专利名称：一种新的免疫活性测定方法
技术领域：
本发明主要提供一种关于末梢血中淋巴球活动的新免疫疗法。是关于新免疫疗法中对人体免疫功能的测定方法。该新免疫疗法更能详细地对CTL活性、NK活性以及NKT活性和末梢血中的淋巴球活动的相关性进行检定。
背景技术：
用于有效预防及治疗癌症(malignant neoplasms)(cancer)的物质，人们一直重视对癌细胞的直接作用。虽然已经意识到免疫赋活剂对癌症治疗的作用，但是，作为免疫赋活剂制成的化合物其抗癌效果并不理想，即使通过单独的免疫疗法或者与化学疗法相结合实施治疗，也没有出现非常理想的治疗效果。
本发明人八木田医学博士，首先采用了划时代的治疗癌症的方法，研究了在活体内诱发白介素12(IL-12)的物质功能，发现香菇菌丝提取物具有以上功能，从而确立了新免疫疗法(Novel Immunotherapy forcancer)(NITC)的治疗方法。以前，IL-12虽然具有抗癌效果，但由于直接投于活体内时，会生成副作用，患者非常痛苦。IL-12本身不能作为抗癌剂使用。但是，在八木田提交的报告中，含香菇菌丝体提取物的制剂在癌症治疗中取得了加快痊愈、延长患者生命的效果。即，八木田通过投食能在活体内诱发IL-12有效量的香菇菌丝体提取物，达到了治疗癌症的目的(日本专利公开1996-139670号公报)。
IL-12按TNFα→IFNγ→IL-12→CTL活性的顺序，对杀伤性T细胞的活性化效果及增强效果发挥作用。即，IL-12的生成增强，就带动杀伤性T细胞的活性化及增强效果，结果是得到了想得到的抗癌功效。
八木田认为，除IL-12的生成增强的丝体外，NKT细胞活性化也有助于抗癌作用。谷口等发现NKT细胞中的Vα-24Vβ-11这种特异性T细胞抗原受体(TCT)能识别特异性糖脂抗原，即KRN7000(α-半乳糖神经酰胺)。而且，喂食KRN7000的患癌老鼠，其NKT细胞活性增强，虽然没有发现癌细胞消失，但可以证明癌细胞扩散得到抑制。
八木田的报告还提到了NKT细胞中另一种受体，即NK细胞抗原受体(NKR-P1；自然杀伤细胞受体P1)(特集NKT细胞基础和临床最新医学55卷4号2000年818～823页)。八木田还发现，NKR-P1也与NKT细胞的活性化相关，其活性化的抗癌功效更强。
有的报告认为，NK细胞与活体的抗癌功效有关。八木田证实，之前，NK细胞的活性和临床抗癌效果没有关系，IL-12的生成诱发量和NK细胞的活性具有完全相反的关系。从而对NK细胞在病人抗癌作用上的疗效生成怀疑。
发明内容
如前所述，本发明提供一种用于测定CTL活性、NKT活性、NK活性的新方法，使用该方法分析各个测定结果检定的意义，来研究CTL活性、NKT活性、NK活性在癌症治疗中的意义，从而发明一种新免疫疗法。
本发明能够提供测定CTL活性、NKT活性、NK活性的新方法，使用该方法，分析各个测定结果的检定意义，重新研究CTL活性、NKT活性及NK活性在癌症治疗中的意义，从而发明出新的免疫疗法。
即，本发明由以下部分组成1.在对末梢血中的淋巴球至少进行以下一项测定的新免疫疗法中，人体免疫功能的测定方法1)CD8(+)穿孔蛋白生成能力2)CD3(-)CD161(+)3)CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力4)CD3(+)CD161(+)5)CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力2.各个测定意义如下的前项1的测定方法
1)CD8(+)穿孔蛋白生成能力测定意味的功能是测定CTL活性，2)CD3(-)CD161(+)测定意味的功能是测定NK细胞，3)CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力的测定意味的功能是测定NK细胞的活性化，4)CD3(+)CD161(+)测定意味的功能是测定NKT细胞，5)CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定意味的功能是测定NKT细胞的活性化。
3.包括测定CD8(+)穿孔蛋白生成能力的CTL活性剂的筛选方法。
4.一种新β-1，3葡聚醣，载有通过前项3筛选方法得到的CTL活性剂力。
5.一种CTL活性剂，包括通过前项3的筛选方法得到的β-1，3葡聚醣。
6.一种NK活性剂的筛选方法，包括CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定。
7.一种新α-1，3葡聚醣，载有包括通过前项6筛选方法得到的NK活性剂。
8.一种NK活性剂，包括通过前项6的筛选方法得到的α-1，3葡聚醣。
9.一种NK细胞和NKT细胞活动情况的测定方法，其特征在于，同时测定前项1中的CD3(-)CD161(+)、CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力、CD3(+)CD161(+)、CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力。
10.一种NK活性剂或者NKT活性剂分别的筛选方法，包括基于NK细胞和NKT细胞活性呈相反关系的前项9的方法。
11.一种新α-1，3葡聚醣，载有通过前项10的筛选方法得到的NK活性剂或者NKT活性剂。
