于，作为药物载体用于制备药物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物中的活性成分选白多肽、蛋白质、核酸。
9.一种转染方法，其特征在于，将核酸与SA脂质体脂质体以重量比1∶10.-1∶20混合，然后转染。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的核酸选自DNA、RNA、寡核苷酸、反义核酸、或其混合物。
全文摘要
本发明提供了一种安全、高效的药物载体，即SA脂质体。还提供了含有SA脂质体作为药物载体的药物组合物。SA脂质体与多肽、蛋白、核酸等各种药物活性成分一起使用时，免疫原性小，稳定性好。对于多肽药物，SA脂质体能延长其半衰期且具有一定的药物缓释作用。对于核酸药物，SA脂质体可在血清存在下高效转染各类哺乳动物真核细胞和昆虫细胞。
文档编号A61K9/127GK1473621SQ0213643
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月9日 优先权日2002年8月9日
发明者林其谁, 王瓞, 崔大敷, 宣海星, 杨静平 申请人:中国科学院生物化学与细胞生物学研究所, 中国科学院生物化学与细胞生物学研究