具放射性的含砷化合物的制法及其用于肿瘤治疗的用途的制作方法

专利名称：具放射性的含砷化合物的制法及其用于肿瘤治疗的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具放射性的含砷化合物的制法以及该具放射性的含砷化合物用于诸如血液癌或实体瘤的肿瘤/癌症的治疗的用途。特别地，将选自三氧化二砷(As2O3)、三硫化二砷(As2S3)、二硫化二砷(As2S2)及它们的组合的含砷化合物引至中子照射处理，从而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化成为具放射性的砷同位素。该具放射性的含砷化合物可被配制成药物组合物来供于诸如血液癌或实体瘤的肿瘤/癌症的治疗。
背景技术：
肿瘤/癌症一直是人类健康的威胁者。多年来，医药界致力于研发有效的药物以用于治疗肿瘤/癌症。但是，目前于临床上，仍尚未有任何一种药物可以到达有效治疗肿瘤/癌症的功效，尤其是在与肝肿瘤相关的疾病[例如，肝细胞癌]上。
现今对于转移性或局部治疗失败的肝癌细胞疗法，大多是施行经导管动脉栓塞术(transcatheteral arterial embolization，TAE)或经皮酒精注射法(percutaneous ethanol injection)；或是采用全身性化疗，例如使用阿霉素、高剂量的他莫昔芬合并阿霉素或者联合化疗[顺铂+5-氟尿嘧啶(5-FU)+甲酰四氢叶酸，简称PFL]等。虽然这些抗癌药物的缓解率可达15至30％，大多数的肝癌患者由于常伴随有肝硬化和/或其它并发症[例如白血球下降、血小板下降或肝功能代偿失调的情况，而不能适用全身性化疗。因此，化疗无法有效地延长肝癌患者的整体存活期。而自1990年起，砷剂在肿瘤/癌症的治疗上提供另一个研究发展的方向。
在传统的中医药典籍或西方医药典籍中，砷剂都占有一席之地。中医(Traditional Chinese Medicine，TCM)中的含砷药物主要为砒霜(Arsenic)、雄黄和雌黄等。这些含砷药物在中医典籍上被记载为具有剧毒性，所以必须以微量来使用以达到疗效。
砒霜(汉语拼音为PISHUANG，英文为Arsenic或Arsenolite)又有中文别名为「砒石」、「白砒」、「信石」，其为砷石(Arsenicumsablimatum)经升华而得的精制品，所含主要化学成分是三氧化二砷(As2O3)。砒霜(As2O3)为白色粉末，无臭、无味，能溶于水、乙醇、酸类及碱类，加热则升散而发蒜臭。砒霜的功用为化痰平喘、截疟杀虫、蚀疮去腐，主治赛痰哮喘、疟疾痔漏、瘀腐瘰、痈疽腐肉。
雄黄(汉语拼音为XIONGHUANG，英文为Realgar)又有中文别名为「明雄黄」、「雄精」、「腰黄」，其为硫化物类雄黄族矿物雄黄的矿石，所含主要化学成份为二硫化二砷(As2S2)。雄黄的功用为燥湿、祛风、杀虫、解毒，主治疥癣、秃疮、痈疽、走马牙疳、缠腰蛇丹、破伤风、蛇虫螫伤、腋臭、哮喘、惊痫痰涎、痔瘘、喉痹等。
雌黄(汉语拼音为CIHUANG，英文为Orpimentum)是硫化物类矿物雌黄(Orpiment)的矿石，其所含主要化学成份为三硫化二砷(化学式为As2S3)。雌黄的功用为燥湿、杀虫、解毒，主治疥癣、恶疮、蛇虫螫伤、癫痫及寒痰咳喘、虫积腹痛等。
自1990年起，中国大陆开始有人进行三氧化二砷或是含雄黄成分的「复方青黛片(Composite Indigo Naturalis Tablet)」用于治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的研究，并相继发表有关三氧化二砷的基础药理研究与临床医学研究。自此，三氧化二砷重新受到医学界广泛的重视。
曾有文献报导，经由静脉注射给予三氧化二砷(10mg/d)给患有复发性急性早幼粒细胞白血病的病患，可以达到90％的完全缓解率(complete remission，CR)(Shen ZX等，Blood(1997)，893354)。另有文献报导，除了三氧化二砷之外的其它含砷物质，例如，含有As2S2的「复方青黛片」和纯质的四硫化四砷(As4S4)，可分别达到98％和84.9％的完全缓解率(Wang ZY.，Cancer Chemother Pharmacol(2001)，48(suppl 1)S72-S76)。
又有临床研究指出，对于患有复发性急性早幼粒细胞白血病的病患，以静脉注射给予低剂量的三氧化二砷(0.08mg/kg/日)治疗历时28天以后，CR可达80％，并可减轻三氧化二砷所造成的副作用(诸如肠胃不适、颜面水肿和心脏毒性等等)(Shen Y等，Leukemia(2001)，15735-741)。
另有文献报导，对于复发性或对于全-反式-视黄酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)具抗药性的APL患者，三氧化二砷与其它药物(例如GM-CSF)的组合使用可以产生加乘性治疗效果(Muto A等，Leukemia(2001)，15(8)1176-1184)。
