专利名称：特异性治疗肿瘤或胞内感染的疫苗及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种重组病毒载体，该表达载体选择性地感染肿瘤或胞内感染细胞或组织而不感染正常组织或细胞，并且在有效杀伤肿瘤或感染细胞的同时高效表达特异性的抗原融合蛋白，从而诱导人体产生针对肿瘤或感染细胞的特异性免疫反应。本发明还涉及该表达载体的构建方法和治疗应用。
背景技术：
恶性肿瘤的治疗目前仍然主要依靠手术，放疗和化学治疗，这些方法均不能有效地解决肿瘤的代谢性转移和复发。此外，对于乙肝等的胞内感染的治疗，现今除干扰素等外也没有一些疗效较为满意的药物。
然而现实生活中存在着相当比例的肿瘤或乙肝自愈现象。这主要是人体产生对肿瘤或感染微生物的免疫所致。因此如能有效地介导人体对肿瘤或感染微生物的免疫反应，是唯一一种能彻底干净杀灭癌细胞或清除感染微生物的有效方法。有效的免疫反应和记忆细胞的出现是从根本上防治复发的有效手段，其作用的持久性也是放疗，化疗或其他药物治疗所不可代替的。
企图利用病毒感染治疗肿瘤有近50年的历史，1956年美国国家癌症研究所利用腺病毒治疗癌，虽然有效，但有严重的反复。目前较多地集中于利用腺病毒载体来表达以细胞因子，自杀基因和P53为代表的抑癌基因。在这其中美国ONXY公司的利用腺病毒治疗头颈癌肿瘤取得较好的进展。最初被认为仅仅在P53失活的肿瘤细胞中复制，因此可选择性地杀伤肿瘤。然而已有明确的事实说明腺病毒的复制、繁殖是与P53基因并不相关联。另外，该病毒属于复制缺陷型，因此它不具备反复感染肿瘤细胞的功能。
腺病毒是一种可以可应用于人的安全性治疗用病毒，其中腺病毒2型和5型研究的较为清楚，而4型和7型腺病毒被制成糖衣片在美国军队中广泛地用于防止呼吸道感染。
病毒对细胞的感染是通过细胞表面的受体和病毒的外壳蛋白上的纤丝蛋白(FIBER)所介导。例如单纯疱疹病毒是利用蛋白C结合于细胞表面FGF受体。Sindbis病毒外壳中的E2-糖蛋白的一个氨基酸的替换就能导致它的寄主范围发生变化。乙型肝炎病毒通过PRES1蛋白和肝细胞表面的膜联蛋白V(Annexin V)结合。此外，病毒生命周期的开始还取决于宿主细胞是否具有病毒所需的特异性基因转录激活因子。
腺病毒是由纤丝蛋白和细胞表面的CAR受体的结合引发该病毒的感染。腺病毒用于治疗的局限在于腺病毒的寄主范围比较广泛，会不加区分地感染正常细胞和变异细胞。随着分子生物学的进展，人们对病毒的基因的结构和功能进行了详尽的研究，能够有效的对病毒的结构基因进行修饰，并且改变其寄主范围，使它可以专门感染特异性表达某种抗原的肿瘤或被感染的细胞，这也解决了许多肿瘤细胞的表面CAR受体表达缺失的问题。目前，已开发了多种不同方法来改变腺病毒的感染范围(WO98/07877，美国专利5,559,099等)。
肿瘤能形成和造成病原微生物胞内感染的原因，在于成功地逃避了人体的免疫监视系统。免疫治疗的宗旨就是要破坏这样的免疫逃避，诱导出人体对肿瘤或被感染细胞的有效免疫反应，也就是激活CTL细胞和活化T-HELP细胞。
近年来的研究表明热激蛋白、超抗原、LLO等分子能结合特异性的抗原，参与递呈抗原分子，介导人体的抗感染或抗肿瘤免疫反应。尤其在对HSP的大量研究中，发现HSP在抗肿瘤的免疫中有重要作用。
HSP是有着各种分子量的一类蛋白质，其中HSP90蛋白家族(HSP110，GP96，HSP90)，HSP70家族，还有来源于牛结核分枝杆菌(Mycobacterium Bovis)的HSP65和结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberlosis)的HSP70均可被用来作抗原的递呈。事实上HSP本身并没有免疫原性，但当它结合特异性抗原肽时，就可以表现免疫原性，并呈递给T-细胞。Antigenics公司获得热激蛋白非共价结合肽复合物GP96的专利并利用它治疗肾癌病人，三期实验效果良好，然而它的不便在于它是一种个人化疫苗。
到目前为止，尚没有有效地治疗肿瘤或胞内感染的靶向性药物。因此本领域迫切需要开发有效治疗肿瘤和胞内感染的靶向性药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种特异性治疗肿瘤或胞内感染的药物及其制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种重组病毒载体，该病毒的基因组中插入热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒，所述的表达盒依次包括启动子序列、热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白编码序列和终止密码子。
