专利名称：肿瘤特异性转移因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别是涉及一种肿瘤特异性转移因子的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的的技术方案的制备方法由以下几个步骤组成A.制备抗原制备所需的原料为癌症患者的癌组织，制备过程为匀浆后，以5000～10000转/分钟的速度离心20～60分钟后，弃沉淀，再以8000～12000转/分钟的速度离心20～60分钟，最后收上清液除菌，定性定量，分装保存；B.动物免疫免疫过程为采取腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次，首次免疫和第二次免疫采用抗原加佐剂；第三、四次免疫只用抗原。
C.制备肿瘤特异性转移因子将经癌细胞抗原免疫的动物脾脏、淋巴结绞碎，匀浆后，冻融冻结温度为-20～-70℃，融化温度为20～30℃，冻融2～5次，最后低温透析，定量定性，无菌分装。四具体实施方式
本发明的具体实施步骤为1.制备抗原取手术切下的新鲜癌标本，用1～3倍体积的匀浆液，匀浆分散，匀浆液条件是0.9％NaCL、20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羟甲基氨基甲烷·盐酸(Tris·HCl)缓冲液(PH7.4)；离心5000～10000转/分钟、20～60分钟，弃沉淀；再离心收上清，离心8000～12000转/分钟、20～60分钟，收上清除菌，定性定量，分装保存。
2.免疫动物选择符合规定之健康山羊，每只重约20Kg，采取腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次。首次免疫抗原10～30毫克/次，加等量完全福氏佐剂；第2次免疫抗原10～30毫克/次，加等量不完全福氏佐剂；第3、4次免疫单用抗原50～100毫克/次。用皮试法检查山羊的致敏状态。
3.制备肿瘤特异性转移因子将经肿瘤抗原免疫的山羊脾脏、淋巴结处理干净，绞碎匀浆，冻于-20～-70℃低温下并于20～30℃温度下融化、如此反复冻融2～5次，对生理盐水透析(5000～14000D透析袋)、在温度2～10℃条件下，收透析外液，无菌抽滤，定性定量，并做生物活性检测，分装。
本发明的特点1.制备过程采用二次离心，可提高抗原的纯度；2.配制的匀浆液利于抗原的释放溶解及保护抗原的完整性；3.免疫的次数及用量既可保证肿瘤特异性转移因子的质量又能提高其产量；4.透析条件能提高肿瘤特异性转移因子的纯度。
本发明的优点肿瘤特异性转移因子本身不具免疫原性，可长期反复注射，使用安全、效果明显，是目前预防和治疗恶性肿瘤的一个安全有效实用的新方法新技术，具有广泛的市场应用前景及一定的社会价值。且对于消化系统肿瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、颅内易复发性肿瘤等均有较好疗效。
具体实施例方式1.制备抗原收集手术切下的新鲜癌标本，剔除癌灶周围的正常组织，以PH7.4，20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)缓冲液清洗、浸泡、匀浆分散，在4℃、7000转/分钟条件下离心30分钟；收上清，再次在4℃、12000转/分钟条件下离心50分钟，收上清液除菌，留少部分测蛋白量，分装，-20℃冻存备用。
2.免疫动物选择符合《实验动物管理规程》山羊，每只20公斤，采用腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点、每点0.5毫升，每周免疫1次，共免疫四次。首次免疫取20毫克/次癌抗原加等量完全福氏佐剂；第二次免疫取20毫克/次癌抗原加等量不完全福氏佐剂；后二次免疫用80毫克/次癌抗原。用皮试法检查山羊的致敏状态。
3.制备肿瘤特异性转移因子取经免疫的山羊脾脏、淋巴结，剪除包膜、脂肪、纤维组织、用灭菌生理盐水反复洗涤后剪碎，匀浆，-70℃至30℃反复冻融5次，镜检破碎细胞达90％以上，离心弃沉淀取上清液，收上清液装透析袋4℃生理盐水透析30～40小时，透析袋分子量5000D以下，收透析外液过滤除菌，以最高吸收峰处(251nm)8.0abs为1个肿瘤特异性转移因子单位(单位/毫升)，按生物制品分装规程分装，每支2毫升含2单位。
肿瘤特异性转移因子成品检定外观无异物无沉淀无色或淡黄色透明、澄清的液体无菌试验按2000年版二部《中国药典》附录XIH检查，应符合定。
PH值PH6.0～7.2，依2000年版二部《中国药典》附录VIH检查，应符合规定。
多肽含量Folin-酚法，1.0～1.5毫克/毫升核糖含量3.5-二羟甲苯比色法0.6～0.7毫克/毫升E252±2nm有特征吸收峰E250nm、1cm15～18
E260/280nmE260/280＝2.0～2.3蛋白质取本品2毫升加20％磺基水杨酸2毫升振摇，不得产生浑浊热源按2000年版二部《中国药典》附录XIE检查，应符合规定过敏试验取体重250～350克的健康豚鼠5只，连续次隔日腹腔注射本品0.5毫升，放置2周后，再自股静脉注射本品1.0毫升，注射后15分钟内，观察动物不得有连续次干咳、连续3次前爪抓鼻、明显竖毛、四肢发软、躺卧、呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。
异常毒性取体重17～20克的健康小白鼠5只，分别由尾静脉注射本品0.5毫升，72小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重18～19克的小鼠10只复试，全部小鼠在72小时内不得有死亡。