近年来，医学界已逐渐探索出三氧化二砷在APL的治疗上的作用机制。依据文献报导，三氧化二砷对于APL细胞株的抑制作用的可能机制是在高浓度下(0.5至2μmol/L)会激活细胞凋亡，而于低浓度下(0.1至0.5μmol/L)会诱导细胞分化(Chen GQ等，Blood(1997)，893345)。
于2002年，Miller等人于Cancer Research(2002)，623893-3903中提出三氧化二砷的可能作用机制，而这些作用机制会造成细胞凋亡的诱发、生长与血管发生的抑制以及分化的促进，而因为三氧化二砷会影响如此多种的细胞与生理途径，各种不同的恶性肿瘤，包括血液癌与实体瘤在内，也许可以给予使用三氧化二砷的治疗。
于2001年，美国的国家卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)进行三氧化二砷在血液癌及实体瘤的癌细胞株的临床试验，并于报告中指出，三氧化二砷可抑制多种癌细胞株的生长，并促进癌细胞株的细胞凋亡。在血液癌疾病的临床试验方面，除了急性早幼粒细胞白血病之外，尚包括急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征以及多发性骨髓瘤等。而在实体瘤的临床试验方面，包括前列腺癌、子宫颈癌以及膀胱癌等(Murgo AJ，The Oncologist(2001)，6(suppl2)22-28)。
美国食品与药品管理局(FDA)于2000年9月核准三氧化二砷当作孤儿药上市，以用于治疗急性早幼粒细胞白血病。中国台湾卫生署于2002年1月核准台湾东洋药品公司上市一种三氧化二砷药学制剂(卫署罕药制第000005号，中文名称为「砷定注射剂」，英文名称为「ASADIN Injection」)。
近几年来在中国大陆有关使用三氧化二砷来治疗实体瘤的研究亦逐渐发展。有研究报导指出，利用罹患肝肿瘤的小鼠的动物模型来进行三氧化二砷的药效评估，结果显示，2mg/kg的三氧化二砷连续给药10天，可使小鼠的生命延长率达到127.2％(林晨等人，“三氧化二砷抗肿瘤作用的研究”，中国中药杂志(1999)，24(3)1-3)。
国际专利申请案WO 99/24029(对应于CN 1285743A)揭示用于治疗多种白血病、淋巴瘤和实体瘤的方法，其包括给予患者治疗有效量的三氧化二砷或一种有机砷剂(organic arsenical)，亦即硫胂密胺，并且可以组合使用其它治疗剂[例如，化疗剂、辐射防护剂、放射治疗剂(radiotherapeutics)]或其它医疗技术，以改善病患的生活品质。而且，该案所用的药物组合物为无菌溶液，适用于静脉内注射或输注，亦可适用于口服给药、局部或经皮给药，而该无菌溶液的配制涉及到特定pH值的调整。
在肿瘤/癌症的治疗上，除了化疗之外，自1898年居礼夫妇发现放射性镭元素(226Ra)以后，放射线开始被应用于医学领域以供疾病的诊断、治疗，特别是癌症(例如皮肤癌、鼻咽癌等)的治疗。二次世界大战结束以后，由于核子科学研究的发展，使科学家更了解放射线对于生物体的影响，更加改善了放射线治疗的方法与技术，并提升癌症病患的生存率与存活时间，同时也减低放射线对于正常组织的副作用。
内放射核种治疗法(internal radionuclide therapy，IRT)的作用原理是利用适当的放射性药剂(radiopharmaceutics)而将高辐射剂量递送至被标的的疾病组织并避开正常组织。为了选择性定位，对于疾病组织具专一性的离子或分子被用来作为治疗用放射核种(therapeuticradionuclide)的载体，或者可溶性与微粒子放射性药剂被区域性地引入，以提高摄入或将放射性药剂限制在一身体腔室内。
要供医疗用途使用的放射核种必须能放射出具有高线性能量转移(linear energy transfer，LET)的放射线，来破坏恶性以及其它快速增殖的细胞族群。放射核种包括(1)会放射β粒子的放射核种，(2)会放射α粒子的放射核种，以及(3)会经由电子俘获(electron capture，EC)与内转换(internal conversion，IC)而衰变并导致俄歇电子与C-K电子的放射的放射核种。β粒子在毫米(mm)的范围内，而因此对于大型肿瘤有效。α粒子在50-100μm的范围内，因此对于小型肿瘤以及微小转移(micrometastases)有效。因为俄歇电子与C-K电子在＜0.1μm的范围，会放射俄歇电子与C-K电子的放射核种仅在其能跨越细胞膜进入至细胞核内以破坏DNA时才有效。
以上所述是参考Meral Tayan Ercan and Meltem Caglar，CurrentPharmaceutical Design(2000)，61085-1121此篇回顾性论文。于此篇论文的表1与表2中列出多种放射核种，包括32p、67Cu、76As、89Sr、90Y、131I、153Sm、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re以及198Au、211At、212Bi以及213Bi，其中131I是被最广为应用的治疗用放射性药剂，并供用于治疗甲状腺癌与甲状腺功能亢进。于此篇回顾性论文的表3内还提到一些放射核种被制备成特定形式的治疗用放射性药剂以供特别的应用。但是，此篇回顾性论文没有提到诸如三氧化二砷、三硫化二砷与二硫化二砷的含砷化合物可否被制造成治疗用放射性药剂。
