蛋白质在水溶液中的稳定性的制作方法

专利名称：蛋白质在水溶液中的稳定性的制作方法
技术领域：
本发明与蛋白质在水溶液中的稳定性有关。
背景技术：
在单一小瓶内混合悬浮抗原的做法很具吸引力[1，2，3]，但由于不同成分混合后产生相互作用而导致问题，液体制剂尤其如此[4]。出现的问题包括抗原干扰、抗原竞争、抗原降解、抗原决定部位抑制和辅剂兼容性。混合剂的质量控制也比较困难。
不过，混合抗原并不一定有害。例如在产生免疫制剂中混合白喉、破伤风和百日咳(英文简称DTP)的抗原(使用整细胞(Pw)或无细胞(Pa)百日咳抗原)的做法已行之多年，实际上，在DTP进一步加入结合B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)(Hib)囊状多糖能加强对Hib成分产生的抗体反应。[5]。混合抗原来预防麻疹、流行性腮腺炎和风疹(英文简称MMR)也是常见的。
不过，产生免疫的药品，例如DTP、Hib，灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)B型肝炎病毒(HBV)等都有效能测验问题的报告[6]。曾有报告指出关于选择混合A型和B型肝炎病毒抗原[7]和Hib混合剂[8，9]的免疫助剂问题。例如，氢氧化铝是DTP抗原常用的免疫助剂，但Hib囊状多糖抗原在液体制剂中会被此盐水解[6，10]。
已知一种五价Hib+DTPw+HBV液体免疫配方的HBV成分的免疫反应由于混合制造而降低[11，12]，导致这一情况的可能原因是Hib和DTP成分协同抑制抗-HBV反应。反之，未有报告指出一种混合Hib+DTPa+polio+HBV的六价液体制剂配方的免疫性受不良的影响[13]。这种六价产品HEXAVACTM在欧洲已获核准在人体使用。
本发明的目标是改善(例如稳定性)液体混合疫苗和制造。尤其是改进包括HBV抗原在内的混合产品。

