专利名称：抗原致敏的人树突状细胞的制备及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种肿瘤抗原的制备方法以及用该方法制得的抗原来制备抗原致敏的人树突状细胞的方法。
背景技术：
树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是正常人体内存在的一种具有特殊功能的抗原提呈细胞，被喻为机体的“天然佐剂”，能够直接摄取、加工、呈递抗原，刺激体内的初始型T细胞活化，是机体免疫应答的“启动者”。此外DC还可以通过直接或间接方式促进B细胞的增殖与活化，调控体液免疫应答；刺激记忆T细胞活化诱发再次免疫应答；与NK相互作用影响非特异性的、天然免疫应答，因此DC可以说是机体内免疫应答反应的“始作俑者”。DC处于肿瘤免疫的关键环节，能摄取和加工处理肿瘤抗原并调动机体主动特异性抗肿瘤免疫反应杀伤肿瘤细胞。在众多肿瘤的生物疗法中，基于DC的免疫治疗由于能发挥患者机体自主的抗肿瘤免疫功能而备受重视。
利用DC进行肿瘤的免疫治疗，主要目的是诱导患者机体产生肿瘤特异性的、持久的免疫应答。在这些疗法中，报道最多、研究最深入、应用最广泛、疗效最确切的是应用肿瘤抗原致敏的树突状细胞对肿瘤的治疗。已报导的临床观察资料表明，该疗法的疗效超过以往所报道的各种生物疗法，也是最具希望的一种，该疗法的应用前景被广为看好。
肿瘤免疫治疗的关键原理就是充分调动机体的免疫功能以杀灭肿瘤细胞。由于DC处于肿瘤免疫的关键环节，即能摄取和加工处理肿瘤抗原并调动机体主动特异性抗肿瘤免疫反应，因此，利用DC的功能特点，在DC成熟之前，充分发挥其摄取抗原的功能，给以肿瘤抗原刺激，再将摄取了肿瘤抗原的DC回输至体内，携带肿瘤抗原的DC在将抗原信息提呈给T细胞时，活化了T细胞，从而诱导机体产生了具有特异性杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，因而对患者产生一定的治疗作用。
采用肿瘤抗原直接致敏树突状细胞，回输体内后可以诱导机体产生肿瘤抗特异性的细胞免疫应答，但是如何高效、快速地获得肿瘤抗原并用于树突状细胞的致敏仍然是肿瘤免疫治疗领域研究的重要课题。尽管目前对于某些肿瘤抗原有一定的了解，但是但绝大多数肿瘤的肿瘤抗原仍是未知的；已知的抗原多肽并不一定能诱导最佳的抗肿瘤免疫反应，如从黑色素瘤患者外周血中诱导出的CTL细胞并不能认别目前所克隆的肿瘤的抗原如gp100、MART1等，提示可能存在其他未知的肿瘤抗原能有效诱导抗肿瘤免疫应答；针对单一抗原决定族的CTL克隆未必能有效诱导抗肿瘤免疫排斥反应，针对多个抗原决定族共同作用可能发挥最佳的抗肿瘤作用。
热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核及真核生物中的一类蛋白质，是生物细胞应激反应的诱导产物，HSP在机体的免疫反应过程中发挥着重要作用，通过参与抗原加工递呈、T细胞活化等重要的生理过程，与机体的抗肿瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理机制密切相关，是一类重要的免疫分子。热休克蛋白家族按照分子量可以分为四类HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子HSP家族。其中HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一类。
Armold的实验表明，用转染了β-Gal的细胞来源的HSP90家族分子gp96免疫小鼠，可以产生针对β-Gal特异性的CD8+的CTL。Blachere等在体外重构了HSP70和gp96的多肽复合物，结果表明HSP本身是没有诱导出特异性的免疫，而HSP结合的多肽能诱导出抗原特异性的CTL，但将肽结合在其它的肽结合蛋白如小鼠的清蛋白，则无免疫原性。
Srivastava的实验表明，肿瘤细胞来源的HSP70多肽复合物可以诱导特异的抗肿瘤免疫，并且证实，这种免疫原性是来自于HSP多肽复合物中的小分子物质而不是HSP，经过反相HPLC分析，这些小分子物质的分子量为1-5kD，去除了这些小分子物质，HSP则丧失其免疫原性，但仅用这些小分子物质免疫小鼠并不能得到好的免疫效果，因此HSP在抗原递呈过程中的佐剂样作用及小分子肽的免疫原性是HSP介导的免疫治疗所不可缺少的两个重要部分。