2002年，Yong-Jin Chun等人于FEBS Letter，(2002)，519195-200中报导，在体内与体外实验中，三氧化二砷会使人类子宫颈癌细胞对于离子化辐射更为敏感，而且使用三氧化二砷的化疗以及离子化辐射线疗法这两种疗法的组合，对于子宫颈癌的治疗会产生协同效果。
以上所提到的所有文献、专利前案以及当中所引述的文献的全部揭露内容在此被并入本案以作为参考资料。

发明内容
为开发可有效治疗肿瘤/癌症的药物，申请人尝试结合药物化疗与放射疗法，而提供一种用于制备具放射性的含砷化合物的方法，其包括下列步骤(i)将选自三氧化二砷(As2O3)、三硫化二砷(As2S3)、二硫化二砷(As2S2)及它们的组合的含砷化合物引至中子照射处理，从而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化成为具放射性的砷同位素；以及(ii)回收由步骤(i)所形成的产物。
本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的该具放射性的含砷化合物以及药学可接受的载体。依据本发明的药物组合物可供应用于诸如血液癌或实体瘤的肿瘤/癌症的治疗上，且相较于现有的以三氧化二砷为主的抗癌药物(诸如那些被揭示于上述专利案或文献内者)，有更为显著的疗效。


下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其它目的与特征，可借由参照下文的描述、随文所附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中图1显示经中子照射处理后的三氧化二砷内所含砷元素75As(n，γ)76As的伽马能谱；图2显示依据本发明的具放射性的三氧化二砷，经由尾静脉及肝动脉注射后，于不同时间在大鼠体内肿瘤中的分布情况；以及图3显示依据本发明的具放射性的三氧化二砷，经由尾静脉及肝动脉注射后，于不同时间在大鼠体内各器官中的分布情况。
具体实施方案在第一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含(a)治疗有效量的具放射性的含砷化合物，该具放射性的含砷化合物由包括下列步骤的方法制得(i)将选自三氧化二砷(As2O3)、三硫化二砷(As2S3)、二硫化二砷(As2S2)及它们的组合的含砷化合物引至中子照射处理，从而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化成为具放射性的砷同位素；以及(ii)回收由步骤(i)所形成的产物；以及(b)药学可接受的载体。
在第二个方面，本发明提供一种用以制备具放射性的含砷化合物的方法，其包括下列步骤(i)将选自三氧化二砷(As2O3)、三硫化二砷(As2S3)、二硫化二砷(As2S2)及它们的组合的含砷化合物引至中子照射处理，从而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化成为具放射性的砷同位素；以及(ii)回收由步骤(i)所形成的产物。
本案方法中所使用的中子照射处理可为本领域技术人员所详知的技术(例如，参见Samir C.Mehta和D.Robert Lu(1996)，Pharmaceutical Research，13(3)344-351)。就本发明而言，可将选定的含砷化合物放在原子反应器内，然后对该含砷化合物进行中子照射处理以引发核反应，因而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化。
在本发明的一个优选实施方案中，被用来进行中子照射处理的该含砷化合物是As2O3。
在本发明的一个优选实施方案中，由本案方法所生成的该具放射性的含砷化合物可发射γ粒子与β粒子。
在本发明的又一个优选实施方案中，由本案方法所生成的该具放射性的含砷化合物含有76As同位素。
在一个更优选的实施方案中，由本案方法所生成的该具放射性的含砷化合物是具有放射性的三氧化二砷，其可发射γ能量
以及β能量[1.75MeV(8％)，2.40MeV(35％)，2.96MeV(51％)]。76As的半衰期(T1/2)为26.5小时。
依据本发明的该具放射性的含砷化合物经测试后被证实具有抑制肿瘤细胞生长的活性，因此，本发明亦预期到该具放射性的含砷化合物在制备药物组合物上的应用。
于是，本发明还提供一种药物组合物，其包含(a)治疗有效量的由本案如上所述的方法而制得的具放射性的含砷化合物；以及(b)药学可接受的载体。
依据本发明，该药物组合物可供用于治疗肿瘤或癌症。优选地，该肿瘤或癌症选自血液癌(hematological malignancies)以及实体瘤。