发明内容
本发明提供制造抗原混合物的工序，步骤如下(a)在酸性环境下使用磷化铝液混合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；(b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并(c)加入Hib-结合抗原至液体内。当吸附至磷化铝免疫助剂时，HBsAg的免疫性最佳，但当吸附至氢氧化铝或磷化铝时，Hib结合物会水解。本发明的工序的优点是制造一种HBsAg被吸附至磷化铝，而Hib-结合物却不为磷化铝所吸附的液体制剂。本工序提供高HBsAg吸附能力和整体稳定性。此外，本发明更提供一种包含磷化铝、HbsAg、白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原和Hib-结合抗原，其中HBsAg被吸附至磷化铝免疫助剂而Hib-结合抗原却不为铝免疫助剂所吸附。
混合抗原的顺序工序步骤(a)至(c)应以特定的顺序进行，即HBsAg比DTP抗原先加入磷化铝液内，Hib-结合物则在加入DTP抗原后才加入。
在步骤(b)，比较好的顺序是先加白喉抗原，然后加破伤风和百日咳抗原，但不一定要这样做。这样可支持白喉抗原吸附至铝免疫助剂。
破伤风和百日咳抗原可在步骤(b)内以任何顺序加入。
加入每一种抗原后，最好混合(例如搅拌)液体至少10分钟(例如约30分钟)。
pH和温度本发明工序的步骤(a)中，磷化铝和HBsAg是在液状中混合。这一步骤使HBsAg吸附至磷化铝免疫助剂。混合时，如果pH过低，HBsAg会变性。如果pH太高，HBsAg将不会吸附至磷化铝。
加入每一种抗原后，工序可能涉及调整pH的步骤。在步骤(a)加入HBsAg后，如必要，可调整pH至原来或与原来相似的pH。在步骤(b)加入个别的DTP后，可调整pH。步骤(b)后，并在步骤(c)加入Hib-结合抗原前，最好先调整pH大约至中性。
在步骤(c)加入Hib-结合抗原后，最好调整pH以便更适合病人使用。pH最好在7.0以下以预防白喉类毒素转化成有毒状态。因此，pH最好保持在6.2和6.9之间。
本发明的工序最好在15℃和30℃之间进行(例如在19℃和27℃，或在23±4℃)。
磷化铝本发明的工序基础是在液状混合抗原和磷化铝。一般都称这样的液状磷化铝为“溶液”，但从严格的物理化学角度来说，此盐在水中不溶化，并形成悬浮液。
磷化铝最好使用液状，以便加入HbsAg，并随后加入其它抗原。加入抗原混合物前，最好先稀释磷化铝至要求的浓度，确保有一个均匀的溶液。
加入HBsAg前Al3+的浓度通常在0和10mg/ml之间磷化铝液体可以含缓冲剂，但并非必要。
磷化铝液最好经过消毒。磷化铝不能采用过滤消毒，最好采用高压消毒法。
磷化铝液最好是无发热质。
磷化铝液也可含氯化钠。
B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的制剂已有充分的文书说明。多种形式的抗原已有说明(例如包括全部或部分pre-S序列；参考14的L*抗原；参考15所述的preS1-preS2-S缩多氨酸或参考16所述的类似物；参考17和18所述的‘逃跑突变体’，例如含Gly145→Arg突变的HBsAg)。上述任何一种都可以在本发明使用。
HBsAg可从血清或像酵母菌CHO细胞的真核压榨系统中压出[19]。最好是从酵母菌压出。
HBsAg通常是微粒状。最好从酵母菌榨出时就已成微粒状。
HBsAg可以灭活，例如使用甲醛溶液处理。
白喉抗原白喉抗原最好是白喉类毒素。白喉类毒素的制剂已有充分的文书说明[例如参考20的第3章；参考21的第9章]。可使用任何适合的白喉类毒素。
破伤风抗原破伤风抗原最好是破伤风类毒素。破伤风类毒素的制剂已有充分的文书说明[例如参考20的第4章；参考20的第18章]。可使用任何适合的破伤风类毒素。
百日咳抗原本发明使用的百日咳抗原可以是细胞(例如整个细胞)或非细胞抗原。两种抗原的制剂都有充分的文书说明[例如见参考201的第14章；也见参考22]。
使用无细胞抗原时最好使用百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，最好与附属肌动蛋白(又称为PRN或69kDa抗原)混合，并可选择性加入凝集原(又称菌毛)2和3[23]。每一疫苗剂量所含百日咳抗原的一般水平为10μg PT、5μg FHA、3μg PRN、5μg混合菌毛。
PT是一种有毒的蛋白质，当在百日咳抗原中存在时，最好加以解毒。解毒的方法可使用化学和/或基因法。最好的解毒突变体是9K/129G双突变体[24]，以下简称‘rPT’。
Hib-结合抗原一般的多糖结合物，尤其是B型流感嗜血杆菌(Hib)的制剂已有充分的文书说明[例如参考25 to 33等]。本发明可使用任何适合的Hib结合物。
结合物的糖部分可以是多糖(例如全长PRP)，但最好使用水解多糖(例如使用酸水解)形成低聚糖(例如从～1至～5kDa的MW)。如果进行水解，水解物可根据大小分类，以便排除低聚糖，这种糖太短，不能产生免疫功能。按大小分开的低聚糖是最好的糖类抗原。
结合物的载体部分通常是一种蛋白质。最好的载体蛋白质是细菌毒素或类毒素，例如白喉或破伤风类毒素。这些都是常用的结合疫苗。尤其最常用的是CRM197白喉类毒素[34，35，36]。其它适合的载体蛋白质包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白质[37]、合成缩氨酸[38，39]、热震蛋白质[40，41]、百日咳蛋白质[42，43]、流感嗜血杆菌的D蛋白质[44]、细胞活素[45]、淋巴因子[45]、荷尔蒙[45]、生长激素[45]、艰难梭状芽胞杆菌毒素A或B[46]等。也可以使用混合载体蛋白质。
可使用任何适当的激活化学和/或连接化学结合Hib糖。通常，在结合前，糖会先被激活或功能化。激活程序可能涉及，例如cyanylating试剂，如CDAP(例如1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate[47，48])。其它适当的技术使用碳化二亚胺、hydrazides、激活酯、降冰片烷、p-硝基苯甲酸、N-羟基丁二醯亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也请见参考49的简介)。
