专利名称：用咖啡酸苯乙酯衍生物、辣椒素和树脂毒素抑制NF-kB的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及核转录因子NF-κB的抑制剂以及这些抑制剂在治疗人体内病理性病征的应用。具体地说，本发明涉及用咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的5，6-二羟基双环衍生物、CAPE的2，5-二羟基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺(nonenamide))和树脂毒素来抑制核转录因子NF-κB的方法，以及这些抑制剂在治疗病理性病征(如中毒性休克、急性炎症、急性时象反应(phase response)、动脉粥样硬化和癌症)中的应用方法。
背景技术：
核转录因子NF-κB是一种对B细胞具有特异性的蛋白质，它与免疫球蛋白轻链κ基因座增强子区域中的特异性DNA序列结合。现已确定，转录因子NF-κB家族成员存在于各种生物体(包括从蝇到哺乳动物)中(参见Nolan等，Curr.Opin.Genet.Dev.2211-20(1992)；Liou等，Curr.Opin.Genet.Dev.5477-87(1993)；和Baeuerle和Henkel，Annu.Rev.Immunol.12141-79(1994))。该转录因子家族各成员间有35至61％的同源性，并且有约300氨基酸的Rel同源结构域。
在哺乳动物中，分布最广的κB结合因子是由P50和P65(Rel-A)蛋白组成的异二聚物。该转录因子在各种应答中起主要作用，它通过迅速诱导基因表达来引起宿主防御。特别是，它控制参与肿瘤转移的各种炎性细胞因子、主要的组织适合性复合基因和粘着分子的表达。NF-κB以及依赖于NF-κB的基因的调节异常与各种病理性病征相关，它们包括中毒/脓毒性休克、移植物抗宿主反应、急性炎症、急性时象反应、病毒复制、放射性损伤、动脉粥样硬化和癌症(参见Baeuerle和Henkel，Annu.Rev.Immunol.12141-79(1994)；和Siebenlist等，Annu.Rev.Cell.Biol.10405-55(1994))。
与其它转录因子不同，NF-κB蛋白被称为IκBa的抑制性亚基束缚在细胞质中呈无活性状态。IκB的磷酸化以及其后的降解使得NF-κB转运到到胞核上。该活化过程由多种因素诱导，如炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子(TNF)、淋巴毒素(LT)和白细胞介素(IL)-1)、促细胞有丝分裂剂、细菌产物、蛋白合成抑制剂、氧化应力(H2O2)、紫外光和佛波酯。能下调NF-κB活化作用的试剂可用来治疗这些病理性病征。本发明涉及一些这样的试剂。
一种试剂是咖啡酸(3，4-二羟基肉桂酸)苯乙酯(CAPE)，它是蜂巢蜡胶中活性成分类黄酮的结构类似物。它具有抗病毒、抗炎和调节免疫的性能，并且表现出能抑制不同类转化细胞的生长(参见Grunberger等，Experientia 44230-32(1988)；Burke等，J.Med.Chem.384171-78(1995)；Su等，Cancer Res.541865-70(1994)；Su等，Mol.Carcinog.4231-42(1991)；Hlandon等，Arzneim.-Forsch./Drug Res.301847-48(1980)；和Guarini，L.等，Cell.Mol.Biol.38513-27(1992))。在转化的细胞中，CAPE改变了氧化还原状态并诱导了细胞程序死亡。而且，已经报道了CAPE有抑制脂质过氧化的作用，具有抗氧化剂活性，并能抑制鸟氨酸脱羧酶、蛋白酪氨酸激酶和脂肪氧化酶的活性。CAPE也能抑制佛波酯诱导H2O2生成和诱发肿瘤增生(参见Bhimani等，Cancer Res.534528-33(1993)和Frenkel等，Cancer Res.531255-61(1993))。
本文中公开的另一种这样的下调剂是辣椒素。辣椒素是高香草酸衍生物(8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺)，分子量为305.42。它是辣椒属红辣椒中的活性成分，并已用于人体局部治疗束状头痛、带状疱疹和血管舒缩性鼻炎(参见Holzer，P.，Pharmacol.Rev.43143(1994)；Sicuteri等，Med.Sci.Res.161079(1988)；Waston等，Pain 33333(1988)；Marabini等，Regul.Pept.221(1988))。辣椒素能在体外调节细胞的生长、胶原酶的合成以及类风湿性关节炎滑液细胞(synoviocyte)分泌前列腺素(参见Matucci-Cerinic等，Ann.Rheum.Dis.49598(1990))。辣椒素也具有免疫调节性，这表现为它能调节淋巴细胞的增殖、抗体的产生和嗜中性细胞趋化作用(参见Nilsson等，J.Immunopharmac.10747(1988)；Nilsson等，J.Immunopharmac.1321(1991)；和Eglezos等，J.Neuroimmunol.26131(1990))。这些作用在辣椒素治疗关节炎的应用中起重要作用。另外，辣椒素能诱导线粒体肿胀、抑制NADH氧化酶、诱导转化细胞的细胞程序死亡、刺激腺苷酸环化酶、激活蛋白激酶C、抑制超氧化物阴离子的产生，以及改变细胞的氧化还原状态。
辣椒素的各种作用是通过一种与树脂毒素(resiniferatoxin)共享的称为类似香草碱(vanilloid)受体的特异性细胞受体来介导的。与辣椒素一样，树脂毒素是从大戟属植物中获得的生物碱。树脂毒素是辣椒素的结构同系物(见