优选地，该实体瘤选自乳癌、直肠癌、肝肿瘤、卵巢癌以及前列腺癌。更优选地，该实体瘤是选自肝细胞癌、胆管癌、肝细胞癌、肝细胞癌的纤维板层变体、肝内胆管癌、混合肝细胞胆管癌、未分化肝细胞癌、肿瘤侵入胆总管的肝脏肿瘤、肝母细胞瘤、童年期肝肿瘤以及原发性肝细胞癌的肝肿瘤。
优选地，该血液癌是白血病或淋巴瘤。更优选地，该血液癌选自急性早幼粒细胞白血病(APL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征以及多发性骨髓瘤。
依据本发明，术语“治疗有效量”是指当一种含有放射性物质的药物组合物被给予需要该组合物来治疗的哺乳动物时，足以提供所欲达致的治疗功效且不会对非标的组织或器官产生非所欲的严重辐射危害的用量。该治疗有效量会视不同的因素而变化，这些因素包括，例如，病症的种类，要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况以及反应，药物的给药途径等。此治疗有效量可为本领域技术人员来决定。
依据本发明的药物组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适于非经肠道的、口服的或局部给药的形式，例如，溶液剂、胶囊剂、分散体(dispersion)、混悬剂等等。
优选地，依据本发明的药物组合物被制造成适于注射用的形式，例如粉末针剂(powder injection)、注射用冻干产品、乳化针剂(emulsioninjection)、油性针剂(oily injection)、脂质体针剂等形式。
依据本发明，术语“药学可接受的载体”是指本领域所详知的适用于药物制造的载体，这包括，但不限于，水、生理盐水、甘油、有机溶剂、稳定剂、螯合剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、胶凝剂、脂质体等等。
依据本发明的药物组合物的给药剂量与给药次数会视下列因素而变化要被治疗的疾病的严重性，给药途径，以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，依据本发明的药物组合物的每日给药剂量通常是0.01至0.6mg/Kg体重，呈单一剂量或是分成数个剂量的形式，且可被非经肠道地、口服地或局部地给药。优选地，依据本发明的药物组合物是经由连续静脉内注射、局部动脉单一注射、局部肿瘤直接注射等方式被给药。
依据本发明的药物组合物可被每天给药历时最多60天的期间或是直到出现缓解，继而再给予2至10个额外疗程，每次历时5-60天。
在本发明的一个优选实施方案中，该具放射性的含砷化合物是经中子照射过的三氧化二砷，且其被制造成呈水性注射液的形式。在一个更优选的实施方案中，该水性注射液由适量的该具放射性的三氧化二砷、乙二胺四乙酸二钠盐、缓冲溶液以及水所构成。
在一个优选的实施方案中，该水性注射液的放射活性范围为2至4mCi/ml。在一个更优选的实施方案中，该水性注射液的放射活性范围为2.77至3.25mCi/ml。
在一个优选的实施方案中，对于肝肿瘤患者，依据本发明的药物组合物可藉由肝动脉单一注射及肝肿瘤直接注射方式来给药，更优选的为采用肝肿瘤直接注射方式。
依据本发明的药物组合物可被单独地给药，或是与其它用于治疗肿瘤/癌症的治疗药物或治疗方法来组合使用，所述治疗药物包括，但不限于，阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇(taxol)、氮芥、5-氟尿嘧啶、长春花碱与全-反式-视黄酸。所述治疗方法则包括化疗和外部光束放射疗法(external beam radiation therapy)。
本发明将以下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明使用，而不应被解释为本发明在实施上的限制。
优选实施例的详细说明1.动物来源于下面实验中，使用分别购自于国立阳明大学动物中心以及国家科学委员会动物中心的雄性Spawn Dawley大鼠(5周大，150g)。这些大鼠于购入后被饲养于行政院原子能委员会核能研究所动物室，并于固定温度、湿度以及光周期下来饲养。饲养期间，不限制水与饲料的供给，一周固定更换垫料二次。
2.肿瘤细胞来源被用来建立带有肝肿瘤的动物模型的肿瘤细胞是购自于美国典型培养物保藏中心[American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108 USA]的大鼠肝肿大细胞N1-S1(hepatoma cell N1-S1)，其经连续过代培养而建立主细胞库(Master CellBank)以及工作细胞库(Working Cell Bank)。
实施例1.具放射性的三氧化二砷的制备将5mg的三氧化二砷粉末(可得自于台湾东洋药品公司)置入石英管(Quartz glass，Tosiba，Japan)中，并以瓦斯/氧气混合焰将石英管的管口完全封闭。石英管以铝箔包裹后被置入照射专用铝管照射靶内，并在会使所形成的产物具有放射活性为2-4mCi的操作条件下进行中子照射处理历时30小时。
