专利名称：一种稳定的重组人红细胞生成素制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种不含人血白蛋白的基因工程重组蛋白(重组人红细胞生成素rHuEPO)制剂及其制备方法。
背景技术：
促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白，分子量约为30～39KD。依据其糖型结构的差异可分为α、β两种。它的生理作用是刺激骨髓中血红蛋白或红细胞的形成，主要由肾脏生成并通过循环血进入骨髓而发挥作用。重组人红细胞生成素rHuEPO具有与天然的促红细胞生成素EPO相同的结构及生理作用，临床上已广泛应用于肾性贫血、外科围手术期的红细胞动员、肿瘤化疗引起的贫血等。
EPO在体内的工作浓度非常低，人体对于EPO水平的微小变化非常敏感，所以依赖于rHuEPO的治疗必须建立在一个能够保证这种痕量的外源激素能够精确给药的制剂的基础之上。但是已知rHuEPO在水溶液中及其不稳定(见专利US 4,806,524)，所以在rHuEPO溶液中加入一种或多种保护剂增加rHuEPO的稳定性防止其被吸附在容器的内壁之上是必要的。
已知在基因重组蛋白质类药品制剂中，人血白蛋白是一种常见和有效的稳定剂(见专利US 4,703,008)。但由于人血白蛋白为血液制品，不可避免的存在着潜在的血源性污染问题(如传染肝炎病毒、爱滋病毒等)。因此研究人员通过对rHuEPO的研究采用了多种保护剂来代替人血白蛋白。例如专利US 4,879,272中提到的卵磷脂、葡聚糖40、甲基纤维素、聚乙二醇等。但是专利US 4,992,419研究表明用这样的试剂不能达到长期稳定化，即在小鼠实验中rHuEPO的效力大大降低，而且注射这些试剂时可引起免疫原性反应；此外，从专利US 4,992,419和专利US 5,376,632中可了解到某些适用于冻干rHuEPO制剂的稳定剂，包括尿素、各种氨基酸及环糊精。但是采用冻干剂型对于注射制剂来说不方便，增加了溶解的步骤及操作和污染杂质的机会。此外，由于在生产过程中增加了冻干的工序，不仅增加了成本，而且使质量不易于控制，使不同批次之间的稳定性受到影响。
因此，问题是要找到一种易于相溶的、可稳定贮存的rHuEPO制剂，既能保证其精确给药，又能防止其吸附于安瓶和注射器壁上；不仅能保持其长期的生物活性和稳定性，而且生产工艺简单，生产成本低。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含人血白蛋白的可相溶的、贮存稳定的基因工程重组蛋白(重组人红细胞生成素，rHuEPO)制剂及其制备方法。根据我们多次实验发现在rHuEPO溶液中加入甘露醇能有效防止rHuEPO被吸附，增加rHuEPO的稳定性和活性，所以本发明采用甘露醇为保护剂，生产工艺简单，使用安全可靠。
本发明的目的是这样实现的本发明提供一种主要用于治疗肾性贫血的重组人红细胞生成素溶液制剂，该制剂含有保护剂甘露醇。本发明的溶液制剂是注射用水溶液剂，可以含有以下组分(1)为活性成分的重组人红细胞生成素蛋白100～20000国际单位/毫升；(2)生理上可相溶的缓冲液5～100mM，pH4.0～8.5；(3)等渗调节剂氯化钠0.05～1.0％；(4)为保护剂甘露醇1.0～20.0％；(5)水。
本发明所选用的生理上相溶的缓冲液可以采用柠檬酸盐缓冲液、或采用磷酸盐缓冲液、或采用甘氨酸缓冲液、或采用醋酸盐缓冲液、或碳酸盐缓冲液，使用浓度为5～100mM，pH4.0～8.5。用于稳定产品所需的pH值及药物溶解度的要求。
本发明所选用的柠檬酸盐缓冲液除了维持rHuEPO适宜的pH值外，作为螯和剂还可以排除注射液中痕量重金属离子对蛋白质的破坏作用，使用浓度范围为5～100mM。
本发明的氯化钠保证了注射液与体内保持一致的渗透压，浓度为0.05～1.0％。
本发明采用甘露醇做保护剂，阻止蛋白质的凝结增加蛋白质的溶解度，浓度在1.0～20.0％之间。
本发明的制剂中还可含有金属离子螯和剂如乙二氨四乙酸二钠，微量金属离子对自动氧化反应有显著催化作用，可以加入金属离子螯和剂抑制自动氧化反应的发生。
本发明的制剂中还可含有L-组氨酸盐酸盐，它与蛋白质存在一定的生物相溶性，对蛋白质有一定的保护作用，同时，作为抗氧化剂，可以降低rHuEPO在长期保存过程中的氧化降解作用。
以上所述的百分含量为重量百分含量。
本发明的特点是应用本发明提供的方法，可生产一种不含人血白蛋白的可相溶的、贮存期长且贮存稳定的基因工程重组人红细胞生成素rHuEPO。本发明还具有制备方法简单、生产成本低、应用效果好等特点。
具体实施例方式
下面将通过实施例对本发明做进一步说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利范围。
实施例1.