12.一种NK活性剂和NKT活性剂，包括通过前项10的筛选方法得到的α-1，3葡聚醣。
13.一种通过前项9测定方法、癌症种类和NK细胞及NKT细胞动态之间关系的检定方法。
14.前项13检定的同时，包含用于治疗前列腺癌的α-1，3葡聚醣的NK细胞活性剂。
15.前项13检定的同时，包含用于肺癌的α-1，3葡聚醣的NK细胞活性剂。
16.前项13检定的同时，包含与抗癌剂、放射线、及类固醇治疗之一合用的α-1，3葡聚醣的NK细胞活性剂或者NKT细胞的活性剂。
17.将前项1～16中记载的信息载有在利用自然法则的媒介的商业用媒介。
18.利用前项17商业媒介的商业方法。
图1表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的全部病例(103例)的图。
图2表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR病例(23例)的图。
图3表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR+LNC病例(31例)的图。
图4表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的LNC病例(10例)的图。
图5表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的SNC病例(31例)的图。
图6表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的NC病例(41例)的图。
图7表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的PD病例(10例)的图。
图8表示诱发生成IL-12和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的初诊病例(26例)的图。
图9表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的全部病例(103例)的图。
图10表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR病例(26例)的图。
图11表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR+LNC病例(36例)的图。
图12表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的LNC病例(36例)的图。
图13表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的SNC病例(36例)的图。
图14表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的NC病例(36例)的图。
图15表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的PD病例(36例)的图。
图16表示诱发生成INFγ和CD8(+)穿孔蛋白(+)关系的初诊病例(36例)的图。
图17表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的全部病例(98例)的图。
图18表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的CR病例(7例)的图。
图19表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的PR病例(6例)的图。
图20表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的CR+PR病例(13例)的图。
图21表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的LNC病例(15例)的图。
图22表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的SNC病例(13例)的图。
图23表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的NC病例(28例)的图。
图24表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的CR+PR+LNC病例(28例)的图。
图25表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的PD病例(24例)的图。
图26表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)关系的初诊病例(33例)的图。
图27表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的全部病例(98例)的图。
图28表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR病例(13例)的图。