在一优选例中，所述的病毒载体选自腺病毒、腺病毒相关病毒、新域疫病毒、呼肠孤病毒、Sindbis病毒、或痘病毒。
在另一优选例中，所述的病毒载体是腺病毒，且在腺病毒基因组E3区位置插入了所述的表达盒。
在另一优选例中，所述的腺病毒的E3区全部缺失，仅保留ADP蛋白，从而使腺病毒保留了裂解细胞的能力。
在另一优选例中，所述的腺病毒的纤丝蛋白编码区中还插入了神经调节蛋白的编码序列，从而实现特异性的感染。
在另一优选例中，所述的腺病毒的E1区早期启动子被ErbB2启动子所置换，从而使腺病毒特异性地在肿瘤细胞中增殖。
在另一优选例中，所述的热休克蛋白选自Hsp70、Hsp65、Hsp110、或gp96。
在另一优选例中，所述的抗原性肽是肿瘤抗原或病原体抗原。更佳地，所述的抗原性肽选自乙肝核心抗原T细胞表位、ErbB2的T细胞表位、ErbB3的Th细胞表位结构域、CEA表位、PSA表位、WT表位、HPV的E6表位、HPV的E7表位、HBV的表面抗原、HBV核心抗原、或其组合。
在另一优选例中，所述的热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒编码具有SEQ ID NO1、2或3所示氨基酸序列的融合蛋白。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的本发明所述的表达热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白的重组病毒载体和药学上可接受的赋形剂。
在本发明的第三方面，提供了一种热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白，其中，所述的热休克蛋白选自Hsp70、Hsp65、Hsp110、或gp96，且所述的抗原性肽选自乙肝核心抗原T细胞表位、ErbB2的T细胞表位、ErbB3的Th细胞表位结构域或其组合。
在另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO1、2或3所示氨基酸序列。
图1显示了本发明一种重组病毒载体的基因结构图。
图2显示了本发明的融合蛋白以及重组病毒载体对肿瘤的抑制作用。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，发现抗原性肽与热休克蛋白融合所形成的融合蛋白，能够有效地递呈抗原，诱导人体克服免疫逃避，从而产生T-细胞免疫反应。含有所述融合蛋白编码序列的重组病毒载体，不仅可以有效地激发个体的免疫反应，而且可靶向性地感染特定细胞并在其中增殖，从而有效地治疗肿瘤和胞内感染。在此基础上完成了本发明。
热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白在本发明中，术语“热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白”指由热休克蛋白和抗原性肽融合形成的融合蛋白。融合蛋白中热休克蛋白和抗原性肽的位置没有特别限制，可以是热休克蛋白-抗原性肽，或抗原性肽-热休克蛋白。此外，在融合蛋白中，可以含有一个或多个抗原性肽。例如，含有1-5个相同或不同的抗原性肽。
可用于本发明的抗原性肽包括肿瘤抗原和病原体抗原。肿瘤抗原或病原体抗原是指表达于肿瘤细胞或受感染细胞表面的特异性抗原，如ErbB2，ErbB3，CEA，PSA，HPV E6，HP VE7，WT，HBV面抗原等，它也包括在病毒复制过程中或表面受体分子折叠过程中出现于细胞表面的、能介导T-细胞反应的特异性抗原，如ErbB2 ICD，乙肝核心抗原等。
抗原性肽可以是全长的抗原，也可以是抗原的一部分，例如能引起免疫应答的表位。此外，抗原性肽还可以是多个表位的融合蛋白，如包含T-细胞抗原表位的一部分或多个T-细胞抗原表位的融合形式。
可用于本发明的热休克蛋白没有特别限制，可以是任何一种热休克蛋白。代表性的例子包括(但并不限于)HSP90蛋白家族(HSP110，GP96，HSP90)，HSP70家族，牛结核分枝杆菌(Mycobacterium Bovis)的HSP65和结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberlosis)HSP70。优选的热休克蛋白是人或分枝杆菌的热休克蛋白。
可用于本发明的热体克蛋白可以是全长的，也可以是其功能片段，例如含人或结核分枝杆菌Hsp70中第161-361位氨基酸的片段。
除了Hsp是优选的诱导免疫应答的蛋白之外，其他能递呈抗原和/或诱导人体克服免疫逃避，从而产生或增进T-细胞或Th细胞免疫反应的物质，也可以用于本发明。代表性的例子包括(但并不限于)LLO、人工合成的PADRE载体、破伤风素(TT)、麻疹病毒融合蛋白(MVF)、疟疾肽等。