图1)。树脂毒素在结构上也与佛波酯(佛波醇肉豆寇酸·乙酸酯(phorbol myristate acetate))相似，该佛波酯能与不同的结合部位相互作用并激活蛋白激酶C(参见Szallasi等，Neurosci.30515(1989)；和Szallasi和Blumberg，Neurosci.30515(1989))。与树脂毒素不同，辣椒素与佛波醇肉豆寇酸·乙酸酯并不同系，但是它能象树脂毒素一样激活蛋白激酶C，这说明后一活化并不是由于树脂毒素中的类似佛波酯的部分引起的。已经知道，树脂毒素能模拟许多辣椒素的作用。
因此，用咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的2，5-二羟基衍生物、CAPE的5，6-二羟基双环衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺)和树脂毒素来抑制核转录因子NF-κB的方法是已有技术中未知的。抑制NF-κB是治疗由炎性细胞因子、促细胞有丝分裂剂、氧化应力、佛波酯及其它试剂活化NF-κB引起的各种病理性病征中重要的步骤。本发明满足了治疗这些病理性病征领域中长期存在的需求和希望。
发明内容
本发明的一个目的是提供用各种抑制剂来抑制NF-κB活化的方法。
在本发明的一个实施例中，提供的抑制剂是咖啡酸苯乙酯(CAPE)。
在本发明的另一个实施例中，提供的NF-κB的抑制剂是咖啡酸苯乙酯(CPAE)的2，5-二羟基衍生物。
在本发明的另一个实施例中，提供的NF-κB的抑制剂是咖啡酸苯乙酯(CAPE)的5，6-二羟基双环衍生物。
在本发明的另一个实施例中，提供的抑制剂是辣椒素(8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺)。
在本发明的还有一个实施例中，提供了树脂毒素作为NF-κB的抑制剂。
本发明的另一个目的是提供一种治疗由个体内NF-κB活化而引起的病理性病征的方法，该方法包括对待治疗的个体给予咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的5，6-双环二羟基衍生物、CAPE的2，5-二羟基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺)或树脂毒素。
本发明这方面的各种实施例包括提供治疗诸如中毒/脓毒性休克、移植物抗宿主反应、急性炎症、急性时象反应、病毒感染、放射性损伤易感性、动脉粥样硬化和癌症之类的病理性病征的方法，该方法包括对待治疗的个体给予咖啡酸苯乙酯(CAPE)、CAPE的2，5-二羟基衍生物、CAPE的5，6-双环二羟基衍生物、辣椒素(8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺)或树脂毒素。
本发明的其它方面、特征和优点可以从下述的本发明较佳实施例中明显获得。给出这些实施例的目的只是为了公开本发明。
附图简述图1示出了CAPE抑制依赖于TNF的NF-κB的剂量-反应方式和动力学。1A使U937细胞(2×106/ml)与指定浓度的CAPE 37℃预培育2小时，然后与0.1nM TNF一起培育15分钟。
1B上图为了对NF-κB活化进行超移动(supershift)和特异性分析，从未处理过的或TNF(0.1nM)处理过的细胞中制得核抽提物，与抗体一起培育30分钟，然后测定NF-κB。
1B下图使细胞与25μg/ml CAPE在37℃预培育不同的时间，然后测定不用或用0.1nM TNF 37℃15分钟后NF-κB的活化情况。(-)表示在加入TNF前有CAPE存在，(0)表示CAPE与TNF共同培育，(+)表示在TNF后加入CAPE。在这些处理后，制得核抽提物并测定NF-κB。任意单位表示各条带中放射性的相对量。
图2证明了CAPE对佛波酯肉豆蔻酸·乙酸酯、神经酰胺、冈田酸和H2O2介导的NF-κB活化有(抑制)作用。使U937细胞(2×106/ml)与CAPE(25μg/ml)37℃预培育120分钟，然后在37℃用佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯(100ng/ml，60分钟)、H2O2(0.5mM，30分钟)、神经酰胺C8(10μM，30分钟)或冈田酸(500nM，30分钟)处理，再测定NF-κB的活化情况。另外再对佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯介导的活化进行电泳迁移率变动测定。
图3示出了CAPE对NF-κB与DNA结合的(抑制)作用。对于图3A，将从经TNF激活的U937细胞中制得的核抽提物与指定浓度的CAPE在37℃培育30分钟，然后分析NF-κB的活化情况。对于图3B，在有或没有指定浓度的CAPE存在下，用脱氧胆酸处理未经处理的细胞的胞质抽提物，分析NF-κB的活化情况。
图4示出了CAPE对AP-1、Oct-1和TFII D转录因子的影响。用25μg/ml的CAPE在37℃处理细胞2小时，制得核抽提物用于电泳迁移率变动测定。
图5
示出了CAPE对TNF诱导的IκBa降解以及对胞质和胞核中p65水平的影响。使经过或未经CAPE(25μg/ml)37℃预处理2小时的U937细胞(2×106/ml)与和不与TNF(0.1nM)一起培育不同的时间，然后测定IκBa(上图)。对于p65(下图)，使经或未经CAPE(25μg/ml)37℃预处理2小时的细胞，与和不与TNF(0.1nM)一起培育15分钟，制得细胞核和细胞质抽提物，用western印迹法测定p65。