连接可通过使用任何已知的程序制造的连接组，例如参考50和51所述的程序。一种连接法涉及多糖的还原胺化，偶合所得氨基组与己二酸连接组的一端，然后偶合一个蛋白质至己二酸连接组的另一端[52，53，54]。其它的连接物包括B-丙醯胺基[55]、乙胺硝基苯酯[56]、卤代醯卤[57]、配糖键[58]、6-氨基己酸[59]、ADH[60]、C4至C12部分[61]等。除了使用连接物以外，可使用直接连接。直接连接至蛋白质的步骤可能包括氧化多糖，然后与蛋白质还原胺化，如参考62和63所述。
最好的结合法是通过己二酸琥珀双酯共价连接Hib糖至CRM197[64，65]。
本发明配方的特征本发明的工序的配方包含抗原，其中一些吸附在磷化铝免疫助剂。这些配方最好是产生免疫的配方。本发明的配方有预防性(即预防感染)或治疗性(即能治疗所感染后的疾病)功能。
配方最好是液体制剂(即非冻干配方)。这通常表示配方为液状，例如悬浮液。
本发明的成分最好经过杀菌消毒。磷化铝和完整细胞的百日咳抗原都不能使用过滤消毒，因此，本发明的成分最好使用高压消毒法和/或在制造时使用经过消毒的成分。
本发明的成分最好无发热质。
本发明的成分的pH是6.0和7.0之间。成分最好缓冲至这一pH。
本发明成分的Al3+浓度通常在0.1和2.0mg/ml之间。
成分可含氯化钠。配方内的氯化钠含量最好在0.1至100mg/ml之间。
HBsAg的含量通常是5和50μg/ml之间。最理想的含量是10和30mg/ml之间。
白喉类毒素的含量通常是5和50Lf/ml之间。最理想的含量是7.5和30Lf/ml之间。破伤风类毒素的含量通常是1和20Lf/ml之间。最理想的含量是2和9Lf/ml之间。细胞百日咳抗原的百日咳抗原通常是5和50OU/ml之间。最理想的含量是10和40OU/ml之间。
Hib-结合抗原的含量通常是1和50μg/ml之间。最理想的含量是10和30mg/ml之间。配方内可能含防腐药，例如硫柳汞。防腐药最好是低含量(例如容积的0.01％)。这可从外源加入，或是混合进配方内的主体抗原(例如在百日咳或HbsAg抗原内存在的防腐药)。不过，最好避免使用含水银的防腐药。
其它适合人体使用的成分在参考66内说明。
本发明的成分最好是尽量不含氢氧化铝。
本发明配方内含的抗原达‘有效地产生免疫的分量’，即该分量在人体使用时，无论是单一剂量或系列剂量的一部分，都能有效地治疗或预防疾病。这一分量视接受治疗者的健康和身体状况、年龄、接受治疗者的分类(例如非人类灵长、灵长等)、受治疗者免疫系统合成抗体的能力、所希望得到的保护程度、配方的程序、医生对病况的诊断和其它相关因素有所改动。预期分量范围广泛，并由常规试验确定。治疗剂量可使用单一剂量或多剂量(例如包括加强剂量)。本配方可与其它免疫调节剂并用。
通常，本发明的配方为注射制剂。本配方通常不经肠胃，直接注射体内(例如注射至皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织的间隙)。此外，本配方也可以在损伤的部位使用。一旦制成，本发明的配方可直接给受治疗者使用。受治疗者可以是动物；尤其是人类受治疗者。疫苗尤其适合为儿童和青少年进行免疫注射。
已知标准动物和试管模型和评估HBV、Hib和DTP产品的效力的相关保护。
抗原吸附在本发明的配方中，HBsAg吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是大部分完成，例如配方内的总HbsAg重量至少有80％已吸附(例如至少85％、90％、95％、98％、99％或更多)。白喉类毒素通常吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是部分完成，例如配方内的总白喉类毒素重量约有30-80％已吸附(例如约40％-70％、约50％-60％等)。如果储存在约37℃，白喉类毒素的吸附会随时间增加。
破伤风类毒素通常吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是部分完成，例如配方内的总破伤风类毒素重量40％以下已吸附(例如30％以下、20％以下、10％以下等)。破伤风类毒素的吸附水平可能约为0％。
Hib-结合物不吸附至铝免疫助剂。
治疗法使用本发明的配方可提高患者的免疫反应。
本发明提供的配方可作药剂使用(例如作为一种产生免疫的配方)。
此外，本发明也提供配方制造药剂来治疗和/或预防疾病。
这些方法或用法可保护免受HBV、白喉杆菌、破伤风杆菌、百日咳杆菌和/或b型流感嗜血杆菌的感染。这些病菌可导致肝炎、白喉、破伤风、百日咳和/或细菌脑膜炎。此方法或用法能更好地提供保护不感染这些疾病。流感嗜血杆菌引起的其它疾病包括中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎和心包炎。
患者最好是人类。
患者最好是儿童。
此方法在已接受疫苗的患者中可提高加强反应。
配方的单位剂量通常是0.5ml。
此外，本发明也提供一个含有本发明配方的输送设备(例如一个针筒，或免针注射器)。
设备最好是含有单一剂量。
配方的进一步成分本发明的成分最好是五价成分(1)HBsAg；(2)Hib；(3)白喉；(4)破伤风；(5)百日咳。不过，本发明并不排除加入其它抗原的可能性(例如产生六价、七价、八价、九价、十价或以上的配方)。例如，配方可包含下列一或多种抗原-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白抗原，例如参考67至73，-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜泡(OMV)制剂，例如参考74，75，76，77等所述。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考78所述，来自血清群C的低聚糖[也见参考79]或参考80的低聚糖。
-来自肺炎链球菌的糖抗原[例如81，82，83]。
-来自A型肝炎病毒的抗原，例如灭活病毒[例如84，85]。
-脊髓灰质炎抗原[例如86，87]例如OPV或最好是IPV。
配方可能包含以上一或多种抗原。
定义“包含”的意思是“包括”和“组成”例如一个“包含”X的配方可单独由X组成或可包括一些其它成分例如X+Y。
“约”与数值x的关系表示，例如x±10％。
绘图简介