图29表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR+LNC病例(28例)的图。
图30表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的NC病例(28例)的图。
图31表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的PD病例(24例)的图。
图32表示基于传统方法的NK细胞活性和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的初诊病例(33例)的图。
图33表示TOG投与病例CD3(-)CD161(+)的变化情况的图。分别表示全部病例(148例)、CR+PR病例(45例)、PD病例(60例)。
图34表示CD3(+)CD161(+)和CD3(-)CD161(+)关系的全部病例(98例)的图。
图35表示CD3(+)CD161(+)和CD3(-)CD161(+)关系的CR+PR病例(13例)的图。
图36表示CD3(+)CD161(+)和CD3(-)CD161(+)关系的CR+PR+LNC病例(28例)的图。
图37表示CD3(+)CD161(+)和CD3(-)CD161(+)关系的NC病例(28例)的图。
图38表示CD3(+)CD161(+)和CD3(-)CD161(+)关系的PD病例(24例)的图。
图39表示CD3(+)CD161(+)和CD3(-)CD161(+)关系的初诊病例(33例)的图。
图40表示基于传统方法的NK细胞活性测定和CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的全部病例(98例)的图。
图41表示基于传统方法的NK细胞活性测定和CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR病例(13例)的图。
图42表示基于传统方法的NK细胞活性测定和CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR+LNC病例(28例)的图。
图43表示基于传统方法的NK细胞活性测定和CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的NC病例(28例)的图。
图44表示基于传统方法的NK细胞活性测定和CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的PD病例(24例)的图。
图45表示基于传统方法的NK细胞活性测定和CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的初诊病例(33例)的图。
图46表示CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的全部病例(98例)的图。
图47表示CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR病例(13例)的图。
图48表示CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的CR+PR+LNC病例(28例)的图。
图49表示CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的NC病例(28例)的图。
图50表示CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的PD病例(24例)的图。
图51表示CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白(+)和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)关系的初诊病例(33例)的图。
图52作为抗癌剂、放射线及类固醇治疗对免疫功能的影响，表示CD3(+)CD161(+)(23例)的推移图。
图53作为抗癌剂、放射线及类固醇治疗对免疫功能的影响，表示CD3(-)CD161(+)(23例)的推移图。
图54作为抗癌剂、放射线及类固醇治疗对免疫功能的影响，表示INFγ(26例)的推移图。
图55作为抗癌剂、放射线及类固醇治疗对免疫功能的影响，表示IL-12诱发生成量(26例)的推移图。
具体实施例方式
下面，详细介绍本发明。本发明详细说明书中所使用的技术或者科学用语，除非做出特殊定义，否则都表示本发明所属领域中通常人们所理解的意思。