热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒在本发明中，术语“热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白编码序列”指编码热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白的编码序列。编码序列可以是DNA或RNA。
在本发明中，术语“热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒”指含有热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白编码序列以及表达所需元件的序列组件，表达所需的组件包括启动子和终止密码子。此外，热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒还可以含有其他调控序列，其中包括但并不限于增强子、分泌信号肽序列、内含子、内部核糖体进入位点(IRES)、聚腺苷酸化信号序列等。
在本发明中，可以适用于热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如CMV启动子等其它适用于真核表达的启动子。
重组病毒载体在本发明中，将热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒用常规技术插入各种病毒载体的基因组中，就构建成本发明的重组病毒载体。
可用于本发明的病毒载体没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)腺病毒、腺病毒相关病毒、新域疫病毒、呼肠孤病毒、Sindbis病毒、或痘病毒。
一种优选的病毒载体是腺病毒。在本发明中，可供使用重组腺病毒可以是任何一种血清型的腺病毒，此外，宜采用已研究得较为透彻的腺病毒类型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，病毒颗粒呈正二十面体，直径为80-90nm。腺病毒主要有三种结构蛋白六邻体，构成20面体的表面；五邻体，位于蛋白质外壳中的12个顶角；纤丝蛋白，每个五邻体上的一条纤维突起。
腺病毒基因组为双螺旋线性双链DNA，约有36000个碱基对(bp)。人腺病毒有近50种血清型，其中Ad2和Ad5基因组结构和基因表达的研究较为广泛和深入，现已确定这两型腺病毒的全部核苷酸序列，目前构建的腺病毒载体大多源于这两种血清型。
腺病毒基因组中的E1区，在病毒基因组一进入宿主细胞核中即被激活，从而编码起始因子，调节病毒的早期活动，因此E1区为病毒复制所必需。
E2区编码的蛋白与病毒DNA的复制有关，包括病毒DNA末端结合蛋白(TP)，DNA结合蛋白(DBP)和DNA聚合酶，DBP与转录调控有关。
E3区编码的多肽与病毒逃避宿主抗病毒免疫反应有关。E3区缺失对腺病毒的感染性无明显影响。
E4区编码产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达、病毒蛋白合成和宿主蛋白合成终止等活动。主要晚期基因产物是病毒结构蛋白。
本发明的重组病毒载体一旦含有所述的表达盒，就可有效地递呈抗原，诱导人体克服免疫逃避，从而产生T-细胞免疫反应的目的。此外，对于本发明的重组病毒载体还可以进一步改进，以便使病毒能够靶向性感染、特异性增殖、以及保留裂解特定细胞等优点。
为了实现靶向性感染，可以在本发明重组病毒载体的基因组中包含靶向性结合蛋白的编码序列，该靶向性结合蛋白能特异地结合于肿瘤细胞或受感染细胞的表面特异性抗原。代表性的靶向性结合蛋白包括(但并不限于)特异性抗原的单链抗体，单域抗体(single-domain antibody)，超变区多肽(hypervariable region polypeptide)(如anti-HER2，anti-HER3，anti-HBV表面抗原等)和受体的天然配体(如EGF，神经调节蛋白等)。例如，对于腺病毒而言，就可以将靶向性结合蛋白(如神经调节蛋白)编码序列插入腺病毒纤丝蛋白的编码区的5’端一侧，或置换纤丝蛋白的一部分编码区。
为了实现特异性增殖，可以用在特定细胞中有效起始的启动子(如在肿瘤细胞中有效转录的ErbB2启动子)来替换病毒的早期启动子。在本发明的一优选例中，将腺病毒的E1区早期启动子用ErbB2启动子所置换，从而使腺病毒特异性地在肿瘤细胞中增殖。
为了保留裂解特定细胞，可以保留病毒为了裂解细胞所需的蛋白(如腺病毒的ADP蛋白)编码区。在本发明的一优选例中，将腺病毒的E3区全部缺失，仅保留ADP蛋白，从而使腺病毒保留了裂解细胞的能力，增强治疗效果。