照射后的石英管用切割工具予以切开，并将3ml的1N NaOH溶液添加至被切开后的石英管内以溶解As2O3。20分钟以后，加入1ml1N HCl溶液，最后加入1ml生理食盐水，来将溶液浓度调整为1mg/ml。对于所得到的含有经中子照射的三氧化二砷的溶液，使用多频道脉冲分析仪(Multi-channel Analyzer，MCA)来进行伽马能谱分析。
以相同方式将未经中子照射处理的三氧化二砷配制成浓度也是1mg/ml的溶液，并在后面的动物实验中当作对照组来使用。
结果图1显示含有经中子照射过的三氧化二砷的溶液的伽马能谱分析结果。同时，下面表1显示该经中子照射过的三氧化二砷内所含砷元素的核能数据(nuclear data)。本实施例的结果显示，三氧化二砷在原子反应器内经中子照射后会引发核反应，而产生具有放射性的核种，除了可发射γ能量
，还会放射出β能量[1.75MeV(8％)，2.40MeV(35％)，2.96MeV(51％)]。因此，经中子照射过的三氧化二砷应可供应用于肿瘤/癌症的治疗(可以杀死癌细胞)。
表1.经中子照射过的三氧化二砷内所含砷元素的核能数据 实施例2.带有肝肿瘤的动物模型的建立操作方法被用来建立带有肝肿瘤的动物模型的肿瘤细胞是购自于美国典型培养物保藏中心[American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA]的大鼠肝肿瘤细胞株N1-S1(rathepatoma cell line N1-S1)，其经连续过代培养而建立主细胞库以及工作细胞库。
大鼠肝肿瘤细胞N1-S1是悬浮型细胞，其被散浮于添加有1％青霉素(GibcoBRL)与10％胎牛血清(GibcoBRL)的依思可夫氏改良的杜贝可氏培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，IMDM)(GibcoBRL)内，并于含5％CO2的37℃恒温培养箱内进行培养。
在培养至1.5×106细胞/ml时，取出4×106细胞/0.06ml的N1-S1细胞，经由外科手术植入至雄性大鼠(Spawn Dawley，5周大，150g)的肝脏及肝脏脏器包膜之间，并将伤口缝合。继续饲养大鼠10天后，以超声扫描检测是否有肝肿瘤的生长并检测肿瘤的大小。经扫描后，生长出肝肿瘤的动物将被拿来进行肿瘤生长抑制实验使用，而其余动物则予以安乐死。
结果以第2、7及9等三代的N1-S1大鼠肝癌细胞来进行肝肿瘤动物模型的建立，所得到的比较结果显示于下面表2中。
表2.被植入不同代数的N1-S1细胞的大鼠的肿瘤生长机率

将第9代的N1-S1大鼠肝癌细胞植入至5周大的大鼠的肝脏内，在10天后，大鼠生成肝肿瘤的机率约为30％。以第7代的N1-S1大鼠肝癌细胞植入至5周大的大鼠的肝脏内，在10天后，大鼠生成肝肿瘤的机率约为35％。将第2代的N1-S1大鼠肝癌细胞植入至5周大的大鼠的肝脏内，在10天后，大鼠生成肝肿瘤的机率约为70％。
在本实验开始时，使用第9代的肝肿瘤细胞株，肝肿瘤的生成机率约为30％，且肿瘤的生长状况不佳。改用第2代的细胞株来植入至大鼠体内后，肝肿瘤的生长机率提高为70％，且生长状况优选。因此本实验发现，肝肿瘤细胞N1-S1细胞株植入至大鼠体内10天后，并非全数都可长出肝肿瘤，而且肝肿瘤生长的机率颇低；长有肝肿瘤之后，肿瘤有可能在无任何药物治疗下被大鼠自体吸收而缩小甚至消失。
由此判断，继代培养次数较少的细胞株，其细胞尚未改变型态且状况优选也较为稳定，大鼠生成肝肿瘤的机率也因此大为提升。此外，当使用继代培养次数较少的细胞株，大鼠在生成肝肿瘤后若不给予药物治疗，大鼠体内的肿瘤会持续生长，最后导致大鼠因癌症转移及产生腹水而死亡。
本实验以大鼠所建立的肝肿瘤动物模式是属于稳定的动物模式，但在选用细胞株时最好使用继代培养次数少于5次的细胞株，以维持肿瘤细胞的生长状态。
实施例3.生物分布试验(Biodistribution test)肝动脉注射经由外科手术将大鼠的肝动脉血管与肝组织剥离，并将PE-10管(PE-10 tube)插入至肝动脉内，再予以注入实施例1所制备的含有经中子照射处理的三氧化二砷的测试注射液；注射后将PE-10管抽出，并以手术用线将血管封绑固定，继而缝合伤口。
尾静脉注射以25号针头的注射器直接由大鼠的尾静脉注入实施例1所制备的含有经中子照射处理的三氧化二砷的测试注射液。
操作方法罹患肝肿瘤的大鼠分别由肝动脉及尾静脉予以注射一定量的如实施例1所制备的具放射性的三氧化二砷(放射活性范围为2.77～3.25mCi/ml，浓度为1mg/ml，动物注射剂量为0.45mg/kg)。
于注射后，分别在2小时、4小时、16小时、24小时及48小时，大鼠以大量心脏采血被处死，并取出血液、心脏、肺、肝、脾、肾、小肠、膀胱、肌肉及肿瘤，且将这些器官分别放置于试管中，以伽马计数器(γcounter，Wallac 1470 WIZARD)来计数放射线强度，并利用标准曲线回归法来校正每克器官内所含三氧化二砷含量百分比。每一实验组及时间点各有2或3只实验动物。