本发明主要是通过研讨临床结果和细胞因子之间的关系来实施。本发明人作为新免疫疗法(NITC)，通过对病情恶化的晚期癌症患者合用香菇菌丝体提取物和抑制血管新生之物质(鲨鱼软骨)，来测定IL-12、IFNγ、其它各种标记(物)。而且，在癌症痊愈或者能保持较长时间不恶化的病例中发现CD8(+)穿孔蛋白生成与IL-12、IFNγ的生成呈较强的正比例关系。结果发现CD8(+)穿孔蛋白生成测定对于CTL活性根本的价值是具有相当意义的。但是，CD8(+)细胞中包括了CTL(杀伤性T细胞)和抑制性T细胞(抑制免疫细胞)。即，细胞表示标记是CD8的细胞有以上2种。现在，还不能以细胞表面标记来对其进行分类。CD8(+)穿孔蛋白也是一样。如图1至图8所示，在癌症痊愈或者长期保证不恶化的病例(图CR+PR+及CP+PR+LNC)中，表示与Th1细胞因子的IFNγ及IL-12之间的正比关系；而在癌症病情恶化的病例及短期内不恶化的病例(图中PD及SNC)中，表示反比关系。以上事实表明CR、PR以及LNC患者中的CD8(+)穿孔蛋白细胞即是CTL。相反，在SNC及PD病例中观察到的CD8(+)穿孔蛋白细胞即是抑制性T细胞。即，Th1细胞因子发挥抗肿瘤性时，具体讲，在生成10IU/ml以上的IFNγ或者生成7.8pg/ml的IL-12的环境内的CD8(+)或者CD8(+)穿孔蛋白即是CTL；相反，在没有生成10IU/ml以上的IFNγ或者生成7.8pg/ml的IL-12的环境内的CD8(+)或者CD8(+)穿孔蛋白即是抑制性T细胞。所以，在研究CTL活性根本时，测定CD8(+)或者CD8(+)穿孔蛋白时，对IFNγ及/或者IL-12合并测定是非常重要的。
在发现上述现象后，CD8(+)穿孔蛋白生成能力的测定可适用于有用CTL活性剂的筛选方法。还发现，利用这种筛选方法能够对载有CTL活性剂力的β-1，3葡聚醣进行特别规定。本发明确认，具有β-1，3葡聚醣结构的香菇丝体组成物制剂(如，ILX、ILY(株)东西医药研究所全部注册)对CD8(+)穿孔蛋白生成能力的活性化有效，并再次确认它们对CTL活性化有效的事实。另外，具有β-1，3葡聚醣结构的化合物还有好多，如果将这种既知结构和CD8穿孔蛋白生成能力测定结合起来，同业者就能很容易地对CTL活性剂进行特定。
本发明从其与NKT细胞的关系重新确定了NK细胞的作用。为此，本发明人提供了NK细胞新的测定方法。即，CD3(-)CD161(+)的测定与已知的铬释放法得出的结果进行对比，发现正确的NK细胞测定。另外，CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定意味着NK细胞的活性化，而且，还发现这种活性化对前列腺线癌特别有效。而且，包括CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定的方法作为NK活性剂的筛选方法非常有用。再者，本发明还确认，具有α-1，3葡聚醣结构的Nigerooligo糖、褐藻多糖硫酸酯等组成物制剂对CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力的活性化有效，再次确认了它们对NK细胞活性化有效。载有筛选方法制造的NK活化能力的新α-1，3葡聚醣作为癌化疗药有用，其它具有α-1，3葡聚醣结构的化合物有很多，只要将这种已知结构和CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力的测定结合起来，业内人士就能很容易地对NK活性剂进行特殊规定。
还有，在本发明中，对CD3(-)CD161(+)、CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力、CD3(+)CD161(+)、CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力同时进行测定，发现了进行NK细胞和NKT细胞的变化情况测定方法的功能。即，本发明人利用该项测定进行分析，结果发现NK细胞和NKT细胞的活性化都在上述具有α-1，3葡聚醣结构的化合物作用下发挥功效。NK细胞和NKT细胞都具有共同的NKR-P1(CD161(+)表面标记、NKR-P1受体。CD161(+)受体在α-1，3葡聚醣的作用下活性化。对于癌症患者来说，NK细胞在1～2个月的活性化后，其活性开始下降，NKT细胞在3～4个月的时间内呈活性化。另外，NK细胞和NKT细胞的活性化两者呈反比关系，即，如果NK细胞活性化，则NKT细胞受到抑制；NKT细胞活性化时，则NK细胞受到抑制。这样，两者呈相互补充的关系，应根据癌症的种类、患者适合性，如患者的免疫功能情况、抗化疗药剂的服用时期、以及用于治疗的α-1，3葡聚醣结构等，来选择使用抗化疗药剂。本发明利用上述测定方法，提供能区别包括上述测定方法的NK活性剂或者NKT活性剂的筛选方法。本发明确认，具有α-1，3葡聚醣结构的Nigerooligo糖、褐藻多糖硫酸酯、以及/或者紫菜为代表的紫菜等组成物制剂有用。这样，通过这种筛选方法得到的NK活化能力或者NKT活化能力，载有上述能力的新α-1，3葡聚醣作为抗化疗药剂非常有效。另外，具有其它α-1，3葡聚醣结构的化合物还有很多，只要将这些已知结构和CD3(-)CD161(+)、CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力、CD3(+)CD161(+)、CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定结合起来，业内人士就能很容易地对NK活性剂或者NKT活性剂进行特殊规定。而且，CD161(+)还意味着对NK细胞及NKT细胞共同的受体NKR-P1产生作用。