药物组合物在制得本发明的热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白重组病毒载体之后，就可以将所需纯度的重组病毒载体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.，Ed.， )，以冻干形式或水溶液形式进行混合，从而制得本发明的含重组病毒载体的药物组合物。本发明的药物组合物主要是治疗性组合物。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；螯合剂如EDTA等各种添加剂。作为最常见的例子，水和生理盐水就可作为本发明重组病毒载体制剂中的载体。
含本发明的新型重组病毒载体的药物组合物(制剂)可以用常规方式施用于需要治疗的个体，这些方式包括(但并不限于)瘤内注射，肌内注射、皮下注射、静脉注射等。对于局部给药，一种较佳地方式是直接将本发明的制剂注射到病灶或其周围，例如肿瘤块中或其附近。给药剂量为106～1012PFU/个体，优选108～1010PFU/个体，精确的剂量和方式由医生根据患者的健康状况和总体免疫水平来做具体决定。
另外，除了采用病毒之外，还可将本发明的表达盒在BCG，伤寒沙门氏菌，李斯特杆菌(Listeria)和短小杆菌中表达，通过粘膜免疫等方法将融合蛋白施用于个体。或者，在用病毒感染的同时，体内注射本发明的融合蛋白或DNA分子。
在治疗中，还可分别用表达相同的本发明融合蛋白的、不同种属或不同血清型的病毒，进行诱导和免疫加强，从而避免病毒载体所带来的免疫反应，或避免由于病人早期感染形成的免疫记忆影响治疗。
本发明制备的重组病毒载体具有巨大的应用价值和优势，主要体现在以下几方面(1)有效地激发个体的免疫反应，从而有效地治疗肿瘤和胞内感染；(2)靶向性地感染肿瘤细胞或受感染的细胞；(3)特异性地在肿瘤细胞或受感染的细胞中增殖；(4)利用病毒载体实现细胞内免疫，利于免疫治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1构建对ErbB2受体基因过表达的肿瘤细胞选择性增殖的腺病毒由于在肿瘤中ErbB2受体基因过表达，因此ErbB2启动子在肿瘤细胞中可有效起始转录。在本实施例中，用ErbB2启动子替换腺病毒E1区的早期启动子，从而构建能在肿瘤细胞中选择性增殖的腺病毒(参见图1，下方左侧)。方法如下质粒PXCI和PBHG10购自Microbix Biosystems(Toronto，Canada)，其中质粒PXCI含腺病毒Ad5 bp22-5790片段。PBHG10含有除了腺病毒E1区(bp188-1339)和E3区(bp28133-30818)之外腺病毒的全部基因组。
利用PCR方法，在质粒PXCI的基因551和552位间增加一个T，创造一个AgeI位点，质粒编号为PXCI-T。
合成下述引物5’ccgtgacaaggtaaacacaacacatcc 3’(SEQ ID NO4)5’ttaccggtcccaatggaggggaat 3’(SEQ ID NO5)以抽提的胎肝基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物约544bp(ErbB2受体基因的启动子)。该PCR产物经sspBI和AgeI酶解后，插入相同酶切的PXCI-T质粒的sspBI和AgeI位点之间，所得质粒称为PXCI-ErbB2P。
PXCI-ErbB2P和PBHG10共转染293(或911)细胞，空斑筛选，然后PCR鉴定确认重组病毒，获得重组腺病毒ad5ErB2P。
实施例2构建具有裂解肿瘤细胞功能和特异性诱导针对ErbB2受体过表达肿瘤细胞的T细胞免疫反应的重组腺病毒在本实施例中，在删去腺病毒基因组的E3区中的全部基因，仅保留ADP编码区，从而构建裂解肿瘤细胞功能的腺病毒。然后将热休克蛋白-抗原性肽的表达盒插入腺病毒，构建得到特异性诱导针对ErbB2受体过表达肿瘤细胞的T细胞免疫反应的腺病毒(参见图1，下方中间)。
2.1构建E3区仅保留ADP编码区的质粒质粒PBHG11购自Microbix Biosystems(Toronto，Canada)。
用XbaI完全酶切并用BamHI部分酶切质粒PBHG11，分离14kb片段，然后用Klenow酶补平，用连接酶连接，形成质粒PBHG64。获得的PBHG64含有自核苷酸21562至35935位、除E3区(28133-30818bp)之外Ad5腺病毒的全部基因。
合成下述引物5’ aaccatggcccgggcagggtataac 3’(SEQ ID NO6)5’atcgatcagtcgtagccatccgc 3’(SEQ ID NO7)以质粒PBHG11DNA为模板，PCR扩增得到约290bp的DNA片段(腺病毒E3区早期启动子)。PCR产物经NcoI酶切后，插入质粒pGEM-5Z(Promega公司)的NcoI/EcoRv位点，得到载体pGEM5P。
