专利名称：薯蓣皂苷元的抗肿瘤新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及薯蓣皂苷元的新制药用途，具体说是薯蓣皂苷元在制备抗肿瘤药物中的新制药用途。
背景技术：
薯蓣皂苷元是一种从薯蓣属植物中提取的一种皂甙元，当前国外合成皮质激素药物所用的起始原料，有60％是薯蓣皂甙元，薯蓣的年产量为600-800吨，其中墨西哥年产量200-500吨。除了多种薯蓣当中含有薯蓣皂甙元之外，国内经普查，发现了穿龙、盾叶、黄山药等植物含薯蓣皂甙元量较多。对于薯蓣皂甙元的提取，工业上国内外均采用将薯蓣皂甙块茎干粉直接酸水解、溶剂汽油等有机溶剂提取薯蓣皂甙元的工艺方法。对于薯蓣皂甙元在临床上的应用，文献报道较少，有报道将薯蓣皂甙元用于制备护肤液，以薯蓣皂甙元、冰片、水杨酸、氯霉素、甘油、乙醇组成配方，主要用于治疗痤疮、质溢性皮炎和花斑癣等皮肤病，至今未见有文献报道将薯蓣皂甙元制备成抗肿瘤的药物。
发明内容
本发明的目的之一是提供了薯蓣皂苷元的药物制剂；本发明的目的之二是提供了薯蓣皂苷元的抗肿瘤新用途。
本发明的药物制剂含有1％-99％的薯蓣皂苷元和99％-1％的赋形剂(包括其它配用的药物)，优选含有30％-80％的薯蓣皂苷元和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的薯蓣皂苷元和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
按药剂学方法，可以将本发明的薯蓣皂苷制备成多种临床药物剂型作为抗肿瘤药物，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所说的非肠道给剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。
本发明的抗肿瘤药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。本发明抗肿瘤药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的薯蓣皂苷元为一定的药物原料，再配伍其它已允许合用的中药或化学药品。
本发明的薯蓣皂苷元药物制剂具有抗肿瘤作用，是通过以下的实验例得到证实的。
实验例1薯蓣皂苷元的体外抗肿瘤作用样品薯蓣皂苷元diosgenin细胞培养L929，HeLa细胞株来自(American Tissue Culture Collection，ATCC，USA)，用RPMI 1640(Gibco)培养液，加入10％的胎牛血清，1％的抗生牛素(10,000U/ml青霉素和10,00μg/ml链霉素)，2mM谷氨酰胺，置于4％的孵箱中培养。
体外细胞毒实验取处于对数生长期的细胞，贴壁细胞(L929，HeLa)经胰蛋白酶消化后分别接种于96孔培养板(1×10个/ml)，待细胞完全贴壁后。分别加入以RPMI1640培养液配制的各浓度样品，每种样品3个复孔，同时设0对照和阴性对照，继续培养48h。用MTT法于595nm进行比色测定，其平均值为细胞存活光密度，将所得的结果与对照组进行比较，计算各条件下细胞死亡率(如下表所示)。
表1.不同浓度的薯蓣皂苷元诱导的肿瘤细胞死亡率(％)药物浓度肿瘤细胞死亡率(％)μg/mlL929 HeLa1 0 05 7.512.310 15.0 20.520 25.8 37.350 45.2 50.5100 82.4 98.5
细胞凋亡的形态学研究方法在显微镜下观察细胞形态。与未经处理的酬性细胞对照比较，实验组细胞(薯蓣皂苷元给药组)具有典型的凋亡形态学改变，细胞体积缩小，变圆、固缩，有的晚期已形成凋亡小体。
利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA LadderDNA片段抽提及DNA凝胶电泳(1)实验方法收集HeLa细胞(约2×106个)，转移至离心筒内，离心后，PBS洗涤，加入细胞裂解缓冲液(5mM Tris，20mMEDTA，0.5％TritonX-100)37℃30min，然后于16,000rpm，4℃离心20min，吸取上清夜(含DNA片段)分别与RnaseA及蛋白酶K于37℃共培养1h，加入20μl NaCl(5M)，120μl异丙醇，置于-20℃放置过夜，再次子16,000rpm，4℃离心15min，除去上清，重复离心一次。完全除去上清，加入20 TE(Tris-EDTA)缓冲液，溶解DNA片段，在100V的电压厂，用2％的琼脂糖凝胶，在TBE(Tris-borate-EDTA)缓冲液中电泳30min，以BPB作指示剂，同时加入100bp的DNALadder分子量标准作为参照，用0.5g/mlEB{ethidium bromide)染色15min，脱色后在UV透射镜下观察。
(2)结论琼脂糖凝胶电泳方法是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，细胞凋亡时的突出的生物化学改变是染色质DNA的有控裂解，随着核酸内切酶的活化，DNA降解成寡聚核小体，细胞核DNA裂解片段均为180-200个碱基对整倍数的寡聚核甘酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱。经薯蓣皂苷元处理48h后，HeLa细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后，于琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙啶(EB)染色，可见典型的梯状条带(Ladder)，而在阴性细胞中，其核是完整的，不会产生低分子量的DNA。