利用本发明介绍的测定方法，对癌症种类和NK细胞及NKT细胞的变化情况的关系进行检定，发现NK细胞可以有效治愈的癌症包括前列腺癌和部分肺癌及部分胃癌；NKT细胞可以有效治愈的癌症包括大部分肺癌及部分胃癌。另外，证明中间型可分类为乳腺癌、及大肠癌。而且，含有α-1，3葡聚醣的NK细胞活性剂对前列腺癌及部分肺癌、部分胃癌有特异性功效。另一方面，含有α-1，3葡聚醣的NKT细胞活性剂对于大部分的肺癌及部分胃癌具有特异性功效。
如上所述，通过单独或者组合合作本发明的测定方法，能够测定癌症患者的免疫功能，根据测定结果和癌症种类，来选择有效的治疗方法及治疗用药及医药组成物，能得到比传统疗法更为有效的癌症治疗效果。
另外，通过本发明测定方法，还能够测定能识别CTL、NK细胞、NKT细胞的各种细胞特征及各种标记等遗传因子，如CD3、CD8、CD161、穿孔蛋白、IL-12、IFNγ等遗传因子。也能得到与本发明测定方法同等的结果及效果。即，本发明的范围包括，测定上述遗传因子、与本发明相关的测定方法、与本发明相关的筛选方法及通过该筛选方法得到的物质等。
本发明人还利用本发明介绍的测定方法对NK细胞的活性化、NKT细胞的活性化和抗癌剂、放射线、类固醇治疗并用的影响进行了观察。结果在CTL活性化上有重大的影响，在NK细胞及NKT细胞的活性化方面，对抗癌剂、放射线及类固醇治疗并用的影响在通常的服用方法、服用量上没有出现。这说明，使用NK细胞活性剂及NKT细胞活性剂治疗癌症时，不仅可将其与抗癌剂、放射线及类固醇治疗并用，且并用后还能得到更好的抗癌功效。
抗肿瘤免疫能力与2种免疫系统有关，其一是，①TNFα-(肿瘤坏死因子)→IFNγ→IL-12→杀伤性T细胞(CTL)系统(CTL活性化)；其二是，②NKT细胞活性化系统或者NK细胞活性化系统。按照传统的新免疫疗法(NITC)，上述两个系统具有相同的治疗功效。即，确认有如下病例上述IL-12→杀伤性T细胞活性→凋亡系统呈活性化的结果是得到治疗功效的病例和上述②NKT细胞活性化系统或者NK细胞活性化系统呈活性化的结果是得到治疗功效的病例。
进行抗癌剂、放射线或者类固醇并用疗法时，新发现在上述2种免疫系统中，TNFα-(肿瘤坏死因子)→IFNγ→IL-12→杀伤性T细胞(CTL)系统明显受到影响；另一方面，NKT细胞活性化系统或者NK细胞活性化系统完全没有受到影响。
根据这种现象，重新组合成癌症治疗方法，这就是本发明的另一种实施方式。即，将抗癌剂、放射线、或者类固醇并用疗法用于癌症治疗时，如果上述②的免疫系统强大，那么并用疗法就是可以实施的，治疗效果也会很好。但，如果上述②的免疫系统下降，只有上述①的免疫系统变强的话，那么就可以认为为并用疗法是失败的。这时，就有必要服用本发明介绍的NKT细胞或者NK细胞的活性化物质α-1，3葡聚醣(α-1，3立体结构的糖类物质)，即并用强化上述①的免疫系统的α-1，3葡聚醣。当然，在喂食抗癌剂时，必须符合不影响上述①的免疫系统的喂食法--低浓度化学疗法，即5FU、UFT、嘧福禄、氟铁龙、CDDP(5ug～10ug)的低浓度及泰索帝或者紫杉醇、阿霉素、丝裂霉素、CPT-11等低浓度抗癌剂的喂食方法等。另外，同样在放射线疗法中，必须符合低容量放射；在类固醇疗法中，需选择低浓度喂食等。
所以，在进行抗癌剂、放射线、或者类固醇疗法时，必须对接受上述疗法的患者的各种免疫能力进行测定。根据测定结果，上述②的系统免疫能力增强时，就有必要喂食应维持这种状态的、具有NKT细胞或者NK细胞活化能力的物质，即具有α-1，3立体结构的糖类物质。上述②系统的免疫力下降时，就有必要大量喂食或者直接体内投与具有α-1，3立体结构的糖类物质，如通过注射投与。另外，只有上述①的系统免疫能力起作用时，就有必要投与不对上述①的免疫能力产生影响的抗癌剂，即通过低浓度投与或者抗癌剂投与来达到迅速恢复上述①免疫系统的上述①免疫系统强化，即大量投与IL-12诱发物质。
从癌症患者中筛选出样本，测定对每个癌症种类起作用的相应标记，然后按不同癌组织及/或者组织类型对所测定的值进行分析，来对不同癌组织及/或者组织类型选择不同处方。以上信息提供了这种特征的癌检查方法、诊断方法及治疗方法。
而且，只要将这些信息负载到利用自然法则的媒介物上，就成为商业媒介物。另外，这些商业媒介物提供有用的商业方法。
α-1，3立体结构的糖类物质可举出如Nigerooligo糖(STO)、褐藻多糖硫酸酯及硫酸半乳糖寡糖等。
Nigerooligo糖是含有3-O-α--D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖基构成单位的糖类。具有代表性的有，黑曲霉糖、32-O-a-d-glucosyl-d-maltose、Nigerosyltose等。
另外，市场上销售的Nigerooilgo糖还包括Nigerooilgo糖液糖(销售商·武田食品工业株式会社)。其含有的主要Nigerooilgo糖是，①黑曲霉糖α--D-GLcp-(1，3)-D-Glc②32-O-a-d-glucosyl-d-maltoseα--D-Glcp-(1，3)-α--D-Glcp-(1，4)-D-Glc③Nigerosyltoseα--D-Glcp-(1.3)-α--D-Glcp-(1，4)-α--D-Glcp-(1，4)-D-Glc(Glc指葡萄糖，p指吡喃糖)。