图6表示DTT、BME和DMP对CAPE诱导的NF-κB活化抑制的影响。在CAPE(25μg/ml)存在或不存在下，使U937细胞(2×106/ml)与DTT(100μM)、BME(142μM)或DMP(100μM)一起培育2小时，用TNF(0.1nM)活化15分钟，然后测定NF-κB的活化情况。
图7显示了不同的CAPE类似物的结构(7A)及其对TNF诱导NF-κB活化的影响(7B)。使U-937细胞(2×106/ml)与不同的CAPE类似物(25μg/ml)37℃培育2小时，用(上图)或不用(下图)TNF(0.1nM)活化15分钟，测定NF-κB的活化情况。C表示只经过TNF处理，P表示用母化合物CAPE然后用TNF处理。任意单位代表存在的放射活性的相对量。
图8示出了辣椒素、树脂毒素和佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯在化学结构上是同系的。
图9示出了电泳迁移率变动测定的结果，该结果表明辣椒素抑制依赖于TNF的NF-κB活化的剂量-反应方式和动力学。
9A使ML-1a细胞(2×106/ml)与不同浓度的辣椒素在37℃预培育2小时，然后用或不用0.1nM TNF活化15分钟。
9B使细胞(2×106/ml)与300μM辣椒素在37℃预培育2小时，然后测定在37℃用所示不同浓度的TNF活化15分钟后的NF-κB活化情况。
9C使ML-1a细胞(2×106/ml)与300μM辣椒素在37℃预培育不同的时间，然后测定在37℃用0.1nM TNF活化15分钟后的NF-κB活化情况。(-)表示在加入TNF前，辣椒素存在的时间；(0)表示与TNF共同培育；(+)表示在TNF后，加入辣椒素的时间。在这些处理后，制得核抽提物并测定NF-κB。
图10示出了树脂毒素抑制依赖于TNF的NF-κB活化的剂量-反应方式。使细胞(2×106/ml)与所示不同浓度的树脂毒素在37℃预培育2小时，用0.1nM TNF 37℃活化30分钟，然后测定NF-κB。在这些处理后，制得核抽提物，然后测定NF-κB。UT表示未经处理的细胞。
图11超移动试验和辣椒素对NF-κB活化的抑制作用的特异性。对于图(A)，从未经TNF(0.1nM)处理的或经处理的细胞(2×106/ml)中制得核抽提物，与抗体培育30分钟，然后测定NF-κB。对于图(B)，用不同浓度的辣椒素处理细胞2小时，再用TNF处理15分钟，制得细胞质抽提物，用8％脱氧胆酸处理这些抽提物，用电泳迁移率变动测定测定NF-κB。对于图(C)，使经TNF处理过的细胞的核抽提物与不同浓度的辣椒素培育15分钟，用电泳迁移率变动测定分析NF-κB。
图12示出了辣椒素对不同NF-κB活化剂(佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯和冈田酸)的影响。对于图12A，使ML-1a细胞(2×106/ml)与辣椒素在37℃预培育2小时，用佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯(25ng/ml)、冈田酸(500nM)或TNF(0.1nM)处理30分钟，然后测定NF-κB的活化情况。用100倍过量的、冷的或突变的寡核苷酸来测定结合特异性。标记为Mut.探针的泳道系将突变的探针作标记然后用来检测此结合。
对于图12B，使指定浓度的辣椒素与U-937或Hela细胞(2×106/ml)在37℃预培育2小时，然后用TNF(0.1nM)活化15分钟，然后测定NF-κB。
图13示出了辣椒素对TNF诱导的IkBa降解和对p65水平的影响。
13A使未经处理的或用300μM辣椒素在37℃预处理2小时的ML-1a(2×106/ml)细胞与TNF(0.1nM)培育不同的时间，然后用western印迹分析测定胞质级分中的IκBa。S和N表示缓慢迁移和正常迁移的条带。
13B用辣椒素处理细胞不同的时间，然后用western印迹分析测定胞质级分中的IκBa或p65。
13C使经辣椒素预处理2小时的ML-1a细胞(2×106/ml)与TNF(0.1nM)一起培育30分钟，然后用Western印迹分析测定核抽提物和细胞质抽提物中的p65。
13D用不同浓度的辣椒素预处理细胞2小时，然后用或不用TNF(0.1nM)处理15分钟，再用western印迹分析测定胞质级分中的p50或c-Rel。
图14示出了辣椒素对与CAT基因相连的IκBa启动子的活性的影响。用pIκBCAT和pmutIκBCAT瞬时转染细胞，用300μM辣椒素处理该细胞2小时并使其接触0.1nM TNF 1小时，测定CAT活性。结果用未经处理的对照的活性倍数表示。
本文包括了这些附图，这样就能清楚详细地了解本发明的上述特征、优点和目的。这些附图组成了本说明书的一部分。然而，应当注意，附图只是描述了本发明的较佳实施例，其不应被认为限制了本发明的范围。
具体实施例方式
在对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的范围和精神下显然可对本文公开的发明作各种变化和改动。
本文所用的术语“核因子NF-κB”或“NF-κB”应指对B细胞有特异性的、与免疫球蛋白轻链κ基因座增强子区域中的特异性DNA序列(5-GGGGACTTTCC-3)结合的蛋白，其在哺乳动物体内是由p50和p65(Rel-A)蛋白组成的异源二聚物。NF-κB在各种应答中起主要作用，其通过迅速诱导基因表达来引起宿主防御，并控制参与肿瘤转移的各种炎性细胞因子、主要的组织适合性复合基因和粘着分子的表达。
本文所用的术语“CAPE”指咖啡酸(3，4-二羟基肉桂酸)苯乙酯。
本文所用的术语“CAPE的5，6-二羟基双环衍生物”指图7A中化合物编号6表示的CAPE类似物分子。