结论在离体条件下，薯蓣皂苷元为浓度为20-100μg/ml时，其对L929和HeLa细胞有明显的抑制作用。DNA凝胶电泳试验证明，经薯蓣皂苷元处理48小时后，HeLa细胞悬浮液经裂解消化后，按常规方法提取DNA后，于琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，可见典型的梯状条带(Ladder)，即薯蓣皂苷元可引起HeLa细胞调亡。
实验例2薯蓣皂苷元整体抗肿瘤作用实验目的观察薯蓣皂苷元(Diosgenin，Dio)的整体抗肿瘤作用。
方法观察所示药物对4种小鼠移植性肿瘤[肉瘤-180(S-180)、肝瘤腹水型(HepA)、小鼠宫颈癌-14(U14)艾氏腹水癌(EAC)]腋部皮正接中，于接种10日内每天给药1次，计算各给药组瘤肿抑制率。结果(1)Dio 200、100和50mg.kg-1ig对S180具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为50.6％、42.9％和35.9％；Dio 10050和25mg.kg-1ip对S180均具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为51.3％、46.8％和34.6％(2)Dio 200和100mg.kg-1ig对HepA具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为41.6％和30.4％；当其ip剂量为100和50mg.kg-1时对HepA也具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为41.0％和37.3％；(3)Dio 200、100和50mg.kg-1ig，对U14也具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为44.6％、34.7％和28.3％；Dio100和50mg.kg-1ip对U14具有明显的抑制作用，抑瘤率分别为45.％和30.4％；(4)无论是灌胃，还是腹腔注射对EAC都没有抑制作用(P＞0.05).结论薯蓣皂苷元具有明显的抗肿瘤作用。
动物 4种肿瘤腹水传代小鼠，均购自吉林省肿瘤研究所；昆明小鼠，体重18-22g购自中国人民解放军农牧大学实验动物中心(动物合格证号10-5112)。
药品 薯蓣皂苷元由吉林天药科技有限公司制剂室提供。注射环磷酰胺，规格200mg/支，批号980101，上海华联制药有限公司产品。
方法 实验小鼠随机分为对照(ig蒸馏水20ml.kg-1)、环磷酰胺(ip20mg.kg-1)、Dio(ig 200ml.kg-1、100ml.kg-1和50ml.kg-1)和Doi(ip100ml.kg-1、50ml.kg-1和25ml.kg-18组。选取移植肿瘤7天，肿瘤生长良好，腹部澎隆明显的小鼠，腹部皮肤消毒，用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水放入无菌烧杯中以生理盐水稀释成1∶3的癌细胞混悬液，于每只实验小鼠右腋下接种0.2ml[1]。各组动物于接种肿瘤次日开始给药，每日1次，连续给药10天。给药结束次日，将动物称体重后脱臼处死，剥离出皮下肿块称重，比较各组肿瘤生长情况，统计学处理方法采用组间“t”检验。
结果各组动物体重、肿瘤重量及抑瘤率统计结果见表2。
表2 Dio对小鼠(S180)瘤重的影响(X±S)剂量 动物数 动物体重(g) 瘤重 抑瘤率组别mg.kg-1(n)给药前 给药后 (g)(％)对照组 - 1018.5±1.51 24.3±3.06 1.56±0.70环磷酰胺 20 1019.0±1.56 22.5±2.07 0.70±0.25** 55.1Dio(ig)2001018.7±1.95 23.3±1.83 0.77±0.29** 50.6Dio(ig)1001018.4±1.78 22.2±2.57 0.89±0.34* 42.9Dio(ig)50 1018.7±1.95 23.7±3.40 1.00±0.37* 35.9Dio(ip)1001019.1±1.91 23.2±1.93 0.76±0.24** 51.3Dio(ip)50 1018.9±1.97 24.9±3.14 0.83±0.32** 46.8Dio(ip)25 1018.9±1.91 22.9±3.96 1.02±0.30* 34.6注与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01表3 Dio对小鼠(HepA)瘤重的影响(X±S)剂量 动物数动物体重(g) 瘤重 抑瘤率组别mg.kg-1(n) 给药前 给药后 (g) (％)对照组 - 9 18.0±1.41 26.3±2.961.61±0.38环磷酰胺 20 9 18.2±1.72 21.4±3.360.41±0.15*** 74.5Dio(ig)2001018.0±1.89 27.1±2.850.94±0.34*** 41.6Dio(ig)1001018.0±1.33 2.69±2.181.12±0.30** 30.4Dio(ig)50 1018.1±1.20 26.8±2.251.21±0.53*24.8Dio(ip)1001018.1±1.37 24.2±1.810.95±0.37** 41.0Dio(ip)50 1018.1±1.20 26.0±3.091.01±0.43** 37.3Dio(ip)25 1018.1±1.45 24.0±3.161.17±0.64#27.3注与对照组比较，#p＞0.05；**pp＜0.01；***p＜0.01