褐藻多糖硫酸酯狭义上是指岩藻糖的2至6分子上结合硫酸1分子形成的含有硫酸岩藻糖多糖类。其中含有木糖或者糖醛酸的褐藻多糖硫酸酯样多糖体在食品领域称之为褐藻多糖硫酸酯。褐藻多糖硫酸酯，可通过粉碎海带，切成碎屑，提取其中的水溶液成分后，通过离心分离将提取残渣分离，通过限外过滤去除碘及氯化纳等低分子物质，再进行冻结干燥化处理，制成制剂。
褐藻多糖硫酸酯包括褐藻类褐藻多糖硫酸酯，如海菜(一种类似于海带的海菜)提取的褐藻多糖硫酸酯及Cladosiphon okamuranus提取褐藻多糖硫酸酯等。海菜等褐藻类海带科提取的褐藻多糖硫酸酯至少有以下3种，褐藻多糖硫酸酯、F-褐藻多糖硫酸酯(α--L-岩藻糖的聚合物)、U-褐藻多糖硫酸酯(β-D--葡萄糖醛酸和α--D-甘露糖为主键，侧键为α--L-岩藻糖)，所有的褐藻多糖硫酸酯，岩藻糖都经过了硫酸盐化。
硫酸半乳糖寡糖有株式会社白子制的紫菜(Poryphyra Yezaensis)提取物。该提取物主要成分是α-1，3结合的半乳聚糖硫酸的半乳糖寡糖和α-1，3结合及β-1，4结合形成的半乳聚糖硫酸的半乳糖寡糖。
本发明介绍的CTL活性剂、NK活性剂、NKT活性剂，在使用本发明介绍的测定方法的同时，选择各自的适用方法，可有效治疗肺癌(肺扁平上皮癌、肺腺癌、小细胞肺癌)、胸腺瘤、甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、盲肠癌、尿道癌、乳腺癌、子宫颈瘤、脑肿瘤、舌癌、咽喉癌、鼻腔癌、喉头癌、胃癌、肝癌、胆管癌、精巢癌、卵巢癌、子宫癌、转移性骨癌、恶性黑色瘤、骨肉瘤、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、脂肪肉瘤等，但并不局限于以上癌症。
本发明介绍的CTL活性剂(IL-12生成诱发剂、INFγ生成诱发剂)、NK活性剂、NKT活性剂，用于以本发明的测定方法所得结果为标准，诱发或者增强其活性化，并进一步维持其活性化的处方。即，基于以上标准，选择诱发或者增强其活性化，再就是能够维持其活性化的投与量及投与期间。具体来说，投与量的标准是，具有NK活性剂或者NKT活性剂的α-1，3葡聚醣结构的化合物1g～40g/天左右，最好是5g～20g/天左右；具有CTL活性剂(IL-12生成诱发剂、INFγ生成诱发剂)的β-1，3葡聚醣结构的化合物1g～10g/天左右，最好是3g～6g/天左右。另外，投与期间一般为10天～24个月，投与频率为1～3次/天，最好是连续几天投与。而且，CTL活性剂、NK活性剂、NKT活性剂最好是口服摄取。当然，也可以通过减少投与量，将其制成可以非口服的质量，从而实现非口服摄取(包括静脉或者肌肉注射等)。
细胞及各种标记的测定方法如下所示。
(NKT细胞的测定)(NK细胞的测定)(CD8的测定)具有NKR——P1的NKT细胞测定可通过测定NKT细胞的表面存在的特异性细胞表面抗原(CD3及CD161)来进行。具体地讲，对末梢血中的淋巴球检定CD3为阳性而且CD161也呈阳性(CD3+CD161+)的细胞。即，使用单克隆抗体，利用流式细胞仪的TWO COLOR检查对NKT细胞的表面抗原CD3及CD161进行测定。这里所指的NKT细胞被活性化，是指淋巴球中(CD3+CD161)NKT细胞的比例在10％以上，最好是在16％以上。所谓NKT细胞活性化功能表示能使NKT细胞比例增加10％以上，最好是16％以上的功能，或者NKT细胞比例比投与物质前增加更多的功能。
同样，所谓(CD3-CD161+)是指CD3呈阴性，而且CD161呈阳性的细胞检定。本发明确认，这种方法对NK细胞测定有效。
所谓CD8+是指检定CD8呈阳性的细胞。本发明确认，这种方法对CTL活性测定有效。
在实施例中，对患者血液中细胞，将细胞表面抗原CD3、CD161、CD8区分为阳性、阴性，通过使用流式细胞仪的TWO COLOR检查对各种细胞的比例进行常法测定。这时，针对CD3、CD161、CD8的单克隆抗体分别使用COALTAR公司生产或者BECTON DICKNSON公司生产的产品。
(穿孔蛋白生成细胞的测定)关于末梢血中的淋巴球，通过使用流式细胞仪的THREE COLOR检查对细胞表面抗原为CD3、CD8、CD161中两种和穿孔蛋白进行常法测定。具体地讲，在提取的血液内添加固定液，进行固定，添加膜透过液后再加入穿孔蛋白抗体(Pharmingen公司生产)，使其发生反应，接着，加入PRE-Cy5标识二次抗体(DAKO公司生产)，使其发生反应，接着再加入CD3-PE(Coulter 6604627)抗体及抗CD161-FITC(B-D)抗体，使其发生反应，最后，使用流式细胞仪进行测定。该穿孔蛋白生成有意义表示NK细胞或者NKT细胞被分别活性化。图中缩略语表示为PERF。
(现有的NK细胞活性测定方法)现有的方法是铬释放法(在标识为51Cr的标的细胞(K-562)内加入效应细胞(NK细胞)进行培养，通过测定因标识细胞影响而游离的51Cr，计算出活性值)(Med Technol 21(7)574～580(1993))。
(调制用于测定细胞因子的试剂)首先，从血液中分离调制出单核细胞部分。将肝素加末梢血用磷酸缓冲生理盐水(Phosphate Bufferde Saline)(PBS)稀释2倍，进行混和，然后，复层到Ficoll-Conray液(比重1.077)上，在400G的作用下，进行20分钟的离心(沉淀)，提取单核细胞部分。洗净后，加入RPMI-1640培养基(添加10％的牛胎儿血清(FBS))，将细胞数调制成1×106个。在调制好的细胞悬浮液200ul中加入Phytohemagglutinin公司(DIFCO公司制造)的植物血球凝集素，调配成浓度为20ug/ml。用96孔Microplate在5％CO2、37℃环境下培养24小时，制成测定该培养好的细胞溶液中细胞因子的试料。