本文所用的术语“CAPE的2，5-二羟基衍生物”指图7A中化合物编号1表示的CAPE类似物分子。
本文所用的术语“辣椒素”指高香草酸衍生物，8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺，其分子量为305.42。
本文所用的术语“树脂毒素”指图8B所示辣椒素的结构同系物。
本文所用的术语“病理性病征”指与疾病有关或由疾病引起的病征。这些病征可以包括(但不局限于)，中毒或脓毒性休克、移植物抗宿主反应、急性炎症、急性时象反应、病毒复制、放射性损伤、动脉粥样硬化和癌症。
本文所用的术语“试剂的治疗有效量”指试剂量在生理上是显著的，并能改善个体的健康状况。如果试剂的存在改变了接受者的生理状况，则称试剂“在生理上是显著的”。例如，在治疗病理性病征时，给予的剂量能缓解或阻止病征的进一步发展，则认为给予的试剂在生理上是显著的，并且在治疗上是有效的。
本文所用的术语“CAT”指氯霉素乙酰转移酶。
本发明涉及用各种抑制剂来抑制NF-κB活化的方法。另外还考虑了治疗个体内由NF-κB的活化引起的病理性病征的方法。
对于治疗应用，分子药理学领域普通技术人员能不进行多余的实验即可确定本发明中抑制NF-κB活化的新颖的抑制剂的合适剂量和给药途径。
给出下列实施例只是为了描述本发明的各种实例，而并不意味着以任何方式限制本发明。
实施例1材料青霉素、链霉素、RPMI 1640培养基和胎牛血清购自GIBCO(GrandIsland，NY)。佛波酯和牛血清白蛋白盐购自Sigma Chemical Co.(St.Louis.MO)。从细菌获得的、并经纯化至均质的比活为5×107单位/毫克的重组人TNF由Genentech，Inc.(South San Franciso，CA)提供。抗IκBa的抗体、细胞周期蛋白D1和NF-κB亚基p50和p65，以及具有AP-1和Oct-1共有序列的双链寡核苷酸购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。神经酰胺(C8)购自Calbiochem(SanDiego，CA)。Tris、甘氨酸、NaCl、SDS、树脂毒素、佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯、氯霉素和牛血清白蛋白购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。32P-标记的γ-ATP(比活为7000Ci/毫摩尔)购自ICN(Costa Mesa，Ca)。冈田酸(OA)购自LCLaboratories(Woburn，MA)，辣椒素购自Tocris Cookson Inc.(St.Louis，MO)，乙酰辅酶A购自Pharmacia Biotech(Alameda，CA)，氚化的乙酰辅酶A购自AmershamLife Sciences(Arlington Heights，IL)。GIBCO-BRL磷酸钙转染系统试剂盒(Cat.#18306-019)购自Life Technologies(Madison，WI)。
CAPE及其类似物为了进行结构-活性关系的研究，如Grunberger等，Experientia 44230-32(1988)和Burke等，J.Med.Chem.384171-78(1995)所述，合成几个CAPE的类似物。这些类似物包括环取代基、酯基、旋转受限的变异体以及饱和的酰胺类似物。在50℃乙醇中制得浓度为1-5mg/ml的CAPE及其类似物的贮备液，再在细胞培养基中作进一步稀释。
细胞系对于CAPE研究，使人组织细胞型细胞系U937细胞在补加了谷氨酰胺(2mM)、庆大霉素(50mg/ml)和胎牛血清(FBS)(10％)的RPMI 1640培养基中常规生长。将细胞以1×105细胞/毫升的密度接种入含10毫升培养基的T25烧瓶(Falcon 3013，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)中，并在37℃、95％空气和5％CO2下生长。细胞培养物每隔3或4天分裂一次。有时，用DNA为基的试剂盒(购自Gen-Probe，San Diego，CA)测定细胞中支原体的污染情况。
对于辣椒素和树脂毒素的研究采用ML-1a细胞，它是一种人骨髓单核母细胞白血病细胞系，由Dr.Ken Takeda(Showa University，Japan)提供；U-937和Hela细胞系(从ATCC获得)。使细胞在补加了谷氨酰胺(2mM)、庆大霉素(50mg/ml)和胎牛血清(FBS)(10％)的RPMI 1640培养基中常规生长。将细胞以1×105细胞/毫升的密度接种入含10毫升培养基的T25烧瓶(Falcon 3013，Becton Diekinson Labware，Lincoln Park，NJ)中，并在37℃、95％空气和5％CO2生长。细胞培养物每隔3或4天分裂一次。
DNA构建物氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因上游连接有0.2kb片段的IκBa质粒pIκBCAT，以及含有与CAT相连的、但具有NF-κB突变位点的0.2kb片段的质粒pmutIκBCAT由M.D.Anderson Cancer Center，H6uston，TX的Dr.PaulChiao提供。这些质粒的性质鉴定在Schreiber等，Nucleic Acids Res.176419(1989)中有详细描述。