表4 Dio对小鼠U14瘤重的影响(X±S)剂量 动物体重(g) 瘤重抑瘤率组别mg.kg-1给药前 给药后(g) (％)对照组 - 18.3±0.95 28.9±2.98(9)1.84±0.40环磷酰胺 2018.6±1.08 25.7±3.40(10) 1.21±0.34**34.2Dio(ig)200 18.5±0.85 24.7±4.92(7)1.02±0.50**44.6Dio(ig)100 18.5±0.85 26.4±3.62(8)1.20±0.32**34.7Dio(ig)5018.5±0.85 26.2±3.90(9)1.32±0.61* 28.3Dio(ip)100 18.4±0.84 26.1±3.04(10) 1.00±0.54**45.7Dio(ip)5018.4±0.84 24.0±3.80(10) 1.28±0.21**30.4Dio(ip)2518.4±0.84 26.1±3.14(10) 1.44±0.84# 21.7注与对照组比较，#p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.01表5 Dio对小鼠艾氏腹水瘤重(X±S)剂量 动物体重(g)瘤重 抑瘤率组别mg.kg-1给药前 给药后(g)(％)对照组 - 20.4±0.9730.3±2.71(10)1.91±1.10环磷酰胺 20 20.4±0.9726.6±3.89(10)1.45±0.52#24.1Dio(ig)20020.5±0.8527.8±3.53(9) 1.46±0.32#23.6Dio(ig)10020.4±0.972.69±3.99(10)1.70±0.54#11.0Dio(ig)50 20.5±0.8529.0±2.18(9) 1.50±0.68#21.5Dio(ip)10020.4±0.97228.2±1.86(9)1.78±0.80#6.8Dio(ip)50 20.4±0.9727.1±2.56(10)2.07±0.85#-8.4Dio(ip)25 20.4±0.9730.5±4.72(10)2.27±1.05#37.3注与照组比较，#p＞0.05；*p＜0.05；实验例3薯蓣皂苷元对移植人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响1.1 动物 BALB/C-nu品系裸鼠，SPF级，体重16～20g，雌雄兼用。分别购自中国医科大学实验动物部(动物合格证号辽实动字第035号)和中国医学科学院肿瘤研究所实验动物部(动物合格证号SCXKLL-00-0005)。
1.2 肿瘤细胞 人胃癌MGC-803肿瘤细胞株，由吉林省肿瘤医院提供。
1.3 药品 薯蓣皂苷元，白色粉沫，纯度为95.69％以上，批号000126，本单位制剂室提供；注射用环磷酰胺，规格200mg/支，批号20010915，上海华联制药有限公司产品。
1.4 仪器 赫利氏(Heraeus)HERA D-63450型二氧化碳培养箱，德国产品；SB-JB-1B型超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；AB204-N型单量程十万分之一电子天秤，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。
2.方法 整个实验操作过程及裸鼠饲养均在无特异性病源体(Specific Pathogen-Free；SPF)条件下的超净层流架中进行。鼠笼，饲料，饮用水，垫料，实验药品，实验器材均经高压灭菌(121℃，40min)后使用。将人工体外传代培养的人胃癌MGC-803肿瘤细胞，先给5只裸鼠，每只左侧腋部皮下接种0.2mL瘤细胞悬液(肿瘤细胞数为1.1×107个)。接种后，按常规观察饲养。20天后，待接种的肿块长至1g左右时，将动物处死，剥出肿块，剔除纤维包膜，选取生长良好，呈粉白色、鱼肉状的瘤组织，置于平皿中。用手术刀切成1mm3)左右的小块(重量约40mg)，再加入适量生理盐水，做为人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠模型动物接种瘤肿的来源。将切好的瘤块用18#穿刺针管前端，给每只接受实验观察裸鼠的左侧腋部皮下植入1块。次日，将接种后的裸鼠随机分为对照(ig蒸馏水10ml/kg，每日1次)；环磷酰胺(ig25mg/kg，隔日1次)；薯蓣皂苷元(ig400mg/kg、200mg/kg和100mg/kg，每日1次)5组。并同时开始给药。给药周期为6周。给药结束次日，将动物重后脱臼处死，剥离出皮下肿块称重，比较各组肿瘤重量。并求出肿瘤抑制百分率。为保证实验结果的可靠性，本实验重复3批次。
3.结果各组动物体重、肿瘤重量、抑瘤率及肿块大小分别见表6～表9。
表6、薯蓣皂苷元对人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响(第一批 x±s)组别 给药量 动物体重(g) 瘤块重量 抑瘤率mg/kg给药前 给药后 (g) (％)对照- 22.0±1.4129.2±1.471.22±0.27环磷酰胺 25 21.8±1.4729.3±2.060.28±0.18***77.1薯蓣皂苷元40021.5±1.6428.7±2.580.45±0.22***63.1薯蓣皂苷元20021.5±1.8729.0±2.900.57±0.15***53.3薯蓣皂苷元10021.8±0.7529.5±2.340.66±0.24** 45.9注与对照组比较，**p＜0.01；***p＜0.001。每组6只动物，均为雄性。