合成下述引物5’ aaatcgatgaccaacacaaccaacg 3’(SEQ ID NO8)5’ aactcgaggaatcatgtc 3’(SEQ ID NO9)以腺病毒ad5(野生型)基因组DNA为模板，PCR扩增得到约310bp扩增产物(腺病毒ADP片段)。PCR产物经C1aI酶解，插入载体pGEM5P的ClaI/EcoRv位点，得到质粒pGEM5adp。
合成下述引物5’ ctcgagttaattaatttaaatgtccagtttattcagcagc 3’(SEQ ID NO10)5’tccgtgtcatatggatacac 3’(SEQ ID NO11)以腺病毒Ad5(野生型)基因组DNA为模板，PCR扩增得到约220bp扩增产物(即腺病毒E3区基因表达所需的下游序列)。PCR产物用XhoI和NdeI酶切后，插入相同酶切的pGEM5adp，得到质粒pGEM5adpSN。
用SrfI和NdeI，从质粒pGEM5adpSN中双酶切下目的片段，然后将其插入PBHG64的SrfI和NdeI位点之间，得到质粒PBHGadpSN。
2.2构建含表达盒的质粒利用Promega公司商品质粒pCI-vector，分别在BamHI位点BglII位点连接人工接头gatcttaattaa(SEQ ID NO12)和gatcatttaaat(SEQ ID NO13)，得到质粒pCIPS。
合成下列引物
aacttaagatgaagatctttgggagcctggcatttctggctcgtgcggtcgggatcgac(SEQID NO14)(融合有ErbB2 369T细胞抗原的Hsp70上游引物，含Bst98酶切位点)aagcggccgctcatcagccgagccggggtg(SEQ ID NO15)(含NotI酶切位点)用常规方法，抽提结核分枝杆菌H37RV(ATCC36801)基因组DNA，作为模板。用上述引物进行PCR，扩增得到PCR产物(即编码“ErbB2的T细胞表位369+结核分枝杆菌Hsp70”的编码序列)。
扩增产物经Bst98和NotI酶解，插入质粒pCIPS的Bst98I和NotI位点，经测序确认，得到质粒pCIPSEr2h369。
将质粒pCIPSEr2h369经PacI/SwaI酶解所得的片段，插入PBHGadPSN的PacI和SwaI位点之间，得到质粒PBIadeh369。
2.3构建重组腺病毒分离实施例1中的重组病毒ad5ErB2P，经SpeI酶解，分离出左臂。将该左臂与质粒PBIadeh369共转染293细胞。空斑筛选重组腺病毒，并PCR鉴定，获得的腺病毒命名为ad5E2Peh369。
实施例3构建具有裂解肿瘤和能诱导针对ErbB3受体过表达肿瘤细胞Th-细胞免疫反应的重组腺病毒在本实施例中，用类似于实施例2的方法，构建含另一融合蛋白(即牛结核分枝杆菌Hsp65和人ErbB3部分抗原的融合蛋白)表达盒的重组腺病毒。该腺病毒能裂解肿瘤细胞，并能诱导针对ErbB3受体过表达肿瘤细胞Th-细胞免疫反应。方法如下3.1构建含牛结核分枝杆菌Hsp65和人ErbB3部分抗原的融合基因的质粒合成以下引物5’ccttaagatggactgcgtggcagagggcaaagt(SEQ ID NO16)5’ggggagcctcgagaatttgcccatatggccaagacaattgcgt(SEQ ID NO17)5’aagcggccgctcagaaatcatccatgccaccca(SEQ ID NO18)以常规方法提取的牛结核分枝杆菌基因组DNA和常规方法制备的人胎肝cDNA为模板，用上述3个引物进行重叠PCR，扩增获得编码ErbB3部份抗原和牛结核分枝菌的热激蛋白65的融合基因。
对扩增产物经测序确认后，经Bst98和NotI酶切，插入质粒pCIPS(实施例2)的Bst98和NotI位点，得到质粒pCIPSer3D4h。
然后用PacI和SwaI酶解pCIPSer3D4h，分离重组片段插入PBHGadpSN的PacI和SwaI位点，所得质粒PBTade3D4h。
3.2构建重组腺病毒分离实施例1中重组腺病毒ad5ErB2P，经speI酶解，分离左臂。将该左臂和PBTade3D4h共转染293细胞。空斑筛选重组腺病毒，并经PCR鉴定，获得的重组腺病毒为ad5E2Pe3D4h。
实施例4构建特异性感染ErbB2高表达肿瘤细胞的重组腺病毒在本实施例中，将神经调节蛋白的编码序列插入腺病毒的纤丝蛋白编码区，从而构建得到特异性感染ErbB2高表达肿瘤细胞的重组腺病毒(参见图1，下方右侧)。方法如下4.1构建含神经调节蛋白-纤丝蛋白的融合基因的质粒用XbaI和PacI酶切PBHG10(Microbix Biosystems)，分离小片段，用Klenow酶补平末端，T4DNA连接酶连接，获得质粒pXT1。质粒pXT1含腺病毒终端(30819-35935)的全部基因。