图1显示本发明配方HBsAg稳定性的惠斯顿印迹法结果。
图2显示本发明配方白喉类毒素的免疫扩散结果。
图3显示本发明配方破伤风类毒素的免疫扩散结果。
图4显示本发明配方pH随时间的变化。
实行发明的模式液体制剂基本制剂法(1)加入酵母压榨的HBsAg至磷化铝液；(2)加入D然后T然后P抗原；(3)调整pH和(4)加入Hib-CRM197结合物。以下是进一步详情-先用磷化铝免疫助剂
-加入HBsAg液(pH7.0在PBS)至最后浓度20μg/ml-调整pH-搅拌30±5分钟(让HBsAg吸附至免疫助剂)-加入白喉类毒素至最后浓度15Lf/ml-搅拌30分钟-加入破伤风类毒素至最后浓度6.5Lf/ml-搅拌30分钟-加入细胞百日咳抗原至最后浓度30OU/ml-搅拌30分钟-如必要，调整pH-加入CRM197-Hib结合物至最后浓度20μg/ml-搅拌15分钟配方的最后抗原成分主要如下

本配方共使用三批进行测试。
稳定性测试进行测试时，使用3500rpm离心分离10ml本配方20分钟，然后使用Millex-GV 0.22μm过滤器过滤上清液，收集未吸附的抗原。
在零时间测试过滤了的上清液是否含HbsAg(使用惠斯顿印迹法)、白喉和破伤风类毒素(使用辐射式免疫扩散)和Hib-结合物(使用Dionex，高速负离子交换(HPAE)色谱分离法，配合使用脉冲电流测定(PAD))。此外，还确定游离磷的含量。储存在2-8℃或36-38℃，为期2周或4周的样品也进行同样的分析。
HbsAg惠斯顿印迹分析HBsAg吸附至铝免疫助剂是它产生免疫力的一个重要因素。其后的免疫印迹步骤极为重要，描述如下1ml容积的制剂上清液进行DOC-TCA沉淀，并使用LSB使变性，然后装入一个12％丙烯醯胺SDS-PAGE；每一批HBsAg使用1μg作为对照(这代表HbsAg剂量的5％)；所使用的主要抗体是羊抗-HBsAg抗体(稀释比例1∶1000)，并使用抗-羊POD结合物(稀释比例1∶2500)作为第二抗体。
结果显示如图1。图1A第6-8行显示在零时，五价配方内并没有可检出的HbsAg，图1B和1C第5-10行核实在2-8℃或36-38℃储存2周和4周后仍然如此。三批不同的样品在这些不同的情况下～99％的HBsAg仍然吸附在免疫助剂上。
在2-8℃储存了6个月后再做稳定性测试(图1D)。三批样品，每一种仍然保持～99％吸附率。
图1使用的正性对照含1μg HbsAg。可见一条相等于S缩氨酸(24kDa)的谱带，和一条结合物特有的谱带(～45kDa)。未见Pre-S2。
白喉和破伤风的辐射式免疫扩散测试(SRID)使用SRID来观察各批白喉和破伤风反应的一致性。选择一批白喉类毒素和一批破伤风类毒素来制造标准弧线。分析白喉时在上清液内加入10Lf/ml，分析破伤风时加入5Lf/ml。
白喉标准弧线包括5、10、20、30Lf/ml白喉类毒素。破伤风标准弧线包括5、10、15、20Lf/ml破伤风类毒素。15μl标准样品或其它样品装入SRID槽内。槽的排列如下，图显示Lf/ml，‘S’显示配方的上清液