将部分器官组织(血液、肾脏及肝脏)送至核能研究所进行电感耦合等离子体质谱(ICP-MAS)，以观察三氧化二砷于肿瘤以及体内各器官内的生物分布情况。
结果三氧化二砷对于人类各种恶性肿瘤的疗效及作用代谢途径目前已广泛被研究与讨论，然而其在生物体内的生物分布仍不清楚。
本实验显示，分别由大鼠的肝动脉及尾静脉注射具放射性的三氧化二砷之后，分别于第2、4、16、24及48小时观察该具放射性的三氧化二砷在肿瘤及体内各器官内的分布情况。第2图显示依据本发明的具放射性三氧化二砷，经由尾静脉及肝动脉注射后，于不同时间在大鼠体内肿瘤中的分布情况。第3图显示依据本发明的具放射性三氧化二砷，经由尾静脉及肝动脉注射后，于不同时间在大鼠体内各器官中的分布情况。
具放射性的三氧化二砷分别从尾静脉(I.V.)及肝动脉(I.H.)注射至大鼠体内，计算剂量以MIRD方法，并使用软件Excel来计算出各器官及肿瘤的滞留时间，最后运用MIROSE3软件来算出各器官及肿瘤内的辐射吸收剂量，结果如下面表3所示。
表3.放射性三氧化二砷分别从尾静脉(I.V.)及肝动脉(I.H.)注射至动物体内，各器官及肿瘤的辐射吸收剂量

放射性三氧化二砷从肝动脉注射及尾静脉注射的辐射吸收剂量分别为21mGy/MBq和4.26mGy/MBq，两者相差5倍之多，而其它器官包括肺、脾、肾、肝等则相近似。
由肝动脉来注射该具放射性的三氧化二砷，在第2小时至第4小时之间，该具放射性的三氧化二砷在肝肿瘤中的含量达到最高峰，并明显地高于由尾静脉注射的实验组所得结果。对于采用肝动脉注射的实验组而言，在注射4个小时以后，该具放射性的三氧化二砷在肝肿瘤内的含量向下滑落并达到平衡。而对于采用尾静脉注射的的实验组而言，在注射4个小时以后，该具放射性的三氧化二砷在肝肿瘤内的含量有缓缓上升的趋势。对于这两个采用不同注射方式的实验组，该具放射性的三氧化二砷在肝肿瘤内的含量于第16个小时后达到相同的平衡值(图2)。
以ICP-MAS分析血液、肾及肝内的三氧化二砷含量，所得结果(未示出)和使用放射线分析测得的生物分布试验有相同的趋势。
藉由肝动脉及尾静脉注射后第4个小时，在所测试的器官当中，膀胱及尿液内所含有的该具放射性的三氧化二砷含量仅次于肿瘤中的含量。心脏、肺脏及脾脏内所含有的该具放射性的三氧化二砷含量皆维持在一定的范围内(1～3％ID/g)(图3)。
再者，于48小时之后，该具放射性的三氧化二砷于所有器官内的累积量都下降(图3)，而IV和IH注射给药的结果很接近(图2)。这些结果应可支持含有该具放射性的三氧化二砷的药物组合物可适用全身性给药途径。
另外，本实验显示，不论注射的方法为何，肿瘤能够蓄积三氧化二砷的程度呈一定值，而且不论采用何种注射方法，三氧化二砷在心、肺及脾都有一定程度的蓄积。三氧化二砷及放射线皆有可能对这些组织器官造成伤害，因此，可进一步将本案具放射性的三氧化二砷配制于适当载体内，以便能够更专一性地停留在肝肿瘤而又不会对周遭的组织器官造成伤害或是使伤害减少。
实施例4.疗效评估试验A.连续静脉内注射将带有肝肿瘤的大鼠分别由尾静脉注射以生理盐水、含有未经中子照射处理的三氧化二砷的注射液(浓度1mg/ml，动物注射剂量0.45mg/kg)以及实施例1所制备的含有经中子照射处理的具放射性三氧化二砷的注射液(放射活性范围为2.77～3.25mCi/ml，浓度1mg/ml，动物注射剂量0.45mg/kg)，持续注射2周。
于注射前，先以超声扫描来检测肿瘤的大小，并于开始注射后第一周、第二周及第五周分别进行超声扫描检测，以观察肿瘤大小变化。最后，将动物处死，以观察是否有肿瘤转移的现象。
B.肝动脉单一注射经由外科手术将大鼠的肝动脉血管与肝组织剥离，并由肝动脉分别注入以生理食盐水、含有未经中子照射处理的三氧化二砷的注射液(浓度1mg/ml，动物注射剂量0.45mg/kg)以及实施例1所制备的含有经中子照射处理的具放射性三氧化二砷的注射液(放射活性范围为2.77～3.25mCi/ml，浓度1mg/ml，动物注射剂量0.45mg/kg)，单一注射一次。
于注射前，先以超声扫描以检测肿瘤的大小，并于开始注射后第一周、第二周及第五周分别进行超声扫描检测，以观察肿瘤大小变化。最后，将动物处死，以观察是否有肿瘤转移的现象。
C.肝肿瘤直接注射对带有肝肿瘤的大鼠进行外科手术，在找到肿瘤的位置后，分别于肿瘤上直接注射以生理食盐水、含有未经中子照射处理的三氧化二砷的注射液(浓度1mg/ml，动物注射剂量0.45mg/kg)以及实施例1所制备的含有经中子照射处理的具放射性三氧化二砷的注射液(放射活性范围为2.77～3.25mCi/ml，浓度1mg/ml，动物注射剂量0.45mg/kg)，每周注射一次，共注射二次。
于注射前，先以超声扫描以检测肿瘤的大小，并于开始注射后第一周及第四周分别进行超声扫描检测，以观察肿瘤大小变化。最后，将动物处死，以观察是否有肿瘤转移的现象。
