专利名称：用于预防和治疗淀粉样变性的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和/或治疗淀粉样变性的药物。
背景技术：
淀粉样变性是指一组疾病，其中具有β-折叠结构的蛋白质聚集形成称为淀粉样蛋白的不溶性纤维(淀粉样蛋白)，其沉积在体内并导致组织损伤。德国病理学家Virchow发现淀粉样变性的组织样品经碘染成紫色。从这个结果，Virchow认为已沉积在组织上的物质是多糖，将其命名为“淀粉样物质”，即“淀粉样蛋白”，并且提议将由淀粉样蛋白沉积导致的病理疾病称为淀粉样变性。通过随后的研究，已经发现淀粉样蛋白的主要组分是形成其纤维的蛋白质，并且淀粉样蛋白包含血清淀粉样蛋白P组分，粘多糖等。目前，将淀粉样蛋白定义为“包含非支化的宽8-15nm的纤维聚集物，其被刚果红染料染成橙红色，并且当在偏光显微镜下检测时显示亮绿色双折射”。
由淀粉样蛋白引起的疾病，即淀粉样变性，包括各种疾病，如阿尔兹海默氏病，克罗伊茨费尔特-雅各布综合征(疯牛病)，亨廷顿舞蹈病或遗传性疾病。具体地，引起注意的家族性淀粉样多数神经病(familial amyloidpolyneuropathy)(FAP)是淀粉样变性的一种形式，其特征在于在器官如外周神经、植物性神经、肾、皮肤和粘膜的全身性淀粉样蛋白沉积，并且通过常染色体显性遗传显示基因渗入。自从在1952年首次于葡萄牙报道一例FAP，类似的病例报道已经遍布世界各地。导致FAP的淀粉样蛋白纤维由一种血清蛋白-运甲状腺素蛋白(TTR)的一个突变体组成，正常的TTR通常以四聚体存在，而突变体TTR已经显示低的结构稳定性，并且可能经历从四聚体到单体的结构改变。
在我们国家相对高发生率的一种形式的FAP是I型FAP，其具有作为病因蛋白的Val30Met型的突变体TTR。一般认为突变体TTR蛋白在结构稳定性方面低于正常TTR蛋白，并且其分子内的β-折叠结构彼此联合形成不溶性淀粉样蛋白纤维并沉积在组织中。I型FAP的主要症状是伴随从较低末端侧面对称上升的感觉紊乱和自律紊乱(交互腹泻和便秘，直立性低血压，排尿困难等)的多重神经机能病；这些均是由起因于淀粉样蛋白的神经损伤所导致。随后，在心脏，肾脏和消化道中淀粉样蛋白沉积变得相当多，并且导致这些器官的功能紊乱。由于未进行去处曾经沉积的淀粉样蛋白纤维的彻底治疗，FAP是一种预后不佳的疾病，其在20-30年的后一半时间发展，在10年的时间导致丧失行走能力，由于感染性疾病，心力衰竭，肾机能不全等在10-20年的时间内导致死亡，并且其是由卫生健康部指定为规定疾病的一种难治疗疾病。
当前，尽管FAP的治疗主要通过症状疗法来进行，但也采纳肝移植作为可能是最针对病因的疗法。这是一种基于期待通过用产生正常TTR的供体肝脏代替患者的肝脏来终止疾病进程的疗法，因为最初的TTR产生器官是肝脏。然而，由于对供体施加了额外的负担使得该疗法不是普遍适用的疗法。
本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗淀粉样变性的药物。具体地，本发明的目的是提供一种预防和/或治疗家族性淀粉样多数神经病(FAP)的药物，和提供一种预防由淀粉样变性引起的感觉紊乱和自律紊乱的药物，和能够阻止上述感觉紊乱和自律紊乱进展等的用于治疗的药物。
发明内容
本发明人进行了广泛的研究实现了上述目的，并且发现了包含三价铬离子的化合物如脂肪酸铬盐具有作为预防和/或治疗淀粉样变性药物的杰出作用，并且完成了本发明。
因此，本发明提供了一种预防和/或治疗淀粉样变性的药物，其包括作为活性组分的含有三价铬离子的化合物。在本发明的一个优选实施方案中，提供了其中淀粉样变性是家族性淀粉样多数神经病(FAP)的上述药物，其中含三价铬离子的化合物是脂肪酸铬盐的上述药物，和其中脂肪酸是吡啶甲酸的上述药物。