Blachere等的研究表明，HSP可以成为CD8+T细胞反应的一种新的佐剂。Moroi等采用OVA257-264 T细胞表位作为抗原肽，在体外与HWDFAWPW这种可以与HSP70蛋白结合的肽结合域交联，形成杂合蛋白，结果有效地诱导出针对OVA抗原的特异性的CTL，并且可以明显抵抗E.G7-OVA肿瘤细胞的攻击，而单独使用OVA抗原肽或HSP70则不能诱导CTL反应，表明HSP70分子对T细胞的激活具有明显的佐剂样效应。
Amold-Schild等证实了HSP诱导的特异性CTL反应是由于专职抗原递呈细胞(APC)上存在HSP的受体，可以使APC特异性地通过HSP受体介导抗原肽的内吞，从形态学上推测了HSP受体的存在。
在2000年6月的J.Exp.Med上，Castellino和Singh-Jasuja等在不同的实验中分别证实了DC表面存在HSP受体，并推测HSP受体是可饱和的，同时证实了HSP结合的抗原在胞内是通过TAP依赖及TAP非依赖途径，被递呈到MHC-I类分子上，并诱导随后的CTL反应的。这种受体被证明存在于DC、巨噬细胞及B细胞等APC上，而不存在于T细胞上。因此可以认为，HSP通过HSP受体与APC相互作用是HSP作为佐剂的一个重要机理。研究表明，这种受体介导的抗原递呈方式的效率比吞噬高1000～10000倍。
Asea等发现，HSP70分子在胞外可以行使类似细胞因子样作用。HSP70可与单核细胞产生高亲和力的结合，诱导其产生IL-6、IL-1等活性细胞因子，并可以诱导DC成熟，上调其MHC-II和CD86分子表达，分泌IL-12和TNF-α，从而增强DC的抗原递呈能力。因此采用HSP作为免疫佐剂诱导DC，可以靶向性介导抗原的递呈，增强抗原的递呈效率，从而诱导更强的CTL反应。
然而，迄今为止，还没有有效制备引发针对肿瘤的特异性免疫应答的肿瘤抗原的方法。因此，本领域迫切需要开发新的可有效引发针对肿瘤的免疫应答的肿瘤抗原及其制备方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可有效引发针对肿瘤的免疫诱导的肿瘤抗原及其制备方法。
本发明的另一目的是提供用本发明的肿瘤抗原致敏的树突状细胞及其制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种肿瘤抗原的提取方法，包括步骤(a)在42℃加热处理肿瘤细胞；(b)在55℃加热处理肿瘤细胞；(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解；(d)去除细胞碎片，分离获得含有肿瘤抗原的上清液。
在一优选例中，裂解细胞是通过冻融肿瘤细胞1-10次实现的。
在另一优选例中，步骤(a)和(b)的处理时间为0.1-100小时。
在本发明的第二方面，提供了一种肿瘤抗原，它是热休克蛋白-抗原肽的复合物，该复合物是通过以下步骤制备的(a)在42℃加热处理肿瘤细胞；(b)在55℃加热处理肿瘤细胞；(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解；(d)离心去除细胞碎片，获得含有热休克蛋白-抗原肽的上清液。
在本发明的第三方面，提供了一种树突状细胞的致敏方法，包括步骤(a)在42℃加热处理肿瘤细胞；(b)在55℃加热处理肿瘤细胞；(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解；(d)离心去除细胞碎片，获得含有肿瘤抗原的上清液。
(e)将步骤(d)中的肿瘤抗原与树突状细胞共孵育，从而获得致敏的树突状细胞。
在一优选例中，步骤(e)中的树突状细胞来源于外周血单核细胞，且所述的树突状细胞是用下列方法制备的采用含50ng/ml的rhGM-CSF，10ng/ml的重组人白细胞介素-4的新鲜完全培养基，置5％二氧化碳，37℃，饱和湿度的培养箱中培养外周血单核细胞至第3天，往培养瓶中补充20ml含10％胎牛血清、rhGM-CSF50ng/ml、rhIL-410ng/ml的新鲜培养基，继续培养至第6天。