图2显示0时间的白喉SRID结果(2A)和在2-8℃(2B)或36-38℃(2C)4周后的结果。图3显示0时间的破伤风SRID结果(3A)和在2-8℃(3B)或36-38℃(3C)4周后的结果。结果使用计算机分析以便确定抗原浓度(增量抗原修正)，并计算白喉和破伤风成分吸附的大约(10％以内)百分比。结果如下

游离和总糖分析(DIONEX)抗原稳定性和疗效的一个重要参数是Hib结合物的水解百分比，临床限制为25％游离糖(参考10报告20％未影响临床产生免疫性)。这一参数由DIONEX衡量，这一方法允许在皮摩尔水平为非结合碳水化合物直接定量，而尽量少需要分离和清理。分析集中在游离糖的分量。
糖测定如下(a)以μg/ml计算的总量(b)以μg/ml计算的上清液(即未吸附)量(c)以μg/ml计算游离(CRM197-Hib结合物水解)的总量(c)值以(d)即(b)的百分比或(e)理论上总糖含量(20μg/ml)的百分比。结果如下

临床上最多只能接受25％游离糖。所有值都在这一定值之下，而且在2-8℃至4周仍在6.5％以下。在热应力条件下(4周，36-38℃)可见较高水平的游离糖，但此值远在25％之下，最高是第1批的11.6％。
较早多价Hib抗原配方的工作显示储存在36-38℃一个月所产生的CRM-Hib水解比储存在2-8℃两年多。因此，可预期在正常的储存条件下，至少2年的时间内所产生的水解作用是可以接受的。
此外，储存在2-8℃6个月后再进行游离糖的DIONEX分析，数据如下