从另一个观点出发，本发明提供了一种抑制淀粉样变性中突变体运甲状腺素蛋白分解的药物，其包括作为活性组分的含有三价铬离子的化合物，和一种稳定淀粉样变性中突变体运甲状腺素蛋白的药物，其包括作为活性组分的含三价铬离子的化合物。在本发明的优选实施方案中，提供了一种作为由铝离子促进的运甲状腺素蛋白前体分解反应抑制剂的上述药物，其中淀粉样变性是家族性淀粉样多数神经病(FAP)的上述药物，其中含三价铬离子的化合物是脂肪酸铬盐的上述药物，和其中脂肪酸是吡啶甲酸的上述药物。
同样，本发明提供了一种突变体运甲状腺素蛋白分解抑制剂，其包含作为活性组分的含三价铬离子的化合物，和一种突变体运甲状腺素蛋白稳定剂，其包含作为活性组分的含三价铬离子的化合物。
从另一个观点出发，本发明提供了含三价铬离子的化合物生产上述药物的应用，一种预防和/或治疗淀粉样变性的方法，其包括一个步骤，其中将预防和/或治疗有效量的包含三价铬离子的化合物给予包括人的哺乳动物，和一种抑制突变体运甲状腺素蛋白在淀粉样变性中分解的方法，其包括一个步骤，其中将预防和/或治疗有效量的含三价铬离子的化合物给予包括人的哺乳动物。
作为本发明药物的活性组分，可以使用一种或两种或多种含三价铬离子的化合物。尽管不限制包含三价铬离子的化合物种类，但优选化合物是例如脂肪酸盐，使得其容易从胃肠道吸收。作为形成盐的脂肪酸的实例，优选容易通过体内代谢途径代谢的丁酸，吡啶甲酸，丙酮酸等，但不应解释为限制于此。其中，最优选无毒、胃肠道吸收速率快的吡啶甲酸。同样，作为本发明的药物，也可使用包括含三价铬离子的化合物的任选的混合物。这种混合物的实例包括如天然产品提取物和啤酒发酵滤饼的混合物。
本发明的药物可用作预防和/或治疗淀粉样变性的药物。作为施用本发明药物的淀粉样变性的实例，可以提及神经变性疾病，如阿尔兹海默氏病，牛海绵状脑病(BSE)，克罗伊茨费尔特-雅各布综合征(CJD)，laughingdeath syndrome，瘙痒病，人中不同的克罗伊茨费尔特-雅各布综合征等以及家族性淀粉样多数神经病(FAP)。其中，家族性淀粉样多数神经病是本发明药物的特别适合的靶目标。
尽管没有理由遵循任何具体的理论，可如下解释本发明药物的作用机制。运甲状腺素蛋白(TTR)，一种血清蛋白，在血清中作为四聚体蛋白存在，该四聚体通过未鉴定的催化剂或酶等的作用分解为单体。这些单体的大多数被分解，其中的一些进入到体内代谢途径，并作为尿排泄到体外；一些单体经历重排形成β-折叠结构，该β-折叠结构线性聚合产生不溶性纤维性的淀粉样蛋白纤维。突变体运甲状腺素蛋白倾向于从四聚体蛋白分解成单体；结果，淀粉样蛋白纤维生产增加。
本发明人研究了淀粉样蛋白纤维从运甲状腺素蛋白生产的机制，并证实了不发展FAP的个体的存在，尽管它们具有突变体运甲状腺素蛋白。因此，在上述淀粉样蛋白纤维生产中涉及环境因素的思想的基础上，本发明人确定在淀粉样蛋白纤维生产过程中极大地涉及环境因素之外的金属离子。例如，如实施例所示，铝离子具有促进将运甲状腺素蛋白四聚体分解成单体的反应的作用。另一方面，三价铬离子具有抑制分解运甲状腺素蛋白四聚体以产生单体的反应的作用；结果，通过抑制从突变体运甲状腺素蛋白生产淀粉样蛋白纤维的反应可预防和/或治疗淀粉样变性。
例如，对于已发展FAP的患者中显示轻微症状的患者，可以通过给予本发明的药物阻止症状的进展和恶化。存在一些病例，其中即使在表现严重症状的患者中也可期待治疗作用。同样，具有突变体运甲状腺素蛋白的个体是极可能随着年老发展FAP的潜在患者；可以通过给予本发明的药物防止FAP的发作。
作为本发明的药物，作为活性组分的含三价铬离子的化合物可以原样使用，然而，通常，可以制备和使用药物组合物的剂型是理想的，所述药物组合物包括作为活性组分的含三价铬离子的化合物或含有它的混合物和一种或两种或多种用于制备药物的添加剂。