表7、薯蓣皂苷元对人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响(第二批 x±s)组别 给药量 动物体重(g) 瘤块重量 抑瘤率mg/kg 给药前给药后 (g) (％)对照 - 20.8±0.9826.8±1.601.25±0.27环磷酰胺25 19.3±1.6324.8±1.940.31±0.18***75.2薯蓣皂苷元 40020.7±1.2128.0±1.670.49±0.30***60.8薯蓣皂苷元 20021.2±1.6026.5±3.020.63±0.29** 49.6薯蓣皂苷元 10020.5±1.6428.2±1.940.74±0.40* 40.8注与对照组比较，*p＜0.05；*p＜0.01；***p＜0.001。每组6只动物，均为雄性。
表8、薯蓣皂苷元对人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响(第三批 x±s)组别 给药量 动物体重(g) 瘤块重量 抑瘤率mg/kg 给药前给药后 (g) (％)对照 - 21.9±2.5928.1±1.071.67±0.34环磷酰胺 25 20.9±2.3624.5±3.850.36±0.26*** 78.4薯蓣皂苷元40022.3±1.3726.5±1.220.52±0.15*** 68.9薯蓣皂苷元20022.7±1.7527.6±1.860.68±0.27*** 59.3薯蓣皂苷元10021.1±3.4327.5±2.590.89±0.37** 46.7注与对照组比较，**p＜0.01；***p＜0.001。每组6只动物，均为雄性。
表9、薯蓣皂苷元对人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响(三批合计 x±s)组别 给药量 动物体重(g)瘤块重量 抑瘤率mg/kg 给药前给药后 (g) (％)对照 - 21.6±1.8828.0±1.73 1.38±0.35环磷酰胺 25 20.8±2.1026.1±3.53 0.32±0.21***76.8薯蓣皂苷元40021.5±1.5127.7±2.02 0.49±0.22***64.5薯蓣皂苷元20021.8±1.7727.5±2.94 0.61±0.24** 55.8薯蓣皂苷元10021.2±2.1828.3±2.40 0.76±0.34* 44.9注与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
每组合计18只动物，雌雄兼用。
4.结论综合上述重复三批实验结果无论是每批实验结果单独进行统计，还是将三批实验结果进行总合统计，薯蓣皂苷元400、200和100mg/kgig对移植人胃癌(MGC-803)荷瘤裸鼠肿瘤生长均具有明显的抑制作用。并呈现出较好的量效关系，平均抑瘤率可达44.47～64.27％。其抑瘤率虽不及环磷酰胺，但却不像环磷酰胺那样使动物出现状态不佳，消瘦和体重明显减轻等毒副作用。
实验例4薯蓣皂苷元对移植肝癌腹水(HepA)小鼠存活时间的影响材料与方法动物 昆明小鼠，雌性，体重18～20g，购自吉林大学实验动物部，物合格证号10-1023。肝癌(HepA)腹水传代小鼠，购自吉林省肿瘤研究所。
药品 薯蓣皂苷元，规格纯度为98％以上，批号20000512。本单位制剂室提供；注射用环磷酰胺，规格200mg/支，批号20010915，上海华联制药有限公司产品。
仪器 SB-JB-1B型超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；AB204-N型单量程十万分之一电子天秤，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。
方法[1、2]实验小鼠随机分为对照ig蒸馏水20ml/kg，每日1次]、环磷酰胺(ig 50mg/kg，隔日1次)、薯蓣皂苷元(ig 200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg，每日1次)5组。选取移植HepA肿瘤细胞株7天左右，肿瘤生长良好，腹部膨隆明显的小鼠。在超净工作台内，将小鼠腹部皮肤消毒，用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入无菌烧杯中以生理盐水稀释成1∶4的癌细胞混悬液，在显微镜下观察，肿瘤细胞数为1.2×107/ml。给每只小鼠腹腔接种0.2ml。各组动物于接种肿瘤次日随机分组并开始给药。记录动物自腹腔接种肿瘤起所能存活的天数。并计算给药组相对于对照组的生命延长率。为保证结果的准确性，试验共重复3批。
结果实验期间各组动物平均生存天数及生命延长率分别见表10～表12。