在另一优选例中，还包括步骤(f)将获得的致敏的树突状细胞保存于体外保存液中，所述保存液的配方如下42.5％的RPMI-1640培养基，7.5％的DMSO，50％的浓度为20％人血浆白蛋白，按保存液的总体积计。
在另一优选例中，在步骤(e)中，肿瘤抗原与树突状细胞的混合比例为1微克抗原1×108个细胞至100微克抗原105个细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是选自下组癌症的肿瘤细胞结肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、鼻咽癌、脑胶质瘤。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物或免疫组合物，它含有药学上可接受的载体载体，以及本发明上述的肿瘤抗原或用所述肿瘤抗原致敏的树突状细胞。
图1四个结肠癌患者肿瘤组织加热前后，HSP70表达水平的比较(westernblot)，其中加热后HSP70表达水平明显升高图2.诱导第6天的人树突状细胞的形态学观察。
图3.诱导前的单核细胞与诱导后树突状细胞的表型变化。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现通过二步法热诱导肿瘤细胞，可以使肿瘤细胞内HSP的表达明显升高，通过反复冻融后，HSP携带肿瘤抗原大量地释放于上清中，从而获得大量的HSP-抗原肽的复合物，将这些复合物作为肿瘤抗原，可以更为高效地激活树突状细胞。在此基础上完成了本发明。
首先，本发明的肿瘤抗原的提取方法，包括以下步骤(a)在较低的高温下加热处理肿瘤细胞(第一加热阶段)将分离的肿瘤细胞或组织，在比正常温度稍高的温度即第一加热温度(例如约42℃)下放置约一段时间，例如约0.1-100小时，较佳地0.2-10小时，更佳地0.5-5小时。
(b)在较高的高温下加热处理肿瘤细胞(第二加热阶段)将分离的肿瘤细胞或组织，在比正常温度更稍高的温度即第二加热温度(例如约55℃℃)下放置约一段时间，例如约0.1-100小时，较佳地约0.2-10小时，更佳地约0.5-5小时。
通常，第二加热温度比第一加热温度高约15-25℃。
(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解可以采用本领域已知的各种方法来裂解肿瘤细胞，例如机械裂解或化学裂解。一种优选的方法是冻融法，即通过反复冻融使细胞裂解。
(d)去除细胞碎片等杂质，分离获得含有肿瘤抗原的上清液。
由于裂解后HSP-抗原多肽复合物存在于上清液中，因此可以用各种常规方法(例如，离心、超滤等)将细胞碎片等杂质去除，获得含有HSP-抗原多肽复合物(即肿瘤抗原)的上清液。
可用于本发明的肿瘤细胞没有特别限制，可以是任何一种肿瘤细胞，代表性例子包括(但并不限于)选自下组癌症的肿瘤细胞结肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、鼻咽癌、脑胶质瘤。
用本发明方法制备的肿瘤抗原，其成分主要是热休克蛋白-抗原肽的复合物。实验已表明，经过本发明的二步加热处理后，上清液中HSP(例如HSP70)的表达明显上升。
用本发明方法制备的肿瘤抗原，可以由多种应用。例如，作为免疫原来致敏树突状细胞，从而获得致敏的树突状细胞，或者直接作为免疫原制备免疫组合物或药物组合物。
本发明还提供了一种药物组合物或免疫组合物。在所述组合物中，含有药学上可接受的载体(包括稀释剂、赋形剂等)以及有效量的本发明肿瘤抗原或者致敏的树突状细胞。肿瘤抗原的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。致敏的树突状细胞的数量通常为约105-108个细胞/剂。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克的肿瘤抗原。对于致敏的树突状细胞而言，有效量通常为约105-108个细胞/个对象。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如肿瘤抗原)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可能是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