在预防和治疗FAP过程中，本发明的药物不仅联合使用三价铬离子，而且联合使用非甾族抗炎药物同样是理想的，所述非甾族抗炎药物稳定运甲状腺素蛋白四聚体，例如二氟尼柳。
作为适于口服给药的药物使用组合物的实例，可以提及片剂，胶囊，粉末，细颗粒，颗粒，液体和糖浆等；作为适于胃肠外给药的药物组合物的实例，可以提及注射液，点滴，栓剂，吸入剂，滴眼剂，滴鼻剂，软膏，霜剂，膏药，可透皮吸收剂或可透粘膜吸收剂等。作为用于制备上述药物组合物的添加剂的实例，可以提及填料如乳糖和寡糖，崩解剂或崩解助剂，粘合剂，润滑剂，涂层剂，染料，稀释剂，底物，溶剂或增溶剂，等渗剂，pH调节剂，稳定剂，推进剂和粘附剂等；这些可以由本领域的普通技术人员根据药物组合物的剂型适当地选择，也可以两种或多种联合使用。
作为本发明药物的优选形式，可以提及片剂。片剂直径约为2-10mm，厚度约为1-5mm；活性组分的含量可以是每100重量％片剂，0.01重量％或更多，优选0.1-10重量％。注意，作为包含吡啶甲酸铬的药物，例如“不含酵母的吡啶甲酸铬”是可商购自Vitamin World公司(NY，美国)的片剂形式的营养补充剂；该片剂也可原样用作本发明的药物。
对本发明药物的剂量和给予频率等不进行限制，可以根据情形如患者年龄，体重和性别和疾病的种类和严重程度，预防或治疗的目的等适当地选择。通常，在口服给药的情形中，对于成年人，每天约0.01g-1g的剂量作为活性组分的量；上述剂量可以每天分几次给予。
附图简述
图1是显示本发明的药物具有抑制从运甲状腺素蛋白四聚体分解为运甲状腺素蛋白单体的作用的附图，而且另一方面，铝具有促进分解的作用。
图2是显示本发明的药物具有抑制从正常运甲状腺素蛋白四聚体分解为运甲状腺素蛋白单体和抑制淀粉样蛋白纤维生产的作用的附图。
图3是显示本发明的药物具有抑制从突变体运甲状腺素蛋白四聚体分解为运甲状腺素蛋白单体和抑制淀粉样蛋白纤维生产的作用的附图。
图4是显示本发明的药物具有增加从运甲状腺素蛋白四聚体到运甲状腺素蛋白单体结构转变过程中热稳定性的作用的附图。
图5是显示本发明的药物用于增加从运甲状腺素蛋白四聚体到运甲状腺素蛋白单体结构转变过程中热稳定性和即使在动摇运甲状腺素蛋白四聚体结构的酸性条件下稳定运甲状腺素蛋白四聚体结构的附图。
图6是显示本发明的药物具有增加突变体运甲状腺素蛋白四聚体结构体内稳定性的作用的附图。
图7是显示本发明的药物具有协同甲状腺激素通过运甲状腺素蛋白抑制淀粉样蛋白纤维生产的作用的附图，其稳定运甲状腺素蛋白四聚体。
图8是显示本发明的药物具有协同甲状腺激素通过运甲状腺素蛋白抑制淀粉样蛋白纤维生产的作用的附图，其稳定重组体运甲状腺素蛋白四聚体。
图9是显示本发明的药物具有协同抗炎药物二氟尼柳通过运甲状腺素蛋白抑制淀粉样蛋白纤维生产的作用的附图，其稳定运甲状腺素蛋白四聚体。
实施本发明的最佳方式以下通过实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围绝非限制于下述实施例。
(1)淀粉样蛋白纤维生产试验使用纯化自作为含运甲状腺素蛋白溶液的人血清的运甲状腺素蛋白，通过电泳证实其纯度。将含运甲状腺素蛋白的溶液(10mg/mL)溶解在缓冲液中以获得0.2mg/mL的浓度，并添加氯化铬(80μg/mL)。使用氢氧化钠或盐酸将缓冲液的pH调整至每个实验所需的pH。在37℃下温育上述溶液以生产淀粉样蛋白纤维。