表10、薯蓣皂苷元对腹腔移植肝癌腹水(HepA)小鼠存活时间的影响(第一批x±s)组别给药量动物数存时间 生命延长率(mg/kg) (只) (天) (％)阳性对照- 1011.0±3.0环磷酰胺501027.7±7.6***151.8薯蓣皂元200 1020.3±4.2***84.5薯蓣皂元100 1018.0±4.1***63.6薯蓣皂元501016.3±3.3**50.0注与对照组比较，**p＜0.01；***p＜0.001表11、薯蓣皂苷元对腹腔移植肝癌腹水(HepA)小鼠存活时间的影响(第二批 x±s)组别给药量 动物数 存时间生命延长率(mg/kg)(只) (天)(％)阳性对照-1017.3±4.1环磷酰胺50 1028.2±6.5***63.0薯蓣皂元200 1026.5±3.9***53.2薯蓣皂元100 1023.3±2.2***34.7薯蓣皂元50 1019.2±4.1#9.8注与对照组比较，**p＜0.001；*p＜0.05
表12、薯蓣皂苷元对腹腔移植肝癌腹水(HepA)小鼠存活时间的影响(第三批 x±s)组别给药量 动物数 存时间生命延长率(mg/kg) (只) (天) (％)阳性对照- 109.6±2.2环磷酰胺50 1020.2±4.4***110.4薯蓣皂元2001029.5±10.6***207.3薯蓣皂元100109.9±4.5#3.1薯蓣皂元50 108.8±1.4#-8.3注与对照组比较，***p＜0.001；*p＞0.05结论经重复三批实验结果表明薯蓣皂苷元200mg/kg ig给药，可使腹腔接种肝癌腹水(HepaA)小鼠的存活时间比对照组明显延长，三批实验统计结果均为p＜0.001；平均生命延长率为115％。薯蓣皂苷元100mg/kg，ig给药组，三批实验结果中，经统计有二批动物存活时间比对照组明显延长，分别为P＜0.001；P＜0.001和P＞0.05。平均生命延长率为33.8％。薯蓣皂苷50mg/kgig给药组，三批实验结果中，经统计有一批实验中动物存活时间比对照组明显延长，分别为P＜0.01；P＞0.05和P＞0,05。平均生命延长率为17.2％。上述实验结果表明，薯蓣皂苷元可明显延长腹腔接种肝癌腹水(HepA)小鼠的存活时间。特别是高剂量(200mg/kg)和中剂量(100mg/kg)给药组效果更加确切。
实验例5薯蓣皂苷元对移植Walker癌肉瘤256荷瘤大鼠肿瘤重量的影响材料与方法动物 Wistar大鼠，雌雄各半，体重105-125g，购自沈阳市实验动物研究所，动物合格证号瘤种 大鼠Walker癌肉瘤256(W256)腹水传代大鼠，购自中国医学科学院药物研究所。
药品 薯蓣皂苷元，纯度为95.69％，批号000126。本单位制剂室提供；注射用环磷酰胺，规格200mg/支，批号010711，上海华联制药有限公司产品。
仪器 SB-JB-1B型超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；AB204-N型单量程十万分之一电子天秤，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。
方法 选取腹部传代8天，腹部膨隆明显的大鼠，在超净工作台中，腹部皮肤消毒，用一次性无菌采血器经腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入无菌烧杯中，以生理盐水稀释成1∶3的癌细胞混悬液，给每只实验大鼠左腋部皮下接种0.2ml，肿瘤细胞数为1×107。于接种次日，将实验大鼠随机分为对照(ig蒸馏水10ml/kg，每日1次)；环磷酰胺(ig 25mg/kg，隔日1次)；薯蓣皂苷元(ig 100mg/kg、50mg/kg和25mg/kg)5组。同时开始给药，连续给药14天。给药结束次日，将动物称重后脱臼处死，剥离出皮下肿块称重，比较各组间肿瘤重量的差异性。并计算出肿瘤抑制百分率。所列数据以均数加减标准差(x±s)表示，统计学处理方法采用组间t-检验。为保证结果的可靠性，本实验重复2次。
表13、薯蓣皂元对W256荷瘤大鼠肿瘤重量的影响(第一批 x±s)剂量 动物动物体重(g) 肿瘤重量 抑瘤率组别mg/kg (只) 给药前 给药后 (g)(％)阴性对照- 10 93.2±7.9 123.4±13.6 1.70±0.44环磷酰胺2510 93.8±9.5 104.2±9.6 0.56±0.21*** 67.1薯蓣皂苷元 100 10 93.3±10.2 124.0±9.4 0.75±0.20*** 55.9薯蓣皂苷元 5010 94.6±7.3 114.5±9.0 1.04±0.21*** 38.8薯蓣皂苷元 2510 94.8±6.7 124.2±10.8 1.22±0.22** 28.2注与对照组比较，**p＜0.01；***p＜0.001表14、薯蓣皂元对W256荷瘤大鼠肿瘤重量的影响(第一批 x±s)剂量 动物 动物体重(g) 肿瘤重量 抑瘤率组别mg/kg (只) 给药前 给药后 (g) (％)阴性对照- 10118.1±6.4 165.5±15.2 3.02±1.13环磷酰胺2510117.6±6.5 149.6±20.2 0.81±0.34*** 73.2薯蓣皂苷元 100 10117.3±6.4 151.5±12.9 1.01±0.35*** 66.6薯蓣皂苷元 5010116.3±10.1 162.8±15.1 1.21±0.37*** 59.9薯蓣皂苷元 2510115.7±6.7 169.8±15.5 1.24±0.29** 58.9
注与对照组比较，***p＜0.001结论本实验室整体实验结果表明狄奥宁片(薯蓣皂苷元)100、50和25mg.kg-1ig对移植W256大鼠肿瘤增重具有明显的抑制作用。抑瘤率可达28.2～55.9％(第一批)和58.9～66.6％(第二批)。重复2次，基本获得同样的实验结果。其抑瘤虽不及环磷酰胺，但却不象环磷酰胺那样使动物出现状态不佳，消瘦和体重明显减轻等毒副作用。