(IL-12的测定)IL-12量的测定，可利用临床、生化检查。可使用R&DSYSTEMS公司及MBL公司生产的基于酶免疫测定方法(ELISA)的测定试剂盒。这里使用的是R&DSYSTEMS公司生产的测定试剂盒。分别在96孔microplate的各孔内注入测定用稀释液Assay Diluent RD1F 50ul、标准液(standard)或者实施例1中调制的试料200ul，之后，在室温状态下静置2小时，使其发生反应。然后，分别注入200ul的辣根过氧化物酶(HRP)标识抗IL-12抗体，室温状态下静置2小时。清除各孔内的反应液，冲洗3次，分别注入200ul的显色基质溶液，在室温状态下静置20分钟，再分别注入50ul的酶反应终止溶液。作为与550nm进行对比，用Emax(和光纯药株式会社制造)测定450nm时各孔的吸光度。IL-12量表示为pg/ml。这里所说的IL-12生成诱发功能是指在刺激作用下，末梢血中单核细胞部分生成的IL-12的量增强到7.8pg/ml以上的功能或者比投与物质前的IL-12生成量增强的功能。
(IFNγ测定)IFNγ测定使用BioSource Europe S.公司的IFNγEASIA试剂盒)，通过酶免疫测定方法(EIA法)测定。即，各别在96孔microplate的各孔内注入标准液(STANDARD)或者上述调制好试料2倍稀释液50ul，注入50ul的HRP标识抗IFN-γ抗体，然后保持振荡，在室温状态下使其反应2个小时。清除各孔的反应液，冲洗3次，分别注入200ul的显色基质溶液，保持振荡，在室温状态下反应15分钟，再分别注入50ul的酶反应终止溶液。作为与630nm进行对比，用Emax(和光纯药株式会社制造)测定490nm时各孔的吸光度。IFNγ量表示为IU/ml。
实施例下面，将通过实施例，具体介绍本发明。但，本发明并不仅仅局限于以下所举的例子。
实施例1根据各个推荐处方，向患者投与ILX((株)东西医药研究所)、鲨鱼软骨(seishin企业)及α-1，3结构的糖类(Nigerooligo糖)。图中的CR、PR、LNC、SNC、NC、PD按癌症治疗中通常的分类实施。图1～8表示103病例中IL-12生成诱发量(pg/ml)(Y轴)和CD8(+)穿孔蛋白(+)的细胞率(％)(X轴)的关系。图1全部、图5的SNC、图6的NC、图7的PD、图8的初诊中，两者之间的关系没有显现。但在图2(CR+PR)、图3(CR+PR+LNC)、图(LNC)的治疗有效例子中，两者之间的关系得以确认。图9～16，表示103病例中INFγ生成诱发量(IU/ml)(Y轴)和CD8(+)穿孔蛋白(+)的细胞率(％)(X轴)的关系。图9全部、图13的SNC、图14的NC、图15的PD、图16的初诊中，没有发现两者之间的关系，图10(CR+PR)、图11(CR+PR+LNC)、图12(LNC)的治疗有效例子中，两者之间的关系得以确认。结果是，IL-12诱发生成及INFγ生成诱发与CD8(+)穿孔蛋白(+)测定系统相同。即，证明CD8(+)穿孔蛋白(+)测定系统意味着CTL活性化测定。
实施例2与实施例1相同的处置患者群(98病例)，研究NK活性测定方法(传统方法)和本发明的CD(-)CD161(+)测定的意义。图17～26表示NK细胞活性(％)和CD3(-)CD161(+)(％)的关系；图27～32表示NK活性(％)和CD3(-)CD161(+)P(+)[P(+)表示穿孔蛋白生成](％)的关系；结果是，传统方法的NK活性测定与CD3(-)CD161(+)及CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白(+)的测定系统相同，并证明CD3(-)CD161(+)的测定表示NK活性化测定。
实施例3选择与实施例1相同的处置患者群(148病例)，特别是对于根据推荐处置投与α-1，3结构化合物Nigerooligo糖(TOG)病例，测定其CD3(-)CD161(+)，对TOG投与开始前后进行比较，并将有效例子和无效例子进行比较。图33是CR+PR病例的有效例子，表示CD3(-)CD161(+)显示为高值的情况。即，发现α-1，3结构的糖类能有助于NK细胞的活性化。
实施例4选择与实施例1相同的处置患者群(98病例)，研究NK细胞活性[传统方法或者本发明介绍的CD3(-)CD161(+)测定]和NKT细胞活性[CD3(+)CD161(+)]的意义。图34～39表示CD3(-)CD161(+)(X轴NK细胞活性)(％)和CD3(+)CD161(+)(Y轴NKT细胞活性)(％)的关系，都表示相反的关系。图40～45表示CD3(-)CD161(+)P(+)[P(+)表示穿孔蛋白生成](X轴活性化NK细胞)(％)和CD3(+)CD161(+)P(+)(X轴活性化NKT细胞)(％)的关系，都表示相反的关系。
