专利名称：辽东楤木叶总皂苷及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及辽东楤木叶总皂苷及其药物组合物，特别是涉及以辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物，其制备方法以及在生产用于预防和治疗心力衰竭及心肌缺血的相关病理条件中的应用。
背景技术：
辽东楤木别名龙牙楤木，俗称刺老鸦，为五加科楤木属植物(Aralia elata(Miq.)Seem)。该植物生长于海拔1000m以下的林缘、灌目丛和河谷地带。在中国，辽东楤木主要分布于东北三省东部山区，其中仅吉林省延边地区蕴藏量可达3000多吨。中国古代就以楤木的根、根白皮及叶入药。前苏联学者曾发现辽东楤木等同属植物有“适应原”样作用，临床上用作滋补强壮剂及中枢神经系统兴奋剂。临床上用于治疗神精衰弱、风湿性关节炎、肝炎、糖尿病、胃痉挛、便秘、肾气不足等病症。另外，有人从该属植物中提取的齐墩果酸，并将其用作肝炎治疗药物。
20世纪50年代以来，关于辽东楤木根皮、树皮、叶及嫩芽的化学成分及其药理学活性的研究已取得了很大进展，并且其中主要集中在皂苷类成分的研究。例如，H.K.kohetkoy等人在辽东楤木的热甲醇提取物中分离得到三种皂苷(分别命名为楤木皂苷A、B和C)(Araloside A、B、C)。经鉴定，三种皂苷的苷元均为齐墩果酸(kochetkoy，et al.Dokl Akad Nauk，1963；150(6)1289)。继后，Dzhunibaeva T.以硅胶层析的方法从辽东楤木的叶中分离出了七种皂苷，并且这些皂苷均以齐墩果酸作作为苷元。姜永涛和徐绥绪等人从辽东楤木的根皮中分得八种化合物。杨国宏和周建等人从辽东楤木的叶中分离出6种单体化合物(杨国宏，中草药，1995；26(10)514)。另外，近年来宋少江等人从辽东楤木的根皮中分离出至少7种三萜皂苷(宋少江、李劲鸿等，中国药物化学杂志，2000；10(4)296；宋少江、卢立明等，沈阳药科大学学报，2001；18(6)462)(Shao-JiangSong，Norio Nakamura，Chao-Mei Ma，et al.Five saponins from the root barkof Aralia elata[J].Phytochemistry 56(2001)491-497)。
虽然以前曾有过一些关于辽东楤木皂苷基础研究的报道，但这些工作主要是使用辽东楤木的根皮和树皮等传统部位分离和提取个别皂苷单体，并且有关生物学活性的研究也主要是针对抗肿瘤(例如参见中国专利申请公开号1184641)、抗炎、抗缺氧以及抑制变态反应和自家免疫反应等方面。特别是，迄今尚没有关于将关东楤木叶总皂苷开发成强心药物的报导。我们在以前的大量实验室研究的基础上，第一次成功地制备了完全符合临床应用要求的，以辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分的，用于治疗和预防心力衰竭及心肌缺血所导致的相关病理条件的药物组合物，从而完成了本发明。
发明的目的本发明的一个目的是提供包括选自辽东楤木皂苷V、VII、X、楤木叶皂苷A(1)、楤木叶皂苷B(2)、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖苷、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-l-吡喃阿拉伯糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、槲皮素-3-O-β-l-吡喃鼠李糖苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷的至少十一种单体成分的辽东楤木总皂苷。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中作为所说的辽东楤木总皂苷是由辽东楤木植物的叶中提取的。
本发明的另一个目的是提供生产如上限定的辽东楤木叶总皂苷提取物的方法，特征在于其中包括使用大孔吸附树脂分离，并使用阳离子交换树脂及脱色树脂纯化辽东楤木叶总皂苷。