直接输送该组合物通常可通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或输送至组织间隙来实现。组合物也可输送至病灶区。其它给药方式包括口服、和透皮施用等。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
本发明还提供了用本发明的肿瘤抗原来致敏树突状细胞的方法，即将肿瘤抗原与树突状细胞共孵育，从而获得致敏的树突状细胞。孵育时，肿瘤抗原与树突状细胞的混合比例为1微克抗原1×108个细胞至100微克抗原105个细胞，即1-100微克抗原1×105-1×108个细胞。较佳地混合比例为1微克抗原1×107个细胞至100微克抗原106个细胞孵育温度和时间没有特别限制，通常为35-37.5℃的温度下孵育0.1-100小时(较佳地1-48小时)。
可用于本发明的树突状细胞没有特别限制，可以采用各种来源的树突状细胞。尤其是人的树突状细胞。一种优选的的树突状细胞来源于外周血单核细胞。
本发明还提供了一种制备树突状细胞的方法制备采用含25-100ng/ml的rhGM-CSF，5-20ng/ml的重组人白细胞介素-4的新鲜完全培养基，置5％二氧化碳，37℃，饱和湿度的培养箱中培养外周血单核细胞至第3天，往培养瓶中补充含10％胎牛血清、rhGM-CSF 25-100ng/ml、rhIL-4 5-20ng/ml的新鲜培养基，继续培养至第6天。
致敏的树突状细胞可以常规方法保存。一种优选的方法是将获得的致敏的树突状细胞保存于体外保存液中，所述保存液的配方如下42.5％的RPMI-1640培养基，7.5％的DMSO，50％的浓度为20％人血浆白蛋白，按保存液的总体积计。该配方具有复苏后树突状细胞存活率高，配方中成分毒性低、适用于应用于临床的树突状细胞的保存及复苏。此外，保存宜在液氮或超低温冰箱中低温保存。
本发明的主要优点在于(1)从肿瘤细胞中直接分离肿瘤抗原。这样制备的肿瘤抗原包含了肿瘤中存在的所有抗原。目前的理论认为，肿瘤中的抗原是以“抗原指纹”的形式存在，而不是某个单独的抗原，按照该理论，每个人的肿瘤抗原均存在个体差异，因此，从肿瘤细胞中分离的肿瘤抗原应是较为理想的途径。
(2)工艺简便，致敏效率高，使用安全。从热诱导后的肿瘤细胞冻融上清中纯化出肿瘤抗原，用于致敏树突状细胞，具有致敏效率高，所需抗原量少，使用安全，防止微生物污染等效果。
(3)结合本发明的树突状细胞专用冻存液，具有临床使用安全、复苏效率高的特点，从而解决了树突状细胞临床治疗的关键性问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1肿瘤抗原的制备取手术切除的无菌结肠癌肿瘤组织(4个病例)，用0.05％醋酸洗必泰溶液浸泡30分钟，无菌生理盐水冲洗3遍，用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入5ml RPMI 1640培养基研磨，经200目钢网过滤后收取单细胞悬液，然后用RPMI1640培养基重悬细胞(1×107/ml)，装入5ml无菌冻存管，经42℃水浴加热1小时后，60℃水浴继续加热1小时，将冻存管迅速浸入液氮速冻，10分钟后取出，放入室温融化；如此反复冻融5次，将肿瘤细胞裂解物加入15ml Falcon离心管，400×g离心20分钟，收取上清。肿瘤细胞冻融上清经0.2μm的一次性无菌滤器过滤除菌，即为肿瘤抗原。
采用HSP70单抗作为一抗对加热后及为加热的肿瘤组织中分离的肿瘤抗原作Western-blot分析，结果如图1所示，加热后肿瘤抗原中HSP70的表达明显增高。