(2)测量生产的淀粉样蛋白纤维的量使用甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐(Thioflavine)T(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)，其选择性结合聚集的β-折叠的荧光素探针，测量生产的淀粉样蛋白纤维的量。作为测量样品，稀释温育后含运甲状腺素蛋白的溶液以获得2.5μg/mL浓度的运甲状腺素蛋白，补充以10μM甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T和50mM甘氨酸，调整至pH9.0并使用。在制备测量样品后的1分钟内，使用1ml样品，用荧光分光光度计F-4500在25℃测量450nm激发光激发的482nm的荧光。注意，对于激发侧和荧光侧，均用5nm的缝宽进行测量。
(3)测量运甲状腺素蛋白四聚体和运甲状腺素蛋白单体的数量比通过凝胶分离色谱分离运甲状腺素蛋白四聚体和运甲状腺素蛋白单体，浸没在考马斯亮蓝染料中，并检验颜色显色强度。同样，对于其中将添加到用于温育的溶液中的金属化合物从氯化铬改为氯化铝的比较例和对于未用氯化铬配制的对照进行测量。同样，除了用80μg/mL氯化铬和80μg/mL氯化铝(氯化铬和氯化铝共存)代替添加到用于温育的溶液中的金属化合物以外，以相同的方式进行另一个试验。运甲状腺素蛋白四聚体和运甲状腺素蛋白单体的荧光强度和数量比的测量结果示于图1。
(1)测量在存在三价铬离子的条件下运甲状腺素蛋白热稳定性的改变使用不同的扫描热量计，测量在三价铬存在的条件下，在从运甲状腺素蛋白四聚体到运甲状腺素蛋白单体的结构转变过程中热稳定性的改变。作为测量样品，使用制备含有运甲状腺素蛋白的溶液，其是使用含500μM氯化铬和20mM磷酸盐缓冲液的150mM氯化钠来制备以获得25μM的浓度。使用氢氧化钠或盐酸将缓冲液的pH调整至对于每个实验所需的pH。通过将1.5ml样品溶液注射于在室温下排气5分钟后的测量隔室来进行测量。测量条件涉及在15℃-115℃温度范围内在1℃/分钟的扫描速率下，使用MicroCal生产的MC-2型差异扫描热量计；在测量过程中，用2atm的氮气对系统加压以防止由于热度而起泡。注意，对于每个样品，用浓硝酸洗涤测量隔室。热量和转变温度的测量结果示于图2和图3。
(1)将三价铬离子给予运甲状腺素蛋白转基因小鼠的试验通过每日腹膜内注射LD50数值的1/6剂量，即3.5μg氯化铬溶液/克小鼠重量，将三价铬离子给予转基因小鼠，所述转基因小鼠结合了具有运甲状腺素蛋白的第30个缬氨酸残基突变为甲硫氨酸残基的人突变体运甲状腺素蛋白基因。在开始给予的1周后，从尾静脉回收小鼠血液，并放于4℃过夜，分离血清组分并用作样品。
(2)测量运甲状腺素蛋白转基因小鼠的运甲状腺素蛋白四聚体稳定性使用蛋白印迹测量在从转基因小鼠血液中回收的60μg样品中运甲状腺素蛋白四聚体的稳定性。用于蛋白印迹的第一抗体是抗人突变体运甲状腺素蛋白抗体(1∶2000)；在第一抗体反应后，使用过氧化酶标记的抗兔第二抗体(1∶10000)进行第二抗体反应。对于检测抗体反应，使用ECL试剂。转基因小鼠的运甲状腺素蛋白四聚体的检测结果示于图4。
(1)淀粉样蛋白纤维生产试验将含运甲状腺素蛋白的溶液溶解在缓冲液中以获得0.2mg/mL的浓度，向每个溶液中添加0，10或50μM氯化铬和0或360nM甲状腺激素。使用氢氧化钠或盐酸将缓冲液的pH调整至每个实验所需的pH。将上述溶液在37℃温育以生产淀粉样蛋白纤维。
(2)测量生产的淀粉样蛋白纤维的量使用甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，测量生产的淀粉样蛋白纤维的量。作为测量样品，将温育后的含运甲状腺素蛋白的溶液稀释以获得2.5μg/mL的运甲状腺素蛋白浓度，补充以10μM甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T和50mM甘氨酸，调整至pH9.0，并使用。在制备测量样品后的1分钟内，使用1ml样品在25℃下用荧光分光光度计F-4500测量由450nm激发光激发的482nm处的荧光。注意对于激发侧和荧光侧，用5nm缝宽进行测量。荧光强度的测量结果示于图5。