实施例2电泳迁移率变动测定这些试验如以前Chaturvedi等，J.Biol.chem.26914575-83(1994)以及Schreiber等，Nucleic Acids Res.176419(1989)中详细描述的那样进行。简言之，用冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2×106个细胞，然后悬浮在0.4ml裂解缓冲液(10mM HEPES pH7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mMEGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF，2.0mg/ml亮抑酶肽，2.0mg/ml抑蛋白酶肽和0.5mg/ml苯甲脒)中。使细胞在冰上溶胀15分钟，然后加入12.5ml 10％NP-40。然后使试管剧烈旋涡10秒种，再离心匀浆物30秒种。将细胞核沉淀重新悬浮在25μl冰冷的核抽提物缓冲液(20mM HEPES pH7.9，0.4M NaCl，1mM EDTA，lmMEGTA，1mM DTT，1mM PMSF，2.0mg/ml亮抑酶肽，2.0mg/ml抑蛋白酶肽和0.5mg/ml苯甲脒)中，置于冰上培育30分钟间以混合搅拌。使样品4℃离心5分钟，上清液(核抽提物)可立即使用，或保藏在-70℃。用Bradford，M.M.，Anal.Biochem.72248-254(1976)所述的方法测定蛋白含量。
电泳迁移率变动分析如下进行使4mg核抽提物与16fmol32P末端标记的HIV-LTR的45聚双链NF-κB寡核苷酸5′-TTGTT ACAAG GGACTTT CCGCTGGGGAC TTTCCA GGGAG GCGTGG-3′(Nabel，G.和Baltimore，D.，Nature326711-13(1987))37℃培育15分钟。培育混合物包括在结合缓冲液(25mM HEPESpH7.9，0.5mM EDTA，0.5 mM DTT，1％NP-40，5％甘油和50mM NaCl)中的2-3mg聚(dI-dC)。在4.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上用含有50mM Tris，200mM甘氨酸pH8.5和1mM EDTA的缓冲液使形成的DNA-蛋白质复合物与游离的寡核苷酸分离，然后干燥凝胶。用双链突变的寡核苷酸5′-TTGTTA CAACTC ACTTTCCGCTGCTCAC TTTCCA GGGAGG CGTGG-3′来检测NF-κB与DNA结合的特异性。结合特异性还可通过与未标记的寡核苷酸竞争来检测。
对于超移动试验，在对复合物进行电泳迁移率变动分析前，使从经TNF处理过的细胞中制得的核抽提物在室温下与抗NF-κB的p50或p65亚基的抗体一起培育30分钟(Singh，S.和Aggarwal，B.B，J.Biol.Chem.27010631-39(1995))。另加入抗细胞周期蛋白D1的抗体作为阴性对照。
对AP-1、TFII D和Oct-l作电泳迁移率变动分析，如NF-κB一样，也用32P末端标记的双链寡核苷酸。如Singh，S.和Aggarwal，B.B，J.Biol.Chem.27010631-39(1995)中所述的，常规用过量未标记的寡核苷酸竞争测定对结合的特异性。使放射活性条带显色，并用磷光测定仪(phosphorimager)(MolecularDynamics，Sunnyvale，CA)和“Image-quant”软件对其作定量测定。
实施例3Western印迹分析IκBa和p65为分析IκBa，在NF-κB活化反应后，将核后(postnuclear)抽提物溶解在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。为了测定p65水平，将核和核后(细胞质)抽提物溶解在8％SDS聚丙烯酰胺凝胶中。将蛋白质电泳转移到Immobilon P膜上，用抗IκBa或抗p65的兔多克隆抗体作为探针进行化学发光检测(ECL-Amersham；30)。
实施例4CAPE对转录因子NF-κB活化的(抑制)作用用U937细胞来作这些研究，因为关于U937细胞对因各种刺激而活化的NF-κB反应已作了很好地性质鉴定(参见Reddy，等，J.Biol.Chem.26925369-72(1994))。在这些实验中，所有浓度的CAPE及其类似物均获得了98％以上的细胞存活率。使U937细胞与不同浓度的CAPE预培育2小时，再用TNF(0.1nM)在37℃处理15分钟，然后检测NF-κB的活化情况。结果(图1A)表明CAPE以剂量依赖方式抑制了TNF依赖的NF-κB活化，在25μg/ml时有最大效果。在未经TNF处理的细胞、或只用载体(乙醇)处理过的细胞或只厨CAPE处理过的细胞中均没有发现NF-κB活化。
为了表明在经TNF处理过的细胞中电泳迁移率变动分析所见的滞后条带的确是NF-κB，将核抽提物与抗p50(NF-κBl)或p65(Rel A)亚基的抗体分开来培育，然后进行电泳迁移率变动分析。本实验的结果(图1B，上图)表明，抗NF-κB中任一亚基的抗体使条带移动至较高分子量处，这说明TNF活化的复合物由p50和p65亚基组成。抗细胞周期蛋白D的非特异性的抗体对NF-κB的迁移率没有影响。另外，当采用了未标记的寡核苷酸(100倍过量)时，经TNF处理过的细胞中电泳迁移率变动分析所见的滞后条带消失，而当采用了突变型寡核苷酸时，条带却不会消失(图1B，上图)。
在加入TNF前120、90、60和30分钟时、在加入TNF的同时、在加入TNF后5和10分钟时，使细胞与CAPE一起培育，以检测抑制动力学。细胞用TNF处理15分钟。只有当细胞预先用CAPE处理过时，TNF反应才会受到抑制(图1B，下图)。用TNF和CAPE共同处理细胞是无效的。