本发明的再一个目的是提供辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分，并含有一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中作为药物组合物中基本活性成分的辽东楤木叶总皂苷由选自辽东楤木皂苷V、VII、X、楤木叶皂苷A(1)、楤木叶皂苷B(2)、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖苷、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-l-吡喃阿拉伯糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、槲皮素-3-O-β-l-吡喃鼠李糖苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷的至少十一种单体成分组成。
本发明的再一个目的是提供生产以辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物的方法，该方法包括(1)提供辽东楤木叶总皂苷；(2)将步骤(1)得到辽东楤木叶总皂苷与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂相混合。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的药物组合物中还可另外加入一种或多种天然或化学合成的、与基本活性成分辽东楤木叶总皂苷有辅助或协同作用的其他活性成分。
本发明的再一个目的是提供以辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物在生产用于预防和治疗心力衰竭及心肌缺血相关病理条件中的应用。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的心功能不全相关疾病包括各种原因导致的心力衰竭。
发明的具体内容本发明提供了由辽东楤木叶中分离并提取的总皂苷及其药物组合物，特别是提供了以辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物，其制备方法以及其在生产用于预防和治疗人或动物心力衰竭及心肌缺血相关病理条件中的应用。
为了得到本发明的药物组合物，必须首先制备辽东楤木叶总皂苷。本发明人研究发现，辽东楤木叶总皂苷很易溶于水和甲醇、乙醇等极性较大的有机溶剂，但较难溶于氯仿等极性小的有机溶剂。根据这一化学性质，我们利用自己建立的方法，从辽东楤木叶分离并提取得到至少十一种具有三萜皂苷结构的化合物。这些化合物的配基(苷元)均为齐墩果酸和常春藤，糖基部分则是通过糖苷键和酯苷键结合在配基的C-3羟基与C-28羧基上。
虽然可以从辽东楤木的任何可药用部分，例如植物的根、根皮、树皮、茎、叶及嫩芽中分离得到辽东楤木叶总皂苷，但在大量采集这些材料的情况下，使用植物的根、根皮、树皮等传统部位作为材料来源，常常会造成天然资源的破坏。因此，为了防止资源的破坏，本发明中特别使用辽东楤木叶作为提取总皂苷的材料来源。
为了得到辽东楤木叶总皂苷，可以采用水煮法提取预清洗的辽东楤木叶，然后收集提取液并向其中加入适当量的石灰乳，以除去黄酮和鞣质等杂质；过滤后收集滤液过大孔吸附树脂(例如AB8、D4020、D101、M130等)柱。水洗脱至流出液无色，以除去滤液中的糖类和蛋白质等杂质。然后，用乙醇(50％～95％)洗脱树脂，以将吸附到树脂柱的总皂苷等成分洗脱下来。然后收集洗脱液并进一步过阳离子交换树脂柱，以除去阴离子杂质。最后再使此洗脱液过脱色树脂(如D941等阴离子交换树脂)柱，以除去色素等杂质并使终产物脱色，干燥后得到纯度约在80％以上的辽东楤木总皂苷的白色粉末状产物。
与现有技术中通常使用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等易燃有毒液体作为有机溶剂的方法(参见祁风香等.黑龙江医药；1997；5(10)284；杨国宏.中草药；1995；10(26)；中国专利申请公开号1184641)不同，本发明方法的主要特征在于，不仅使用辽东楤木叶作为材料来源，而且其中所使用的有机熔剂也只是相对稳定和安全的乙醇。因此，与现有技术相比，本发明的方法大大降低了生产成本、减小了自然资源的破坏和环境的污染，并且特别适于产品的大规模工业化生产。
另外，本发明的方法还首次将大孔吸附树脂、离子交换树脂以及脱色树脂层析联合应用于辽东楤木叶总皂苷的分离纯化。
使用质谱(MS)、红外光谱(IR)、核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)等检测方法，对薄层层析分离到的至少十一种化合物进行结构鉴定，结果表明化合物均具有三萜皂苷大杂环结构，其中配基分别为齐墩果酸或常春藤皂苷元，糖基包括葡萄糖、鼠李糖及阿拉伯糖，并且这些糖基分别通过糖苷键和/或酯苷键结合到配基的C-3羟基与C-28羧基上。