合成以下述引物5’gtgtatccatatgacacggaa 3’(SEQ ID NO19)5’ctgtaacactaaccattacactaagccatcttgtaaaatgt 3’(SEQ ID NO20)5’caaaactacgtaatggccagcactccaagtgcatactctatg 3’(SEQ ID NO21)5’tattcctgcaggacggagcgg3’(SEQ ID NO22)用上述4个引物，同时以人胎肝cDNA和腺病毒基因组DNA为模板，通过双重迭PCR，扩增得到神经调节蛋白-纤丝蛋白的融合基因。该融合基因编码纤丝蛋白和神经调节蛋白(neuregulin)结合结构域的融合蛋白。
扩增产物经测序确认后，经NdeI/SfbI酶解后插入相同酶切的pXT1质粒以置换原NdeI/SfbI片段，得到质粒pXT1NG。
4.2构建重组腺病毒将实施例2中制备的腺病毒ad5E2Peh369经NdeI部份水解，分离大片段作为左臂。将该左臂和pXT1NG共转染已用ErbB2转化过的293细胞，空斑筛选重组腺病毒载体。PCR鉴定后，获得腺病毒WYad5EB2369。
用相同程序，将实施例3中制备的腺病毒ad5E2Pe3D4h经NdeI部份水解，分离大片段作为左臂。将该左臂和pXT1NG共转染用ErbB2基因转化过的293细胞，空斑筛选重组腺病毒载体。PCR鉴定后，获得腺病毒WYad5E3D4。
实施例5构建具有肝细胞特异表达β-干扰素和能诱导针对乙肝病毒T-细胞免疫活性的重组腺病毒在本实施例中，将融合蛋白(牛结核分枝杆菌Hsp65+乙肝抗原)的表达盒插入重组腺病毒基因组DNA。为了增强免疫治疗效果，还将β-干扰素表达盒插入腺病毒DNA，从而获得具有肝细胞特异表达β-干扰素和能诱导针对乙肝病毒T-细胞免疫活性的重组腺病毒。
5.1构建插入β-干扰素表达盒和融合蛋白表达盒的质粒合成下述接头tatcga(SEQ ID NO23)和ttaatttaaa(SEQ ID NO24)，分别插入载体PIRES2-EGFP(Clontech公司)的AseI和AflII位点，得到载体PIRES2-EGFPCS。
合成下述引物ttgctagcatga ccaacaagtgtct(含NheI位点)(SEQ ID NO25)aaggatcctcagtttcggaggtaacctgta(含BamHI位点)(SEQ ID NO26)以人胎肝cDNA为模板，PCR扩增人β干扰素基因。
合成以下引物ttccatggcaacacttccggaaactactgttgttagacgagccaagacaattgcgtacgac(融合有乙肝核心T-抗原表位的Hsp65上游引物，含NcoI酶切位点)(SEQ ID NO27)aagcggccgctcagaaatccatgccacccat(含NotI酶切位点)(SEQ ID NQ28)用上述引物，以牛结核分枝杆菌的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得融合基因。该融合基因编码乙肝抗原和Hsp65的融合蛋白。
将上述两个扩增产物经测序确认后，分别插入PIRES2-EGFPCS的NheI/BamHI和NcoI/NotI位点，得质粒PIRESHBCH。
用ClaI和SwaI酶切质粒PIRESHBCH，将分离的目的片段置换质粒pBHGadpSN的原ClaI-SwaI片段，得到质粒PBTadIBHc(该质粒用于产生具无溶细胞的功能的重组腺病毒)。
同时，质粒PIRESHBCH经PacI和SwaI酶切，将分离的目的片段置换质粒pBHGadpSN的原PacI-SwaI片段，得到质粒PBTadIBHcPS(该质粒用于产生具有溶细胞的功能的重组腺病毒)。
5.2构建用乙肝病毒启动子置换E1区早期启动子的的质粒合成下述引物5’gcgccggcgcacctctctttacgc 3’(SEQ ID NO29)5’caggtaccccccgctcagatgggtttcttcgctccatgccccaaagccaccc 3’(含KpnI酶切位点)(SEQ ID NO30)以乙肝基因组DNA为模板，PCR扩增得到HBV核心启动子区约400bp的片段。PCR产物经SgrAI和KpnI酶解后，插入质粒PXCI，以置换原ad5 DNA第187-2049位的片段，得到质粒称为PXCΔE1ACpE1B。
5.3构建重组腺病毒将质粒PXCΔE1ACpE1B和PBTadIBHc共转染293细胞，空斑筛选，然后PCR鉴定确认重组病毒，获得重组腺病毒WYad5HBc。该腺病毒在感染乙肝病毒细胞中特异性增殖。
将质粒PXCΔE1ACpE1B和PBTadIBHcPS共转染293细胞，空斑筛选，然后PCR鉴定确认重组病毒，获得重组腺病毒WYad5HBcPS。该腺病毒在感染乙肝病毒细胞中特异性增殖，并同时裂解感染乙肝病毒的肝细胞。