结果A.连续静脉注射下面表4显示采用尾静脉连续注射的实验结果。
表4.由尾静脉连续注射以生理食盐水、三氧化二砷、具放射性的三氧化二砷之后，大鼠的肝肿瘤大小变化以及生存时间

注肿瘤大小增加(In％)归类为反应不佳；肿瘤大小减少0％～40％归类为反应尚可；肿瘤大小减少50％以上或肿瘤消失，归类为反应优良。 +带有肝肿瘤的大鼠经由尾静脉注射以生理食盐水，于第8天时即有大鼠开始死亡，经解剖后，皆发现有腹水的现象，肿瘤的大小也较第一次超声检测时为大。没有死亡的大鼠于注射后第5周作超声检测，肿瘤亦比注射后第一周时的超声检测结果为大。至注射后第八周时，所有注射以生理食盐水的大鼠皆已死亡，经解剖都没有发现转移的现象。
对于经由尾静脉被注射以未经中子照射处理的三氧化二砷的大鼠，于注射后第一周使用超声检测，肿瘤皆有扩大的现象，第二周肿瘤则有缩小的趋势，至第五周时肿瘤并没有太大的改变，而未因麻醉死亡的大鼠至第八周时仍存活。
对于经由尾静脉被注射以经中子照射处理的三氧化二砷的大鼠，于注射后第一周肿瘤呈现生长的状态，但第二周后肿瘤渐有缩小的趋势，至第五周测量时，肿瘤大小虽较注射后第一周时为大，但小于注射后第二周时检测的大小，此组别的大鼠至八周时仍全数存活。
虽然在注射生理食盐水的实验组中，有些大鼠的肿瘤于第二周即呈现小幅缩小的状况，但其寿命皆短于注射三氧化二砷或注射具放射性的三氧化二砷的组别，经解剖后发现，其肿瘤皆深入生长至肝组织中，因此，以超声检测平面肿瘤大小时，虽然肿瘤呈现小幅缩小，但实际上肿瘤却有增长的趋势并造成动物腹水死亡，故而寿命短于接受三氧化二砷(抗癌药物)和本案具放射性的三氧化二砷(放射性药物)治疗的组别。此外，在接受注射三氧化二砷治疗的实验组中，有些动物于第二周死亡，死因为麻醉过量，解剖后发现其肿瘤并没有转移现象或异状，存活的动物再继续给予三氧化二砷，然而，三氧化二砷抑制肿瘤生长的效果并不显著。
本实验显示，在连续尾静脉注射第一周的疗程中，三氧化二砷以及本案具放射性的三氧化二砷对于肿瘤生长尚未出现抑制肿瘤生长的效果，各组动物体内的肿瘤皆呈现生长的趋势；而于疗程的第二周起，药物对于肿瘤才开始有抑制的效果，其中被注射以本案具放射性的三氧化二砷的大鼠体内的肿瘤生长受抑制的状况最为显著。由此结果研判，第一周药物治疗时，药物尚未对肿瘤产生反应，于第二周持续给药后，药物对于肿瘤才有抑制生长及缓解作用，但肿瘤尚无法完全消失。
B.肝动脉单一注射下面表5显示采用肝动脉单一注射的实验结果。
表5.由肝动脉单一注射以生理食盐水、三氧化二砷、放射性三氧化二砷之后，大鼠的肝肿瘤大小变化以及生存时间

注肿瘤大小增加(In％)归类为反应不佳；肿瘤大小减少0％～40％归类为反应尚可；肿瘤大小减少50％以上或肿瘤消失，归类为反应优良。 +++由肝动脉单一注射生理食盐水、三氧化二砷以及本案具放射活性的三氧化二砷后，对于注射食盐水的实验组，注射五周后肝肿瘤的大小显著大于注射后第一周的肿瘤大小，并有动物于注射后第二周死亡；对于注射三氧化二砷的实验组，部分动物在注射后第五周肿瘤的大小较注射后第一周稍小，部分动物的肿瘤仍为生长的状况；对于注射本案具放射活性三氧化二砷的实验组，部分动物于注射药物第二周时，肿瘤即缩小或消失，其余动物于注射后第五周肿瘤皆消失及缩小。
直接由肝动脉单一注射三氧化二砷的疗效并不理想，虽然有部分动物有肿瘤缩小的现象，但程度都不是很大。而由肝动脉单一注射本案具放射性的三氧化二砷，在注射后第二周即有动物的肿瘤完全消失且其余动物的肿瘤也有立即缩小的趋势，由此结果研判，由肝动脉单一注射具放射性的三氧化二砷时，放射线能够立即破坏肝肿瘤细胞及组织。
C.肝肿瘤直接注射下面表6显示采用肝肿瘤上直接注射的实验结果。
表6.直接由肝肿瘤单一注射生理食盐水、三氧化二砷、具放射性的三氧化二砷之后，大鼠的肝肿瘤大小变化以及生存时间

注肿瘤大小增加(In％)归类为反应不佳；肿瘤大小减少0％～40％归类为反应尚可；肿瘤大小减少50％以上或肿瘤消失，归类为反应优良。
+单一由肝肿瘤上直接注射生理食盐水、三氧化二砷及本案具放射性的三氧化二砷后，对于注射生理食盐水的实验组，在注射四周后肝肿瘤的大小显著大于注射后第一周的肿瘤大小；对于注射三氧化二砷的实验组，部分动物在注射后第四周肿瘤的大小较注射后第一周的肿瘤稍小，部分动物的肿瘤仍为生长的状况；对于注射本案具放射性的三氧化二砷的实验组，至注射后第四周，所有动物的肿瘤皆缩小。所有动物至计划结束日仍存活。由此研判，在肝肿瘤上直接注射放射性药物时，放射线能够立即破坏肝肿瘤细胞及组织，而此一结果与由肝动脉单一注射放射性药物时的情况相似。
从上面三个疗效评估试验可以归纳出I.持续由静脉注射具放射性的三氧化二砷能有效地抑制肝肿瘤生长，并延长罹患肝癌动物的生存时间；由尾静脉注射无放射性的三氧化二砷，缓解肝肿瘤的效能较小，但也能延长罹患肝癌动物寿命；II.由肝动脉或肝肿瘤单一注射具放射性的三氧化二砷，能立即对肿瘤造成伤害而使肿瘤不再生长，进而缩小且消失；由肝动脉或肝肿瘤单一注射无放射线的三氧化二砷，疗效较差；以及III.具放射性的三氧化二砷以肝动脉注射至动物体内的肝肿瘤辐射吸收剂量是尾静脉注射所得结果的五倍。