配制1000支200单位的rHuEPO成分 含量柠檬酸缓冲液 20mM20％甘露醇 4％氯化钠 0.585％重组人红细胞生成素 200国际单位余量为水。
量取700毫升超纯水，然后准确称取二水柠檬酸三钠5.80克、一水柠檬酸0.062克、氯化钠5.85克，溶于700毫升超纯水中，充分溶解后，制成A液，保持溶液温度在20～25℃，测定溶液pH值在6.9～7.0之间。
准确量取200毫升20％甘露醇溶于A液中，充分混匀，保持溶液温度在20～25℃。混合溶液中加入2×105单位的rHuEPO蛋白，用超纯水定容至1000毫升。配制rHuEPO的成品制剂。
将成品制剂无菌过滤到灭菌的容器中。然后分装，每瓶加入1毫升成品制剂，在整个配制过程中通以无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成200单位的rHuEPO注射液。
实施例2.
配制1000支1000单位的rHuEPO成分含量磷酸盐缓冲液10mM20％甘露醇 2％氯化钠 0.584％重组人红细胞生成素 1000国际单位余量为水。
量取700毫升超纯水，准确称取磷酸氢二钠2.51克、磷酸二氢钠0.47克、氯化钠5.84克，溶于700毫升超纯水中，充分溶解后，制成A液，保持溶液温度在20～25℃，测定溶液pH值在6.9～7.0之间。
准确量取100毫升20％甘露醇溶于A液中，充分混匀，保持溶液温度在20～25℃。混合溶液中加入1×106单位的rHuEPO蛋白，用超纯水定容至1000毫升。配制rHuEPO的成品制剂。
将成品制剂无菌过滤到灭菌的容器中。然后分装，每瓶加入1毫升成品制剂，在整个配制过程中通以无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成1000单位的rHuEPO注射液。
实施例3.
配制1000支4000单位的rHuEPO成分 含量甘氨酸缓冲液 50mM20％甘露醇8％氯化钠0.9％乙二氨四乙酸二钠 0.01％重组人红细胞生成素4000国际单位余量为水。
量取500毫升超纯水，准确称取甘氨酸3.75克、氯化钠9.0克，溶于500毫升超纯水中，充分溶解后，制成A液，保持溶液温度在20～25℃，测定溶液pH值在6.9～7.0之间。
称取乙二氨四乙酸二钠0.10克，加入A液中，充分混合溶解，保持溶液温度在20～25℃，此为B液。
准确量取400毫升20％甘露醇溶于B液中，充分混匀，保持溶液温度在20～25℃。混合溶液中加入4×106单位的rHuEPO蛋白，用超纯水定容至1000毫升。配制rHuEPO的成品制剂。
将成品制剂无菌过滤到灭菌的容器中。然后分装，每瓶加入1毫升成品制剂，在整个配制过程中通以无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成4000单位的rHuEPO注射液。
实施例4.
配制1000支8000单位的rHuEPO成分 含量磷酸盐缓冲液 10mM20％甘露醇4％氯化钠0.584％L-组氨酸盐酸盐0.1％重组人红细胞生成素8000国际单位余量为水。
量取700毫升超纯水，准确称取磷酸氢二钠2.51克、磷酸二氢钠0.47克、氯化钠5.84克，溶于700毫升超纯水中，充分溶解后，制成A液，保持溶液温度在20～25℃，测定溶液pH值在6.9～7.0之间。
称取L-组氨酸盐酸盐1克，加入A液中，充分混合溶解，此为B液。
准确量取200毫升20％甘露醇溶于B液中，充分混匀，保持溶液温度在20～25℃。混合溶液中加入8×106单位的rHuEPO蛋白，用超纯水定容至1000毫升。配制rHuEPO的成品制剂。
将成品制剂无菌过滤到灭菌的容器中。然后分装，每瓶加入1毫升成品制剂，在整个配制过程中通以无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成8000单位的rHuEPO注射液。
实施例5.