(1)淀粉样蛋白纤维生产试验将含重组体运甲状腺素蛋白的溶液(10mg/ml)溶解在缓冲液中以获得0.2mg/mL的浓度，向每个溶液中添加0，10，100或500μM氯化铬和0或360nM甲状腺激素。使用氢氧化钠或盐酸将缓冲液的pH调整至每个实验所需的pH。将上述溶液在37℃温育以生产淀粉样蛋白纤维。
(2)测量生产的淀粉样蛋白纤维的量使用甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，测量生产的淀粉样蛋白纤维的量。作为测量样品，将温育后的含运甲状腺素蛋白的溶液稀释以获得2.5μg/mL的运甲状腺素蛋白浓度，补充以10μM甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T和50mM甘氨酸，调整至pH9.0，并使用。在制备测量样品后的1分钟内，使用1ml样品在25℃下用荧光分光光度计F-4500测量由450nm激发光激发的482nm处的荧光。注意对于激发侧和荧光侧，用5nm缝宽进行测量。荧光强度的测量结果示于图6。
(1)淀粉样蛋白纤维生产将含运甲状腺素蛋白的溶液溶解在缓冲液中以获得0.2mg/mL的浓度，向每个溶液中添加0，0.36，1或10μM二氟尼柳和0或10μM氯化铬。使用氢氧化钠或盐酸将缓冲液的pH调整至每个实验所需的pH。将上述溶液在37℃温育以生产淀粉样蛋白纤维。
(2)测量生产的淀粉样蛋白纤维的量使用甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，测量生产的淀粉样蛋白纤维的量。作为测量样品，将温育后的含运甲状腺素蛋白的溶液稀释以获得2.5μg/mL的运甲状腺素蛋白浓度，补充以10μM甲基脱硫氢对甲苯胺磺酸盐T和50mM甘氨酸，调整至pH9.0，并使用。在制备测量样品后的1分钟内，使用1ml样品在25℃下用荧光分光光度计F-4500测量由450nm激发光激发的482nm处的荧光。注意对于激发侧和荧光侧，用5nm缝宽进行测量。荧光强度的测量结果示于图7。
工业适用性本发明的药物用于作为预防和/或治疗淀粉样变性的药物，并且可特别用作对于除了症状疗法和肝移植以外没有可利用的疗法的家族性淀粉样多数神经病(FAP)的高效药物。
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗淀粉样变性的药物，其包含作为活性组分的含三价铬离子的化合物。
2.权利要求1的药物，其中所述淀粉样变性是家族性淀粉样多数神经病。
3.权利要求1或2的药物，其中所述包含三价铬离子的化合物是脂肪酸铬盐。
4.权利要求3的药物，其中所述脂肪酸是吡啶甲酸。
5.一种抑制淀粉样变性中突变体运甲状腺素蛋白分解的药物，其包含作为活性组分的含三价铬离子的化合物。
全文摘要
提供了一种用于预防和/或治疗淀粉样变性如家族性淀粉样多数神经病的药物。用于预防和/或治疗淀粉样变性的药物包含作为活性组分的含三价铬离子的化合物，如脂肪酸铬盐，并且能够抑制淀粉样变性中突变体运甲状腺素蛋白的分解。
文档编号A61K33/24GK1652803SQ03810780
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月13日 优先权日2002年5月14日
发明者甲斐广文, 安东由喜雄 申请人:尼普洛株式会社