实施例5CAPE也能抑制由佛波酯、神经酰胺、冈田酸和过氧化氢诱导的NF-κB活化佛波酯(佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯)、神经酰胺、冈田酸和过氧化氢也能诱导NF-κB的活化(Meyer，等，EMBO J.122005-15(1993))。然而，这些试剂诱导导致NF-κB活化的初始信号转导途径不同。因此，检测CAPE对这些不同试剂活化转录因子的(抑制)作用。图2中的结果表明CAPE完全阻断了所有四种试剂诱导的NF-κB活化，这表明CAPE作用于导致NF-κB活化的信号转导途径中的趋同(converge)步骤。
实施例6CAPE特异性地抑制NF-κB(而不是其它转录因子)与DNA的结合TPCK(丝氨酸蛋白酶抑制剂)和除莠霉素(蛋白质酪氨酸激酶抑制剂)均表现出能通过干扰NF-κB与DNA的结合来阻断NF-κB的活化(Finco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9111884-88(1994)；和Mahon，T.M.和O′Neill，L.A.J.，J.Biol.Chem.27028577-64(1995))。为了测定CAPE对NF-κB与DNA的结合的影响，使预先用TNF活化的细胞的核抽提物与各种浓度的CAPE一起培育。电泳迁移率变动分析(图3，上图)表明CAPE能防止NF-κB与DNA结合。由于IκBa也可通过洗涤剂(如脱氧胆酸)温和处理从NF-κB上解离下来，因此检测经脱氧胆酸处理过的细胞质抽提物与经或未经CAPE处理的DNA结合的能力。同样，CAPE也干扰了NF-κB蛋白与DNA的结合(图3，下图)。
测试CAPE抑制其它转录因子(如AP-1、TFII D和Oct-1)结合的能力。CAPE对NF-κB结合的抑制作用是特异性的，因为它不抑制其它转录因子与DNA结合的能力(图4)。
实施例7CAPE不抑制依赖于TNF的IκBa磷酸化和降解NF-κB转运到胞核上是通过IκBa的磷酸化和蛋白水解来进行的(参见Thanos，D.和Maniatis，T.，Cell80529-32(1995))。为了确定CAPE的抑制作用是否是因为对IκBa降解有抑制作用，用western印迹分析检测IκBa蛋白的细胞质水平。如图5上图所示，用CAPE处理细胞对IκBa的细胞质库没有影响，但是用TNF处理细胞却会使IκBa条带在5分钟内减少，在15分钟时完全消失，然后在30分钟时重现。CAPE的存在对TNF诱导IκBa降解的速率没有显著影响，但是它延迟了IκBa的重新合成。这种延迟可能是一种反馈调节，因为IκBa的重新合成取决于NF-κB的活化。
由于NF-κB活化需要NF-κBp65亚基的核转运，因此用western印迹分析来检测p65蛋白的胞质和胞核库。如图5下图所示，没有一种处理明显改变了p65的胞质库，但是TNF诱导的胞核内p65的出现被CAPE阻断。在经TNF处理过的细胞中，p65相应胞质库中的降低量并不显著，这可能是因为在活化时，只有20％的p65被转运到胞核中。
实施例8还原剂逆转了CAPE的作用已经知道，过钒酸盐、TPCK和除莠霉素A抑制NF-κB活化的生物作用可被还原剂逆转。因此，测定DTT、2，3-二巯基丙醇(DMP)和β巯基乙醇(BME)使CAPE作用逆转的能力。在有或没有DTT、DMP或BME存在下，用CAPE处理细胞，并检测用TNF活化NF-κB的情况。如图6所示，没有一种还原剂本身对依赖于TNF的NF-κB活化有明显影响，但是所有的还原剂均使CAPE诱导的抑制作用完全逆转。这些结果暗示，巯基在依赖于TNF的活化NF-κB中起关键作用。
实施例9对CAPE的结构/活性关系的研究为了进一步描述CAPE在抑制NF-κB活化中的作用，采用具有四类不同修饰的CAPE类似物。这些类似物包括环取代基(化合物1、2、3)、酯基团(化合物4)、旋光受限的变体(化合物5和6)和饱和的酰胺类似物(化合物7和8)，它们均显示在图7A中。以前已经对这些类似物抑制人HIV整合酶和细胞生长的能力作了性质鉴定(参见Burke等，J.Med.Chem.384171-78(1995))。尽管所有这些化合物在抑制NF-κB活化上具有活性，但是它们的抑制能力有显著差别(图7B)。
从3，4-二羟基模式变为2，5二羟基模式(化合物1)的羟基部位的改变提高了抑制效能，该效能高于用两个甲醚来代替CAPE的羟基(化合物2)所得的效能。然而，加入第三个羟基形成2，3，4-三羟基衍生物(化合物3)却使效能有所损失，这说明，羟基数目和部位是抑制程度的一个关键性决定因素。在酯类似物组中，分子的咖啡酸部分(3，4-二羟基肉桂酸)保持不变，而改变苯乙基侧链。烷基间隔长度的增加(化合物4)会使抑制效果明显丧失。
在旋光受限的变体中，采用了羟基取代基部位不同的两个CAPE异构体的双环类似物。发现两个类似物的抑制效能有显著变化。异构体5完全失效，而异构体6完全消除了结合，这再一次表明羟基部位在抑制NF-κB活化中起关键作用。
在饱和酰胺类似物中，检测了侧链键和酯基氧的重要性。(苯乙基)胺环中具有额外的三个羟基的类似物(化合物7)以及反向酰胺类似物(化合物8，它没有额外的羟基)的活性比CAPE差。因此，CAPE的结构类似物可能比CAPE更具活性(如化合物6)，可能与CAPE的活性相同(如化合物1)，也可能活性低于CAPE(如化合物2、3、4、5、7和8)。