实施例2树突状细胞的制备将收取的单个核细胞(约50-100ml)缓慢加入数个预加20ml淋巴细胞分离液的50ml Falcon离心管(细胞悬液体积与分离液体积相等)，离心管经严格配平后400×g室温离心30分钟，离心后用平口巴氏滴管吸取界面细胞，加入到30mlRPMI1640培养基中，200×g离心10分钟，洗涤3遍，收取细胞，将经离心洗涤的单个核细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基配成4×106/ml的细胞悬液，种入750ml无菌Falcon培养瓶，接种体积25ml，将盛有细胞的培养瓶置37℃、5％二氧化碳，饱和湿度的培养箱中培养贴壁2小时，将培养瓶取出，轻轻摇晃十数次，使非贴壁细胞悬起，弃去悬浮细胞，再缓慢往瓶中加入10mlRPMI1640培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞，往保留贴壁细胞的培养瓶中加入30ml含10％胎牛血清，rhGM-CSF50ng/ml，重组人白细胞介素-4(rhIL-4)10ng/ml的新鲜完全培养基置5％二氧化碳，37℃，饱和湿度的培养箱中继续培养，培养至第3天，往培养瓶中补充20ml含10％胎牛血清、rhGM-CSF 50ng/ml、rhIL-410ng/ml的新鲜培养基，继续培养2-3天，培养过程中每天2次观察细胞的形态，在培养的第5，6天，可见细胞变为毛刺状，并聚集成团，终止培养。用10ml吸管轻轻吹打培养瓶底部，使部分半贴壁的树突状细胞悬起，将培养液吸入50ml离心管，200×g离心10分钟，收取树突状细胞。
用流式细胞仪检测诱导第6天的人树突状细胞的形态和表型变化，图2和图3显示了树突状细胞的形态和表型变化。同时，采用混合淋巴细胞反应检测其生物学功能。结果证实了获得的细胞是树突状细胞。
实施例3树突状细胞的致敏将收取的树突状细胞用含10％胎牛血清、rhGM-CSF 50ng/ml、rhIL-410ng/ml的新鲜完全培养基配成2×106/ml的细胞悬液，加入实施例1中制备的肿瘤抗原至终浓度50μg/ml，过夜培养，用50ml离心管收取经与肿瘤抗原孵育过夜的树突状细胞悬液，200×g离心10分钟，收取细胞；再加入40ml无菌生理盐水，200×g离心10分钟洗涤，连续3次。收集细胞即为抗原致敏的人树突状细胞(APDC)。
实施例4树突状细胞的冻存与复苏将抗原致敏的人树突状细胞(APDC)半成品用预先配好的冻存液(RPMI-1640培养基占42.5％，DMSO占7.5％，20％的人血浆白蛋白占50％)配成1×107/ml的悬液，分装入2ml冻存管中，1ml/管，放入专用的冻存盒(每分钟1℃缓慢降温)，置-80℃冰箱中冷冻保存，于输注当天复苏细胞。用洁净的塑料杯加入200ml 40℃纯净水，将冻存的细胞从超低温冰箱中取出后迅速放入温水中完全解冻，然后将复苏的细胞加入到50ml离心管中(离心管中预置37℃预热的无菌生理盐水40ml)，200×g离心10分钟，洗涤3遍；用10ml含1％人血浆白蛋白的无菌生理盐水配成细胞悬液，1×106个/ml，分10管，2-8℃保存。
实施例5抗原致敏的人树突状细胞刺激异体T淋巴细胞的增殖反应分离正常人外周血单个核细胞，置37℃培养2小时后去除贴壁细胞，非贴壁细胞用5％胎牛血清的RPMI1640完全培养液悬浮，过尼龙毛柱(37℃孵育1小时)，制备的T淋巴细胞加入96孔板(2×105/孔)；APDC经丝裂霉素(25μg/ml)于37℃处理1小时后，悬于含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基，按不同剂量(1×104～1×105/孔)加入96孔板中与同种异体T淋巴细胞混合，每组设3个复孔，终体积为200μl；阴性对照组为在T淋巴细胞中加入等体积RPMI1640培养基，阳性对照组为在T淋巴细胞中加入终浓度为5μg/ml的PHA。置37℃、5％CO2孵箱中孵育96小时，于培养终止前4小时，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，在37℃条件下继续孵育4小时，将培养板200×g离心10分钟，每孔吸出100ul上清，然后每孔加入10％SDS溶液100μl，在37℃放置8小时待甲臢结晶完全溶解后，用酶标仪测定光密度值(570nm)。采用Student t检验比较对照组及试验组OD值。
结果如表1所示，经抗原致敏的人树突状细胞具有明显刺激异体T淋巴细胞增殖的特性(p＜0.05)。