实验例6薯蓣皂苷元抑制人胃癌(MGc-803)和人黑色素瘤(A375-S2)肿瘤细胞生长的初步作用机制研究目的利用流式细胞仪观察薯蓣皂苷元(Dio)对人胃癌细胞(MGC-803)和人黑色素瘤细胞(A375-S2)细胞周期及细胞凋亡的影响，探讨Dio抑制肿瘤细胞生长的作用机制。
1 材料1.1 细胞 实验所用人胃癌细胞(MGC-803)和人黑色素瘤细胞(A375-S2)由吉林省肿瘤研究所提供。
1.2 样品 薯蓣皂苷元(Diosgenin，Dio)，白色粉末，纯度95％，由本单位制剂室提供。
1.3 试剂及耗材DNAREAGENDKIT为美国B.D公司产品；细胞培养皿购自美国CORNING公司。
1.4 仪器 流式细胞仪(FACSCalibur B.D公司 美国)，台式离心机(LD5-2A，北京)2 方法细胞单层接种在60mm×15mm的培养皿中，细胞数为1×106个，培养24小时后加药，MGC-803(人胃癌细胞)加入Dio的浓度为0、30和60μg/mL，A375-S2(人黑色素瘤细胞)加入Dio的浓度为0、15μg/mL，分别培养12，24，36小时后，收集贴壁及已悬浮的细胞，1500r·min-1离心5min，PBS洗一次，70％冰乙醇-20℃固定18小时，PBS洗二次，DNAREAGENDKIT进行染色，用流式细胞仪测细胞周期变化及对细胞凋亡的影响。
3 结果
3.1 Dio对MGC-803细胞周期及凋亡的影响结果 Dio浓度在0g/mL时，随着作用时间由12h-24h-36h延长对MGC-803细胞周期(Go/G1，S，G2/M)及凋亡(Apoptosis)均没有明显影响；当Dio浓度增加到30或60pg/mL时，随着作用时间的延长细胞周期的变化仍不明显，但凋亡碎片逐渐增加(30μg/mL时由0.94％增加到10.60％和16.95％，60μg/mL时由5.56％增加到15.26％和18.74％)。同样，Dio与细胞作用时间在12小时，随着Dio浓度由0增加到30和60L1g/mL，细胞周期没有变化，凋亡碎片有增加的趋势；而作用时间增加到24和36小时，凋亡的DNA碎片增加愈加明显，而细胞在各个周期的变化仍不显著。上述实验结果表明，Dio不能使MGC-803细胞周期阻断在某一特定时期，所以Dio抑制MGC-803细胞生长与细胞周期阻断无关。但是随着Dio浓度的增加和作用时间的延长，细胞凋亡的DNA碎片呈规律性的增加，表明Dio可能诱导MGC-803细胞凋亡，通过诱导凋亡抑制肿瘤细胞生长。
3.2Dio对A375-S2细胞周期及凋亡的影响结果 在A375-S2细胞中加入151ug/mL Dio，随着作用时间的延长，凋亡细胞的DNA碎片由2.39％增加到30.50％和41.93％，对细胞周期的影响不明显。表明Dio可能通过诱导A375-S2细胞凋亡抑制肿瘤细胞的生长。
4结论用流式细胞仪对Dio抑制肿瘤细胞生长的初步作用机制研究表明，Dio不能使MGC-803和A375-S2细胞周期阻断在某一特定时期，但能诱导肿瘤细胞凋亡。结论Dio抑制细胞生长与细胞周期阻断无关，可能通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞生长。
实验例7薯蓣皂苷元10种人类肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用试验观察目的观察薯蓣皂苷元离体对10种有代表性的人体肿瘤细胞株生长的抑制作用，通过测定IC50比较其对不同肿瘤细胞生长抑制作用强弱。
1 材料1.1 细胞 实验所用10种细胞株MCF-7(人乳腺癌细胞)，NCI-H446(人小细胞肺癌)，MGC-803(人胃癌细胞)，Swillc(人结肠癌细胞)，U251(人星形胶质瘤细胞)，SGL-7901(人胃癌细胞)，K562(人红白血病细胞)，A375-S2(人黑色素瘤细胞)，Hela(人宫颈癌细胞)，BEL-7402(人肝癌细胞)均购自吉林省肿瘤研究所。
1.2试剂及耗材 薯蓣皂苷元(Diosgenin，Dio，白色粉末，纯度590％)由本单位制剂室提供；青霉素G钾盐为华北制药股份有限公司产品(批号111413)；硫酸链霉素由大连美罗大药厂生产(批号0010604)；HEPES、MTT为SIGMA公司产品；谷氨酰胺购自GIBCO公司；RPMI-1640培养基为HyClone公司产品；胎牛血清(批号011222)北京元亨圣马生物技术研究所产品；5-氟脲嘧啶(5-FU，批号010114)上海旭东海普药业有限公司；二甲基亚砜(DMSO，批号0-718A01)AMRESCO分装；96孔培养板购自NUNCTM公司；1.3仪器二氧化碳培养箱(HERA D-63450德国)、倒置显微(OLYMPUS CK2日本)、台式离心机(LDs-2A北京)、酶标仪(TECANA-5082澳大利亚)、震荡器(210-A深圳)。
2方法2.1 肿瘤细胞培养细胞接种在含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100IU/mL青霉素G钾盐及100μg/mL硫酸链霉素的RPMI-1640培养液中，置于温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养，传3代后备用。