实施例6分离纯化融合蛋白在本实施例中，在CHO细胞中的瞬时表达目的融合蛋白，然后分离纯化。方法如下按常规方法分别分离纯化质粒PCIPSEr2h369(实施例2，编码融合蛋白ErbB2369-Hsp70)、PCIPSer3D4h(实施例3，编码融合蛋白“ErbB3D4-Hsp65”)、PIRESHBCH(实施例5，编码融合蛋白HBCl41Hsp65)。
用纯化的质粒，通过脂质体法(Gibco公司)分别转化COS7细胞。培养48小时后，分离裂解COS7细胞，取裂解液20μl经SDS-page电泳后转移到PVDF膜，经5％脱脂奶粉，37℃封闭。加抗-HSP65抗体(CalBiochem公司)或抗-HSP70抗体(Antigenics公司)，4℃过夜，次日加入二抗和发光剂，压片，确认融合蛋白。经扫描和蛋白浓度测定，融合蛋白的表达约300-400ng/ml。同时，利用FPLC法纯化，得到下述3种融合蛋白。
表1融合蛋白的表达量
实施例7动物模型中测试免疫治疗作用取FVB/N雌鼠和57BL/6雄鼠交配的第一代鼠，原位接种106个小鼠乳腺癌细胞。
将荷瘤小鼠分为六组，每组8只。按表2所示，分别注射BSA(阴性对照)、Ag和Hsp的混合物，阿霉素(阳性对照)。试验组注射低剂量Ag-Hsp融合蛋白，高剂量Ag-Hsp融合蛋白，以及Ag-Hsp融合蛋白和adDNA混合物。
接种时，每两天一次，连续注射14次，30天后解剖小鼠称瘤重。所得结果和分析列于表2-3。
表2 药物对肿瘤的抑制作用
注Ag为人工合成的ErbB2-369肽(序列为KIFGSLAFL SEQ ID NO33)，和ErbB3D4肽(序列为DCVAEGKVCDPLCSSGGCWGPGPGQCLSCRNYSRGGVCVTHCNFLNGEPREFAH，SEQ ID NO32)的摩尔比为1∶1混合物。
Ag-Hsp为ErbB2369-Hsp70(SEQ ID NO1)和ErbB3D4-Hsp65(SEQ ID NO3)的混合物。
adDNA为实施例2制备的腺病毒ad5E2Peh369的DNA。
表3药物对肿瘤的抑制作用
实施例8重组腺病毒对乙肝感染的治疗作用将纯化的实施例5中制备的重组腺病毒WYad5HBc的DNA，直接注射到6-8周龄的BALB/c小鼠股四头肌内。每只小鼠用100ug DNA(浓度为100ug/100u1)免疫，每隔三周免疫一次，共三次。然后分离脾脏细胞，培养并用乙肝核心抗原刺激。
结果，出现了明显的T细胞增殖，并对HBc基因转染的靶细胞P815有明显的杀伤作用(67.4％±15.1％)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
<110>张，聪慧<120>特异性治疗肿瘤或胞内感染的疫苗及应用<130>027469<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>560<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Ala Arg Ala Val Gly Ile1 510 15Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val Ser Val Leu Glu Gly Gly Asp20 25 30Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile35 40 45Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys50 55 60Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg Thr Val Arg Ser Val Lys Arg65 70 75 80His Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr85 90 95Ala Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala100 105 110Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr Asp Ala Val Ile Thr Thr Pro115 120 125Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gln130 135 140Ile Ala Gly Leu Ash Val Leu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala145 150 155 160Ala Pro Gly Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gln Arg Ile Leu165 170 175Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile180 185 190Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn His Leu