配制1000支10000单位的rHuEPO成分 含量柠檬酸缓冲液 20mM20％甘露醇 2％氯化钠 0.585％L-组氨酸盐酸盐 0.1％乙二氨四乙酸二钠 0.01％重组人红细胞生成素 10000国际单位余量为水。
量取700毫升超纯水，准确称取二水柠檬酸三钠5.80克、一水柠檬酸0.062克、氯化钠5.85克，溶于700毫升超纯水中，充分溶解后，制成A液，保持溶液温度在20～25℃，测定溶液pH值在6.9～7.0之间。
准确称取乙二氨四乙酸二钠0.1克，加入A液中，充分混合溶解，此为B液。
准确称取L-组氨酸盐酸盐1克，加入B液中，充分混合溶解，此为C液。
准确量取100毫升20％甘露醇溶于C液中，充分混匀，保持溶液温度在20～25℃。混合溶液中加入1×107单位的rHuEPO蛋白，用超纯水定容至1000毫升。配制rHuEPO的成品制剂。
将成品制剂无菌过滤到灭菌的容器中。然后分装，每瓶加入1毫升成品制剂，在整个配制过程中通以无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成10000单位的rHuEPO注射液。
为了测定不同配制的成品制剂的贮存稳定性，进行了制剂贮存对照试验。采用相同批次的重组人红细胞生成素(rHuEPO)半成品(符合《中国生物制品检定规程》，纯度大于98％)，进行不同规格制剂的配制试验，其中对照组配成含有0.25％人血白蛋白的制剂。按照不同的温度条件分成两组37℃组和4℃组，观察期分别为3个月和2年，定期检测制剂中rHuEPO的外观、pH值、纯度及体内活性。结果表明，在37℃条件下，三个月内含人血白蛋白对照组与不含人血白蛋白试验组的活性均有明显的下降，但两者无明显的差异。在4℃条件下，2年内含人血白蛋白对照组与不含人血白蛋白试验组的活性均无下降，两者无明显的差异(结果见下表)。
37℃保存三个月的实验结果
4℃保存两年的实验结果
结果显示，应用本发明提供的方法，生产一种不含人血白蛋白的可相溶的、贮存稳定的基因工程重组人红细胞生成素rHuEPO，在4℃保存2年重组人红细胞生成素rHuEPO的活性可保持稳定。
权利要求
1.一种人红细胞生成素溶液制剂，其特征在于，该制剂中含有保护剂甘露醇。
2.权利要求1的制剂，含有以下组分(1)人红细胞生成素，100～20000国际单位/毫升；(2)生理上可相溶的缓冲溶液5～100mM，pH4.0～8.5；(3)氯化钠，0.05～1.0％；(4)甘露醇，1.0～20.0％；(5)水。
3.权利要求2的制剂，其中的缓冲溶液选自，磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液。
4.权利要求2的制剂，其特征在于，制剂中还含有金属离子螯和剂，
5.权利要求4的制剂，所述金属离子螯和剂是乙二氨四乙酸二钠，含量为0.001～0.2％。
6.权利要求2的制剂，其特征在于，制剂中还含有L-组氨酸盐酸盐，含量为0.01～1.5‰。
7.权利要求2的制剂，其中的人红细胞生成素为基因重组人红细胞生成素含量为200～10000国际单位/毫升。
8.权利要求2的制剂的制备方法，其特征在于，将甘露醇、人红细胞生成素与含有氯化钠的缓冲溶液混合。
9.权利要求2的制剂是注射剂。
10.权利要求2的制剂在制备促红细胞生成的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种稳定的重组人红细胞生成素制剂，特别是注射剂，其技术要点是含有一定量的下述成分为活性成分的重组人红细胞生成素(rHuEPO)、蛋白保护剂甘露醇、维持一定pH值的生理上可相溶的缓冲液等渗剂氯化钠、余量为水，其特点是重组人红细胞生成素(rHuEPO)制备成可相溶的、贮存稳定的注射剂，用于治疗肾性贫血、外科围手术期的红细胞动员、肿瘤化疗引起的贫血等症，具有使用安全、方便、经济、无任何副作用等特点。
文档编号A61K38/18GK1519021SQ0310065
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者侯绪凤, 苏冬梅 申请人:沈阳三生制药股份有限公司