2.2MTT法测定细胞生长 将对数生长期细胞消化，1000r.min-1离心30min，记数，以1×105个/mL密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24小时后，加入浓度分别为0、1.875、3.75、7.5、15、30、60μg/mL的Dio(溶解在0.033％DMSO中)，同时设溶剂对照组(0.033％DMSO)；阳性药为5-氟脲嘧啶，以同样浓度加入96孔板中。共同培养44小时后，每孔加入20.tLMTT(5mg/mL)，再培养4小时，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10分钟，应用酶标仪于492nm处测吸光值。
1.3抑制率的计算和IC50的统计溶剂对照A-样品A溶剂对照二细胞+培养液+0.033％DMSO
样品二细胞+培养液+Dio(5-FU)+0.033％DMSO1Cso统计方法采用最小二乘法求回归方程，根据回归方程求IC503结果3.1 Dio和5-FU对人低分化胃腺癌细胞株(MGC-803)作用的时-效关系按照前述方法，首先观察Dio在24、48、72小时和5-FU在24、48、72、96小时对MGC-803细胞株生长的抑制作用，结果，我们选择48小时为Dio抑制肿瘤细胞生长的作用时间。原因1.作用48小时基本反映出Dio对肿瘤细胞的作用强度；2.培养时间加长，在大批实验时易于染菌；3.5-FU在本实验作为阳性对照药，其目的不是比较与Dio抑制肿瘤细胞生长作用的强弱(一个化学合成药物与一个天然化合物药物之间无可比性)，而是验证方法的可靠性。所以，尽管48小时不是5-FU最佳作用时间(5-FU的最佳反应时间是72或96小时)，但本实验仍选择了48小时。
3.2 Dio离体对10种人体肿瘤细胞的抑制作用实验结果见表15，Dio对10种人体肿瘤细胞抑制的作用强度依次为A375-S2＞MCF-7＞Hela＞MGC-803＞SGL-7901＞BEL-7402＞NCi-H446＞K562SMMC-7721＞Swillc＞U251。Dio对人黑色素瘤细胞(A375-S2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人低分化胃腺癌细胞(MGC-803)和人胃癌细胞(SGL-7901)作用最强，其IC50均小于20μg/mL。表中所列数据仅为5-FU作用48小时对10种人体肿瘤细胞抑制作用的IC50值。
表15、薯蓣皂苷元(Dio)对10种人肿瘤细胞株生长的抑制作用IC50μg肿瘤细胞株种类5-FU IC50A375-S214.97±0.457.69±0.05MCF-7 30.60±2.5314.52±0.14Hela39.82±1.2415.24±0.08MGC-803 25.94±1.2615.59±0.20SGL-790147.68±3.6818.24±0.10BEL-740229.54±0.5721.29±0.29NCL-H4464.86±0.80 25.80±8.86K56232.09±0.7926.70±0.47Swillc 61.01±3.1931.12±5.02U25157.04±4.4333.01±5.42
注表中为三次实验结果的x±s4、结论薯芭皂苷元在体外能明显抑制人黑色素瘤细胞(A375-S2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人低分化胃腺癌细胞(MGC-803)和人胃癌细胞(SGL-7901)生长，其IC50均小于20μg/mL。
实验例8薯蓣皂苷元对3H-TdR掺入人胃癌(1V1GC-803)细胞DNA合成的影响目的观察薯蓣皂苷元(Dio)对核酸前体3H-TdR掺入人胃癌细胞DNA的影响。
1 材料1.1细胞 MGC-803(人胃癌细胞)细胞株由吉林省肿瘤研究所提供。
1.2样品 薯蓣皂苷元(Diosgenin，Dio)为白色粉末，纯度＞90％，由本单位制剂室提供1.3试剂3H-TdR购自中国科学院上海原子核研究所。
1.4仪器 液体闪烁记数仪(WALLAC 1400 DSA，美国)，隔水式电热恒温培养箱(WMK-02型，湖北)2方法将对数生长期细胞消化，离心，记数，以1×105个/mL密度接种于96孔培养板中，每孔100uL，培养24小时后，加入浓度分别为0，1.875，3.75，7.5，15，30lug/mL的Dio，同时设溶剂对照(0.033％DMSO)，培养40小时后，每孔加入3H-TdR logL(37kBq/孔)，培养8小时后，小心吸弃上清，PBS洗三次，5％三氯醋酸洗二次，乙醇乙醚(3∶1)洗一次，每孔加入100L0.5M氢氧化钠过夜，每孔加入10 L6M盐酸中和，将液体移入滤纸条中，60℃干燥5小时，加入3mL闪烁液，30分钟后用液体闪烁记数仪测CPM值。
3结果Dio在较低浓度3.75和7.5[tg/mL对3H-TdR掺入MGC-803细胞DNA有明显的抑制作用。当Dio浓度增加到15和30iLtg/mL时，3H-TdR的掺入显著被抑制，掺入量(CPM)只有对照组的1/12和1/39。我们认为，较低浓度的Dio抑制3H-TdR掺入胃癌细胞株DNA与抑制胃癌细胞增殖有较密切的关系但当Dio浓度增至15和30g/mL时，大量细胞已经死亡，3H-TdR不可能掺入到死亡细胞DNA，所以，3H-TdR掺入DNA的量已经不能反映Dio对MGC-803细胞生长的抑制作用(表16)。
表16.Dioc对3H-TdR掺入MGC-803细胞DNA合成的影响n＝4孔Dio/g/mL3H-TdR掺入/CP，M0 64534±18711.857 64577±22053.75 55463±3488**7.5 33919±3137***155194±966***301631±250***与溶剂对照组比较，**p＜0.01， ***P＜0.0014结论 Dio抑制胃癌细胞增殖与阻断DNA合成有一定关系。