急性毒性试验小鼠40只，随机分成二组。一组肌肉注射20毫升/公斤受试药(分二次给药)，另一组一次性静脉注射30毫升/公斤受试药，受试药量分别相当于临床成人拟用剂量的250倍和375倍，连续观察7天。结果表明40只小鼠全部存活，给药后亦未观察到明显的毒性反应。小鼠生长良好，饮食如常，体重增加，行为活动未见异常，毛色光滑。试验结束，将小鼠脱颈处死尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，未见明显病理变化。
活性测定及结果E-玫瑰花结实验取相同小试管4支，2支分别加入Hanks液0.2毫升作对照管，另2支分别加供试液0.2毫升作测定管。每管加入淋巴细胞悬液0.1毫升，混匀，置37℃恒温水浴活化60分钟。取出，离心(200g，10分钟)，弃去上清液，加0.5％绵羊红细胞悬液0.1毫升，摇匀。置37℃温育10分钟，离心(100g，5分钟)，弃去上清液，将细胞轻轻水平旋转混匀，加固定液0.1毫升，轻轻混匀。置4℃冰箱15分钟。取出，每管取1滴分别置于载玻片上，用预先布匀染色液的盖玻片复盖于待染液滴上染色。用高倍镜镜检计数。凡淋巴细胞表面粘附4个以上绵羊红细胞者，即计算为玫瑰花结细胞的百分率，求出各组的平均值。结果样品管的活性玫瑰花结百分率比对照管的活性玫瑰花结百分率提高10％以上。
MTT-LAI实验实验分组对照组为单加培养液、单加普通转移因子、单加肿瘤抗原及普通转移因子+肿瘤抗原；实验组为肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原。实验步骤将小鼠脾淋巴细胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液稀释成1×106个/毫升，于96孔细胞培养板中每孔加入细胞液100微升。按实验分组向每孔再加入培养液或各样品。加样完毕，将孔板于37℃培养2.5小时，翻转孔板，弃去孔内上清。然后向各孔内加入180微升不含小牛血清的RPMI-1640液和20微升的MTT溶液(5毫克/毫升)，37℃再孵育4小时。离心(1000g，15分钟)微孔板，弃上清，每孔加入200微升二甲基亚砜以溶解细胞内形成的蓝色化合物(Formazan)，室温放置15分钟。于ELISA-reader DYNATECH MR4000 570nm比色。每组设复孔三份。粘附抑制指数按下式计算 结果肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原组的白细胞粘附抑制效应(LAI指数％)远高于其它各对照组(P＜0.01)，结果相差非常显著，提示肿瘤特异性转移因子转移的LAI效应是针对相应肿瘤抗原的。说明肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原，如胃癌特异性转移因子+胃癌抗原、肺癌特异性转移因子+肺癌抗原、乳腺癌特异性转移因子+乳腺癌抗原等等。
权利要求
1.肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于，由以下几个步骤组成A.制备抗原制备所需的原料为癌症患者的癌组织，制备过程为匀浆后，以5000～10000转/分钟的速度离心20～60分钟后，弃沉淀，再以8000～12000转/分钟的速度离心20～60分钟，最后收上清液除菌，定性定量，分装保存；B.动物免疫免疫过程为采取腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次，首次免疫和第二次免疫采用抗原加佐剂；第三、四次免疫只用抗原。C.制备肿瘤特异性转移因子将经癌细胞抗原免疫的动物脾脏、淋巴结绞碎，匀浆后，冻融冻结温度为-20～-70℃，融化温度为20～30℃，冻融2～5次，最后低温透析，定量定性，无菌分装。
2.根据权利要求1所述的肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于匀浆液条件是0.9％NaCL、20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羟甲基氨基甲烷·盐酸(Tris·HCl)缓冲液(PH7.4)。
3.根据权利要求1所述的肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于免疫条件是首次免疫抗原加等量完全福氏佐剂；第二次免疫抗原加等量不完全福氏佐剂，抗原用量为10～30毫克/次；最后两次免疫只用抗原，抗原用量为50～100毫克/次。
4.根据权利要求1所述的肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于透析条件是用5000～14000道尔顿透析袋，在温度2～10℃条件下进行。
全文摘要
肿瘤特异性转移因子的制备方法，其特征在于包括制备抗原、免疫动物及制备肿瘤特异性转移因子。本品取材于经肿瘤抗原免疫的动物脏器，主要成分为小分子多肽、氨基酸及核苷酸等，不含球蛋白、也不会引起过敏，具有转移细胞信息，介导细胞免疫反应，特异性地抑制和杀伤相应的肿瘤细胞，是目前预防和治疗恶性肿瘤的一个安全有效实用的方法。
文档编号A61K38/16GK1438030SQ0311454
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月17日 优先权日2003年3月17日
发明者王国华, 苏成芝, 杨安钢, 张沥, 药立波, 毛积芳, 王方, 金明, 刘新平, 王成济, 陈苏民, 陈南春, 赵忠良, 柴玉波 申请人:中国人民解放军第四军医大学