表1.抗原致敏的人树突状细胞刺激异体T淋巴细胞增殖的能力(p＜0.05)T∶DCOD1234∶1 0.3240.3260.34620∶10.3880.3760.37740∶10.3700.3670.365200∶1 0.3420.3450.318阳性对照 0.4470.3890.434阴性对 0.2690.2620.268实施例6树突状细胞的应用经实施例4冻存复苏的细胞，通过相关检定后，将其注入50ml注射用生理盐水中，用前将细胞悬液摇匀，静脉滴注，在滴注过程中每5分钟轻轻晃动输液袋，避免细胞沉降堆积，直致滴完。或者采用皮下注射，每次注射1ml，每周注射1次，连续3次为一个疗程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种肿瘤抗原的提取方法，其特征在于，包括步骤(a)在42℃加热处理肿瘤细胞；(b)在55℃加热处理肿瘤细胞；(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解；(d)去除细胞碎片，分离获得含有肿瘤抗原的上清液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，裂解细胞是通过冻融肿瘤细胞1-10次实现的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)和(b)的处理时间为0.1-100小时。
4.一种肿瘤抗原，其特征在于，它是热休克蛋白-抗原肽的复合物，该复合物是通过以下步骤制备的(a)在42℃加热处理肿瘤细胞；(b)在55℃加热处理肿瘤细胞；(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解；(d)离心去除细胞碎片，获得含有热休克蛋白-抗原肽的上清液。
5.一种树突状细胞的致敏方法，其特征在于，包括步骤(a)在42℃加热处理肿瘤细胞；(b)在55℃加热处理肿瘤细胞；(c)使步骤(b)的肿瘤细胞裂解；(d)离心去除细胞碎片，获得含有肿瘤抗原的上清液。(e)将步骤(d)中的肿瘤抗原与树突状细胞共孵育，从而获得致敏的树突状细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(e)中的树突状细胞来源于外周血单核细胞，且所述的树突状细胞是用下列方法制备的采用含50ng/ml的rhGM-CSF，10ng/ml的重组人白细胞介素-4的新鲜完全培养基，置5％二氧化碳，37℃，饱和湿度的培养箱中培养外周血单核细胞至第3天，往培养瓶中补充20ml含10％胎牛血清、rhGM-CSF 50ng/ml、rhIL-4 10ng/ml的新鲜培养基，继续培养至第6天。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤(f)将获得的致敏的树突状细胞保存于体外保存液中，所述保存液的配方如下42.5％的RPMI-1640培养基，7.5％的DMSO，50％的浓度为20％人血浆白蛋白，按保存液的总体积计。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，肿瘤抗原与树突状细胞的混合比例为1微克抗原1×108个细胞至100微克抗原105个细胞。
9.如权利要求5所述的方法，所述的肿瘤细胞是选自下组癌症的肿瘤细胞结肠癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、鼻咽癌、脑胶质瘤。
10.一种药物组合物或免疫组合物，其特征在于，它含有药学上可接受的载体载体，以及权利要求4所述的肿瘤抗原或用所述肿瘤抗原致敏的树突状细胞。
全文摘要
本发明提供了一种新的人树突状细胞的致敏方法及制备保存工艺及其在抗肿瘤免疫中的应用，将这种新的树突状细胞的致敏方法及制备保存工艺用于临床，具有致敏效率高，所需抗原量少，细胞保存时间长，冻存后复苏率高，适用于临床应用等优点，尤其适用于结肠癌等癌症的治疗。
文档编号A61K45/00GK1475498SQ02136518
公开日2004年2月18日 申请日期2002年8月16日 优先权日2002年8月16日
发明者王建莉 申请人:上海海欣生物技术有限公司