虽然本发明已藉由上述详细说明以及优选实施例来予以阐释，本发明不应被解释为受这些实施例所限制；相对地，本发明实质涵盖，当本领域技术人员从本案发明说明书所揭示的技术内容与实施来考量时，可以做出的多种其它不同等效变化及与修饰。因此，在不偏离本发明的精义下，大凡依本发明权利要求书及发明说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物包含(a)治疗有效量的具放射性的含砷化合物，该具放射性的含砷化合物由包括下列步骤的方法制得(i)将选自三氧化二砷(As2O3)、三硫化二砷(As2S3)、二硫化二砷(As2S2)及它们的组合的含砷化合物引至中子照射处理，从而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化成为具放射性的砷同位素；以及(ii)回收由步骤(i)所形成的产物；以及(b)药学可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中该具放射性的含砷化合物可发射γ粒子与β粒子。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中该具放射性的含砷化合物含有76As同位素。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于其中该具放射性的含砷化合物为经中子照射处理过的As2O3。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物被制成呈注射剂型的形式。
6.一种用以制备具放射性的含砷化合物的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(i)将选自三氧化二砷(As2O3)、三硫化二砷(As2S3)、二硫化二砷(As2S2)及它们的组合的含砷化合物引至中子照射处理，从而使该含砷化合物中所包含的砷元素被转化成为具放射性的砷同位素；以及(ii)回收由步骤(i)所形成的产物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于其中由步骤(ii)所回收的产物可发射γ粒子与β粒子。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于其中由步骤(ii)所回收的产物含有76As同位素。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于其中用于步骤(i)中的该含砷化合物为As2O3。
10.一种用于治疗肿瘤或癌症的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含(a)治疗有效量的一种由权利要求6所述的方法制得的具放射性的含砷化合物；以及(b)药学可接受的载体。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于其中该肿瘤或癌症选自血液癌以及实体瘤。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于其中该实体瘤选自乳癌、直肠癌、肝肿瘤、卵巢癌以及前列腺癌。
13.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于其中该肝肿瘤选自肝细胞癌、胆管癌、肝细胞癌、肝细胞癌的纤维板层变体、肝内胆管癌、混合肝细胞胆管癌、未分化肝细胞癌、肿瘤侵入胆总管的肝脏肿瘤、肝母细胞瘤、童年期肝肿瘤以及原发性肝细胞癌。
14.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物被制成注射剂型的形式。
15.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于其中该具放射性的含砷化合物可发射γ粒子与β粒子。
16.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于其中该具放射性的含砷化合物为经中子照射处理过的As2O3。
17.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于其中该具放射性的含砷化合物含有76As同位素。
全文摘要
本发明提供一种用于制备具放射性的含砷化合物的方法，其包括下列步骤(i)将选自三氧化二砷(As
文档编号A61P35/00GK1539507SQ0312297
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月23日 优先权日2003年4月23日
发明者李德伟, 黄纯莹, 吴明烜, 陈德容, 张国平, 张湘戎, 祈式仪, 张志贤, 许银茂, 范国贤, 徐维荃, 傅应凯, 高长风 申请人:台湾东洋药品工业股份有限公司