实施例10瞬时转染和CAT试验用磷酸钙方法，根据生产商(GIBCO-BRL)提供的说明书，用pIκBCAT以及pmutIκBCAT瞬时转染Hela细胞20小时。在转染后，更换培养基(MEM)；使细胞在37℃培育24小时，然后用辣椒素(300μM)处理2小时，再用0.1nM TNF刺激1小时。然后用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞，并如Sambrook J.，E.E.Fritsch，和T.Maniatis.编辑，Molecular cloningA laboratorymanual，第2版，Cold Spring Harbor Press.，New York中所述的检测CAT活性。
实施例11辣椒素能抑制依赖于TNF的NF-κB活化测试辣椒素及其类似物树脂毒素(树脂毒素也与佛波酯在结构上是同系物(见图8))调节NF-κB活化的能力。采用的培育最大时间和化合物浓度对细胞存活力或TNF受体的影响最小。用台盼蓝排阻法测得细胞在暴露在100μM、200μM和300μM辣椒素下2小时时的细胞存活力分别为99％、98％和95％。
用不同浓度的辣椒素(高达300μM)预处理ML-1a细胞2小时，再与或不与TNF(0.1nM)一起37℃培育15分钟，用电泳迁移率变动分析测定NF-κB的活化情况(图9A)。结果显示，辣椒素本身不会活化NF-κB，而200-300μM的辣椒素则抑制了大部分TNF诱导的NF-κB活化。TNF活化NF-κB是非常特异性的，因为在加入未标记寡核苷酸时条带消失，而在加入带有突变型结合部位的寡核苷酸时则条带不消失(图13A)。
以前的研究已经表明，高浓度的TNF(10nM)能诱导出更强而迅速(在5分钟内)的NF-κB活化(Chaturvedi等，J.Biol.Chem.26914575-83(1994))。为了确定辣椒素是否也能抑制对TNF的强反应，用浓度增加的TNF(高达10nM)作用于经辣椒素预处理过的细胞15分钟，然后检测NF-κB(图9B)。尽管10nM TNF的NF-κB活化作用非常强，但是辣椒素完全抑制了该活化作用(就如其对0.01nM浓度的TNF那样有效)。这些结果表明，辣椒素是一种抑制NF-κB活化的非常有效的抑制剂。
为了更进一步地了解抑制的动力学，使细胞与辣椒素共同培育120、60。30和10分钟，然后使细胞受TNF作用。另外还在加入TNF的同时(0分钟)及加入后10分钟时加入辣椒素。每种情况下的TNF均作用30分钟。如图9C所示，辣椒素和TNF与细胞共同培育不会阻断NF-κB的活化。只有当细胞与辣椒素预先培育120分钟时才发现有抑制TNF反应的最大效果。
实施例12树脂毒素也能抑制NF-κB活化树脂毒素是辣椒素的结构类似物，两者共享一个公共的受体(参见Holzer，H.Pharmacol.Rev.43143(1994)；和Szallasi，A.，和Blumberg，P.，Brain Res.524106(1990))。因此，对树脂毒素抑制TNF介导NF-κB活化的能力进行测定。与辣椒素一样，用树脂毒素本身处理细胞不会活化NF-κB，但是它能以剂量依赖方式(图10)完全抑制TNF介导的NF-κB活化。由于40μM的树脂毒素就足以实现对TNF反应的最大抑制，因此认为树脂毒素的效力约为辣椒素的8倍。
实施例13受辣椒素抑制的、活化的NF-κB由p50和p65亚基组成Rel/NF-κB蛋白的不同组合能构成有活性的、与DNA中特异性序列结合的NF-κB异二聚物。为了证明经TNF处理过的细胞中电泳迁移率变动分析显示的滞后条带的确是NF-κB，使受TNF活化的细胞核抽提物与抗p50(NF-κB1)或p65(Rel A)亚基的抗体一起培育，并进行电泳迁移率变动分析。抗NF-κB的任一亚基的抗体使条带移动到更高的分子量处(图11A)，这就说明TNF-活化的复合物由p50和p65亚基组成。抗p65抗体的部分移动可能是由于所用抗体的性质或条件的缘故。用不相关的抗体(NS)作为对照跑电泳；它对NF-κB条带没有影响。
已经证明，TPCK(丝氨酸蛋白酶抑制剂)和除莠霉素(酪氨酸激酶抑制剂)均能通过化学改变NF-κB亚基，从而防止NF-κB与DNA结合，下调NF-κB的活化。为了确定辣椒素是否直接修饰NF-κB蛋白，使DNA与以下两种抽提物一起培育并进行电泳迁移率变动分析(1)受辣椒素作用的细胞的经脱氧胆酸处理过的细胞质抽提物(图11B)和(2)在经TNF处理后受辣椒素作用的核抽提物(图11C)。已经知道，用脱氧胆酸处理能解离IκBa亚基，从而释放出NF-κB与DNA结合。图11B和11C的结果表明，辣椒素不改变NF-κB与DNA的结合能力。因此，辣椒素通过不同于TPCK或除莠霉素A的作用机理，抑制了NF-κB活化。
实施例14辣椒素也能阻止其它试剂诱导的NF-κB活化NF-κB可被其它各类试剂诱导活化，它们包括TNF、佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯和冈田酸。然而，关于所有这些试剂导致NF-κB活化的途径是否相同还不清楚。因此，测定了辣椒素对不同试剂活化NF-κB的(抑制)效果。与TNF一样，辣椒素能完全抑制佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯诱导的NF-κB活化，但是只能部分地抑制通过冈田酸介导的活化(图12A)。
实施例15辣椒素抑制NF-κB活化对细胞类型没有特异性除了ML-1a细胞外，还测定了辣椒素在其它骨髓样细胞(U-937)和上皮细胞(HeLa)中阻抑TNF介导的NF-κB活化的能力。图12B中显示了这些实验的结果，结果表明，辣椒素能在这两类细胞中抑制TNF诱导的NF-κB。在200μM时辣椒素发现有几乎完全的抑制，这就说明辣椒素的这种抑制作用对细胞类型没有特异性。