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<220>
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(9)<223>抗原性肽ErbB2-369<400>31Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu1 5<210>32<211>54<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(54)<223>抗原性肽ErbB3D4
<400>32Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly1 5 10 15Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr20 25 30Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu35 40 45Pro Arg Glu Phe Ala His50
权利要求
1.一种重组病毒载体，其特征在于，该病毒的基因组中插入热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒，所述的表达盒依次包括启动子序列、热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白编码序列和终止密码子。
2.如权利要求1所述重组病毒载体，其特征在于，所述的病毒载体选自腺病毒、腺病毒相关病毒、新域疫病毒、呼肠孤病毒、Sindbis病毒、或痘病毒。
3.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述的病毒载体是腺病毒，且在腺病毒基因组E3区位置插入了所述的表达盒。
4.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述的热休克蛋白选自Hsp70、Hsp65、Hsp110、或gp96。
5.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述的抗原性肽是肿瘤抗原或病原体抗原。
6.如权利要求5所述的重组病毒载体，其特征在于，所述的抗原性肽选自乙肝核心抗原T细胞表位、ErbB2的T细胞表位、ErbB3的Th细胞表位结构域、CEA表位、PSA表位、WT表位、HPV的E6表位、HPV的E7表位、HBV的表面抗原、HBV核心抗原、或其组合。
7.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述的热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白表达盒编码具有SEQ ID NO1、2或3所示氨基酸序列的融合蛋白。
8.一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的表达热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白的重组病毒载体和药学上可接受的赋形剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的病毒载体选自腺病毒、腺病毒相关病毒、新域疫病毒、呼肠孤病毒、Sindbis病毒、或痘病毒。
10.一种热休克蛋白-抗原性肽的融合蛋白，其特征在于，它具有SEQ IDNO1、2或3所示氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种重组病毒载体，在该病毒的基因组中插入热休克蛋白－抗原性肽的融合蛋白表达盒，所述的表达盒依次包括启动子序列、热休克蛋白－抗原性肽的融合蛋白编码序列和终止密码子。该病毒可选择性地感染和裂解肿瘤细胞或胞内微生物感染细胞，同时过量表达肿瘤或感染微生物的特异性抗原的融合蛋白，从而有效激发免疫应答反应。
文档编号A61K39/12GK1517437SQ0311490
公开日2004年8月4日 申请日期2003年1月15日 优先权日2003年1月15日
发明者张聪慧 申请人:张聪慧