6个月与4周比较，游离糖百分比的增加有限，仍远在25％值之下。因此，在三个制剂中CRM197-Hib都非常稳定。
pH与渗透性图4A三批配方储存在2-8℃6个月的pH变化。图4B三批配方储存在36-8℃4周的pH变化。在2-8℃时pH保持稳定6个月，在热应力的条件下，2周后pH稍为下降0.1，4周后再稍为下降一点。所有pH值都在可接受的6.0-7.0范围内。
所有三批的渗透性都在312和315mOsm/Kg之间，这是注射疫苗可接受范围240-360mOsm/Kg的中间值。
效能与产生免疫力测试为了评估结合产品的疗效，评估抗原的效能和产生免疫力极为重要。已评估白喉、破伤风和百日咳抗原的效能，并测试CRM-Hib和HBsAg产生免疫的能力。接受疫苗后进行ELISA分析，以评估特定抗体的水平。HBsAg产生免疫的能力使用小鼠模型测试，而且免疫时间表也与HBV效能测试不同。
DTP的效能值如下

这三种抗原每一种的效能测试结果都明显地在可接受的下限之上，这些结果显示这三种抗原都有良好的效能。
为了评估HBsAg产生免疫的能力，在0和14天为每组10只CD1小鼠进行皮下注射五价产品(0.5ml，用盐水稀释的比例是1∶4)。在第21天为小鼠放血，并用下列两种ELISA之一评估HbsAg抗体(a)“Enzygnost Anti-HBs II”测验(Dade Behring)或(b)“AusabEIA”测验(Abbott)。这些ELISA测验有不同的模式，并对HbsAg有不同的敏感度。因此两种测验几何平均值(GMT)无法作比较。不过，在每一种测验的范围内，血清的GMT值都是最佳。结果如下

进行这类小鼠产生免疫力测定所得的GMT值比文献报告的数值高。两种抗原的反应数都一致相当高，在～100％的最高水平。
为了评估Hib产生免疫的能力，在0、10和20天为每组8只CD1小鼠进行皮下注射五价产品(0.5ml，用盐水稀释的比例是1∶4)。在第34天为小鼠放血，并用ELISA方法评估Hib抗体。结果如下

本发明只用例子作说明，在发明所述的范围及原则下可作修改。
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权利要求
1.一种制造抗原配方悬浮液的方法，该方法包括(a)在酸性环境下使用磷化铝液混合B型肝炎病毒表面抗原HBsAg；(b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并(c)加入Hib-结合抗原至液体内。
2.如权利要求1所述的方法，其中白喉抗原比破伤风和百日咳抗原先加入。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中加入了每一种抗原后都调整pH。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其中在步骤(c)后pH调整至6.0至7.0之间。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其中该方法在15℃和30℃之间进行。
6.一种配方，其特征在于，它用权利要求1-5任一所述的方法制得。
7.一种液状配方，它包含下列成分磷化铝、B型肝炎病毒表面抗原HBsAg、白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原和Hib-结合抗原，其中B型肝炎病毒表面抗原HBsAg被吸附至磷化铝而Hib-结合抗原却不为磷化铝所吸附。
8.如权利要求6或7所述的配方，其特征在于，它是一种产生免疫的配方。
9.一种提高患者免疫反应的方法，该方法包括给予病人权利要求6-8任一所述的配方。
10.一种药物，其特征在于，它含有权利要求6-8任一所述的配方。
11.权利要求6-8任一所述的配方在制备用于治疗和/或预防B型肝炎、白喉杆菌、破伤风杆菌、百日咳杆菌和/或b型流感嗜血杆菌的药物中的用途。
12.一种输注装置，其特征在于，它含有权利要求6-8任一所述的配方。
全文摘要
一个含B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的多价抗原悬浮液配方。配方过程包括下列步骤(a)在磷化铝液混合B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；(b)以任何顺序加入白喉抗原、破伤风抗原和百日咳抗原至液体内；并(c)加入Hib－结合抗原至液体内。本过程产生一种HBsAg被吸收至磷化铝免疫助剂，而Hib－结合物却不为铝免疫助剂所吸收的液体制剂。
文档编号A61P31/00GK1550236SQ20031010156
公开日2004年12月1日 申请日期2003年10月8日 优先权日2002年10月8日
发明者M·肯托尼, M 肯托尼 申请人:埃文斯·瓦克辛斯, 埃文斯 瓦克辛斯