实施例16辣椒素抑制依赖于TNF的IκBa降解已经知道，在刺激细胞时，IκBa被磷酸化并经历蛋白降解，从而使NF-κB转运到细胞核中。本发明的一个目的是确定辣椒素的抑制作用是否是由于阻止了IκBa降解的缘故。用western印迹分析测定IκBa蛋白的细胞质水平。图13A所示的结果表明，用TNF处理细胞会使迁移较缓慢的IκBa条带在5分钟内出现，在15分钟时完全消失(上图)。然而，用辣椒素预处理细胞则消除了TNF介导的迁移较慢条带的出现以及IκBa的降解(下图)。已经知道，迁移较慢的条带的出现是由IκBa中32位和36位丝氨酸的磷酸化诱导而致(参见Finco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9111884-88(1994))。
研究用辣椒素处理不同时间后的细胞胞质中的p65和IκBa水平(图13B)。在经辣椒素处理过的细胞中，IκBa(上图)和p65(下图)的细胞质水平保持不受影响。然而，在检测经辣椒素单独处理、经TNF和辣椒素一同处理或经TNF单独处理的细胞胞质和胞核中的p65水平时，发现TNF诱导p65蛋白迁移入胞核中。辣椒素本身不诱导这种迁移，但是它抑制了TNF诱导的迁移。这些结果表明辣椒素不影响p65的水平，而是阻止了依赖于TNF的向胞核转运的作用。除p65外，还检测了辣椒素对Rel蛋白家族其它成员的胞质库的影响。图13D的结果表明，辣椒素本身以及辣椒素与TNF的组合对p50或C-Rel蛋白的水平均没有影响。
实施例17辣椒素阻遏了IκBa-CAT基因的表达由于IκBa基因的启动子有NF-κB结合位点，它在NF-κB活化时受到调节，在几分钟内迅速地诱导基因表达，因此用瞬时表达试验来测定辣椒素对与CAT基因相连的、TNF诱导的IκBa启动子的影响。如所预计的，在用TNF刺激时，CAT活性几乎提高4倍(图14)。然而，当转染了pIκBCAT的细胞在TNF处理前用辣椒素预处理2小时时，TNF所增强的CAT活性明显减少。用含突变型NF-κB结合位点的IκB启动子(pmutIκBCAT)来转染没导致TNF诱导出CAT。这些结果证明了，辣椒素也能阻遏NF-κB激活剂诱导的基因表达。
本说明书中提及的任何专利或出版物均说明了本发明所属领域技术人员的水平。另外，这些专利和出版物均纳入本文作参考，其程度就如各出版物具体地和单独地纳入本文作参考一样。
本领域技术人员容易明白，本发明能够实现本文所述的目的、结果和优点，而且还能实现本文中固有的目的、结果和优点。本文所述的这些实施例、以及方法、步骤、处理、分子和具体化合物都以较佳实施例为代表，它们是示范性的，并不意味着限制了本发明的范围。本领域技术人员可以对本发明作变化以及其它应用，它们均包括在权利要求范围所明确的本发明的宗旨内。
权利要求
1.一种在体外抑制细胞内核因子NF-κB活化的方法，该方法包括用CAPE的2，5-二羟基类似物来处理所述细胞的步骤。
2.一种在体外抑制细胞内核因子NF-κB活化的方法，该方法包括用CAPE的5，6-二羟基双环类似物来处理所述细胞的步骤。
3.一种在体外抑制细胞内核因子NF-κB活化的方法，该方法包括用8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺，即辣椒素，来处理所述细胞的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述NF-κB的活化由肿瘤坏死因子来诱导。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述NF-κB的活化由佛波醇肉豆蔻酸·乙酸酯来诱导。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述NF-κB的活化由冈田酸来诱导。
7.一种在体外抑制细胞内核因子NF-κB活化的方法，该方法包括用树脂毒素来处理所述细胞的步骤。
8.CAPE的2，5-二羟基类似物在制备用来治疗个体内由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、脓毒性休克、急性时象反应、病毒感染、放射易感性、动脉粥样硬化、癌症、急性炎症或移植物抗宿主反应。
10.CAPE的5，6-二羟基双环类似物在制备用来治疗个体内由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、脓毒性休克、急性时象反应、病毒感染、放射易感性、动脉粥样硬化、癌症、急性炎症或移植物抗宿主反应。
12.8-甲基-N-香兰基-6-壬烯酰胺，即辣椒素在制备用来治疗个体内由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、脓毒性休克、急性时象反应、病毒感染、放射易感性、动脉粥样硬化、癌症、急性炎症或移植物抗宿主反应。
14.树脂毒素在制备用来治疗个体内由核因子NF-κB活化引起的病理性病征的药物中的用途。
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述病理性病征包括中毒性休克、脓毒性休克、急性时象反应、病毒感染、放射易感性、动脉粥样硬化、癌症、急性炎症或移植物抗宿主反应。
全文摘要
本发明涉及通过咖啡酸苯乙酯的两种类似物来阻断NF－κB活化的方法。另外，辣椒素(8－甲基－N－香兰基－6－壬烯酰胺)和树脂毒素抑制了不同制剂诱导活化NF－κB。而且，本发明还公开了用这些抑制剂来治疗因NF－κB活化引起的病理性病征(如中毒性休克、急性炎症、急性时象反应、动脉粥样硬化和癌症)的方法。
文档编号A61K33/40GK1495254SQ20031010287
公开日2004年5月12日 申请日期1997年9月4日 优先权日1996年9月5日
发明者B·B·阿加尔瓦尔, D·格林贝格尔, B B 阿加尔瓦尔, 直锤穸 申请人:研究发展基金会