下述实施例均能实现上述实验例的效果及本发明目的。
实施例1胶囊的制备薯蓣皂甙元 250克 淀粉 2500克，将淀粉先进行干燥，过120目筛，然后与薯蓣皂甙元混合均匀，过两次120目筛，充分混匀，共制成1000粒胶囊，每粒内含薯蓣皂甙元250毫克。口服，每日2-3次，每次1-2粒。
实施例2滴丸的制备称取300g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，加入薯蓣皂苷元原料100g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中(温度±4℃)，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得薯蓣皂苷元滴丸1000粒。口服，一次2-3粒，一日三次，饭后服用。
实施例3微囊片的制备分别称取硬脂酸15g和21mL作为复方囊材，称取薯蓣皂苷元100g作为囊心物，以压缩空气通过喷雾冻结法成囊，囊径为8-100um。然后将微囊与微晶纤维素混匀，加10％乙基纤维素醇溶液混合制成囊材，通过18目尼龙筛制成颗粒，于35℃以下烘干，再放置干燥器内24小时，加1％-2％硬脂酸镁压片，得薯蓣皂苷元微囊片，片重为0.3g，口服，一次1-2片，一日二次。
实施例4胶囊剂的制备薯蓣皂苷元原料1000g，药用淀粉1000g，混合均匀，装入0#胶囊，每粒0.35g，每次口服1-2粒，每日两次。
实施例5片剂的制备薯蓣皂苷元原料1000g，药用淀粉500g，混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.25g，口服，每次1-2片，每日两次。
实施例6颗粒剂的制备薯蓣皂苷元原料100g，淀粉1000g，糖粉400g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。口服，一次5g，一日两次。
实施例7注射剂的制备薯蓣皂苷元原料10g，丙二醇20ml，聚乙二醇-400 50ml，注射用水300ml，混合，水浴加热30分钟，加苯甲醇50ml，再用注射用水加至1000ml，在超声波中处理10分钟，再水浴上加热30分钟，调PH值5.5-6.5，过滤澄明，灌封，灭菌即得。每支2ml，肌肉注射，一次2ml，一日1-2次。
权利要求
1.一种药物制剂，其特征在于含有有效治疗剂量的薯蓣皂苷元和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或可与薯蓣皂苷元组方的其它药物。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于含有1％-99％的薯蓣皂苷元和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。
3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于含有30％-80％的薯蓣皂苷元和70％-20％的药用赋形剂或其它可组方的药物。
4.根据权利要求3所述的药物制剂，其特征在于含有60％-70％的薯蓣皂苷元和40％-30％的药用赋形剂或其它可组方的药物。
5.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于所说的药物制剂选自于片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。
6.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于所说的药物剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的任何一种。
7.薯蓣皂苷元在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7的用途，其特征在于所说的抗肿瘤是指治疗胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、神经胶质瘤、红白血病、黑色素瘤、宫颈癌、肝癌、或早幼粒白血病。
9.根据权利要求8的用途，其特征在于所说的治疗胃癌是指阻断胃癌细胞DNA合成。
10.根据权利要求7的用途，其特征在于所说的抗肿瘤是指对肿瘤细胞的抑制，这些细胞为人乳腺癌细胞、人小细胞肺癌、人胃癌细胞、人结肠癌细胞、人神经胶质瘤细胞、人红白血病细胞、人黑色素瘤细胞、人宫颈癌细胞、人肝癌细胞、早幼粒白血病细胞、肉瘤180、肝癌腹水型、小鼠宫颈癌-14或艾氏腹水癌。
全文摘要
本发明公开了从穿龙薯蓣等植物中获得的薯蓣皂苷元在抗肿瘤方面的医药新用途。同时也公开了以薯蓣皂苷元为制药原料制备成片剂、胶囊剂、滴丸、注射剂等药物制剂。具体说的抗肿瘤是指公开了薯蓣皂苷元在治疗胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、神经胶质瘤、红白血病、黑色素瘤、宫颈癌、肝癌、或早幼粒白血病方面的作用。
文档编号A61K31/7042GK1506051SQ02155238
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日
发明者王本祥, 王丽娟, 王岩, 陈声武, 杨冬华 申请人:吉林天药科技股份有限公司