实施例5选择与实施例1相同的处置患者群(148病例)，利用求取基于多变量分析(癌的种类和NKT细胞或者NK细胞的有效关系)的偏回归系数方法来分析各细胞的作用和癌症种类的关系。结果发现，在前列腺癌中，NKT细胞(CD3(+)CD161(+))的偏回归系统倾向于为负；另一方面，NK细胞(CD3(-)CD161(+))的偏回归系统倾向于为正。这表明，在前列腺癌中，NK细胞的贡献较大，是以NK细胞为指针，谋求其活性化的癌症有效治疗方法。同样，在肺癌中，NK细胞(CD3(+)CD161(+))的偏回归系统倾向于为正，是以NKT细胞为指针，谋求其活性化的癌症有效治疗方法。
实施例6选择与实施例1相同的处置患者群(26病例)，追加类固醇治疗(6例)、放射线治疗(7例)、抗癌剂治疗(13例)后(约1个月后)，测定各指标、NK细胞[CD3(-)CD161(+)]、NKT细胞[CD3(+)CD161(+)]、INFγ诱发生成量、IL-12诱发生成量。结果发现在所有的病例中，对NK细胞[CD3(-)CD161(+)]、NKT细胞[CD3(+)CD161(+)]没有影响，对INFγ诱发生成量、IL-12诱发生成量产生了有效的抑制效果(图52～55)。
产业利用的可能性通过以上实验及实施例，可以发现，本发明的NK细胞活性化测定方法比传统的铬释放法更能得到正确的结果、提供了CTL活性新的测定方法、NK细胞在α-1，3葡聚醣作用下能够活性化、NK细胞活性化和NKT细胞活性化呈相反关系，都具有抗癌系统的意义、癌症种类和NK细胞活性化及NKT细胞活性化中存在特异性、NK细胞活性化及NKT细胞活性化不受抗癌剂、放射线、类固醇治疗的影响。取得了癌症治疗中划时代的成绩。
权利要求
1.在对末梢血中的淋巴球至少进行以下一项测定的新免疫疗法中，人体免疫功能的测定方法1)CD8(+)穿孔蛋白生成能力，2)CD3(-)CD161(+)，3)CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力，4)CD3(+)CD161(+)，5)CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力。
2.各个测定意义如下的权利要求1的测定方法1)CD8(+)穿孔蛋白生成能力测定意味的功能是测定CTL活性，2)CD3(-)CD161(+)测定意味的功能是测定NK细胞，3)CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力的测定意味的功能是测定NK细胞的活性化，4)CD3(+)CD161(+)测定意味的功能是测定NKT细胞，5)CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定意味的功能是测定NKT细胞的活性化。
3.包括CD8(+)穿孔蛋白生成能力测定的CTL活性剂的筛选方法。
4.一种新β-1，3葡聚醣，载有通过权利要求3筛选方法得到的CTL活性剂力。
5.一种CTL活性剂，包括通过权利要求3的筛选方法得到的β-1，3葡聚醣。
6.一种NK活性剂的筛选方法，包括CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力测定。
7.一种新α-1，3葡聚醣，载有包括通过权利要求6筛选方法得到的NK活性剂。
8.一种NK活性剂，包括通过权利要求6的筛选方法得到的α-1，3葡聚醣。
9.一种NK细胞和NKT细胞活动情况的测定方法，其特征在于，同时测定权利要求1中的CD3(-)CD161(+)、CD3(-)CD161(+)穿孔蛋白生成能力、CD3(+)CD161(+)、CD3(+)CD161(+)穿孔蛋白生成能力。
10.一种NK活性剂或者NKT活性剂分别的筛选方法，包括基于NK细胞和NKT细胞活性呈相反关系的权利要求9的方法。
11.一种新α-1，3葡聚醣，载有通过权利要求10的筛选方法得到的NK活性剂或者NKT活性剂。
12.一种NK活性剂和NKT活性剂，包括通过权利要求10的筛选方法得到的α-1，3葡聚醣。
13.一种通过权利要求9测定方法、癌症种类和NK细胞及NKT细胞动态之间关系的检定方法。
14.一种NK细胞或者NKT细胞的活性剂，包含在实施权利要求13检定的同时，与抗癌剂、放射线、及类固醇治疗之一并用的α-1，3葡聚醣。
15.一种癌症患者采样实施的检查方法，利用权利要求1～14之一中记录信息。
16.一种癌症患者采样实施的诊断方法，利用权利要求1～14之一中记录信息的。
17.一种癌症患者采样实施的治疗方法，利用权利要求1～14之一中记录信息的。
18.一种商业用媒介物，将权利要求1～17之一中记录的信息载荷到利用自然法则的媒介物上形成的。
19.利用权利要求18的商业用媒介物的商业方法。
全文摘要
提供了测定CTL活性、NKT活性及NK活性的新方法。利用该测定方法，来分析各测定结果检定的意义，发现CTL活性、NKT活性及NK活性在癌症治疗中的意义。具体来讲，本发明能提供一种测定CTL活性、NKT活性及NK活性的新方法。利用该测定方法，来分析各测定结果检定的意义，新发现CTL活性、NKT活性及NK活性在癌症治疗中的意义，来得到本发明介绍的新免疫疗法。
文档编号A61P35/00GK1568426SQ0282007
公开日2005年1月19日 申请日期2002年10月8日 优先权日2001年10月9日
发明者八木田旭邦 申请人:东方癌症治疗株式会社