因此，根据本发明的优选实施方案，其中所说的辽东楤木叶总皂苷占所说的药物组合物的80％(w/w)以上，并且所说的辽东楤木叶总皂苷至少包括辽东楤木皂苷V、VII、X、楤木叶皂苷A(1)、楤木叶皂苷B(2)、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖苷、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-l-吡喃阿拉伯糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、槲皮素-3-O-β-l-吡喃鼠李糖苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷的至少十一种单体成分。由此可见，以秋季枯黄前的辽东楤木叶这一常常被视为废弃物的辽东楤木植物地上部分为原料，可以使用相对比较简单的提取工艺，生产出纯度约达80％(w/w)的辽东楤木叶总皂苷提取物。
可以单独或联合使用按本发明方法分离并提取的辽东楤木叶总皂苷制备适于临床应用的药物组合物。例如，可按照制药工业中已知的方法(如参见Remington’s Pharmaceutical Science.15thed.，Mack PublishingCompany，1980)将本发明的辽东楤木叶总皂苷与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或稀释剂按适当的比例混合，并按已知方法除菌后制成本发明的药物组合物。
根据给药途径的不同，可将本发明的药物组合物配制成适于静脉内、肌肉内、体腔内、组织内、皮内或皮下给药的可注射的溶液剂或分散剂；或适于口服给药的粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、乳剂、胶囊剂；或适于局部给药和通过皮肤或粘膜吸收给药的喷雾剂、凝胶剂、含片或栓剂。
为了制备适于胃肠道外途径给药的可注射溶液剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠或葡萄糖溶液，或低浓度磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有乙醇、多元醇(如乙二醇、丙二醇及液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的，并能够对抗细菌和真菌等微生物的污染。必要时，可加入抗氧化剂(如抗坏盐酸)、抗生素(如青霉素和链霉素或其他抗真菌剂)及防腐剂(如苯甲酸钠、度米酚、山梨酸等)，以及增溶剂和用于维持分散剂中所需颗粒大小的表面活性剂。
例如，可以首先将精确称取的辽东楤木叶总皂苷粉末100g溶解于注射用水2000ml中并将所得溶液调到pH＝6.5～7.5。然后，向所得溶液中加入活性碳6g(0.3％，w/v)，并在沸水浴中加热10～15分钟。常规过滤并用0.02μ微孔滤膜过滤除菌后，即制得到可供肌肉内或静脉内注射给药的辽东楤木叶总皂苷水溶液。
将精确称取的辽东楤木叶总皂苷粉末100g及甘露醇80g溶解于注射用水2000ml中。向所得溶液中加入活性碳6g(0.3％，w/v)，并在沸水浴中加热10～15分钟。常规过滤并用0.02μ微孔滤膜过滤，分装并冷冻干燥后即制得到可供肌肉内或静脉内注射给药的辽东楤木叶总皂苷粉针。
为了制备适于口服给药的片剂、粉末剂、胶囊剂、颗粒剂或乳剂，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖等二糖，或甘露醇、山梨醇等六碳多羟基醇，以及玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素等作为载体或赋形剂。必要时，也可在这些口服制剂中加入崩解剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、香料、分散剂及表面活性剂。
另外，也可使用制药工业中已知的方法和辅助成份，将本发明的药物组合物制成微胶囊剂或脂质体包裹剂。
本发明进一步提供了所说的含有辽东楤木叶总皂苷的药物组合物在治疗或预防心肌相关病理条件特别是心力衰竭中的应用。
为此，我们利用戊巴比妥钠诱发的实验性心力衰竭动物模型，观察了本发明的以辽东葱木叶总皂苷为基本或活性成分的药物组合物对大鼠在体心力衰竭后的血压和工作心脏血流动力学的影响。
一般药理学和药效学实验表明，本发明的药物组合物对动物(小鼠、大鼠和犬)的活动和行为没有明显影响。但本发明的药物组合物对戊巴比妥钠诱发的实验性心力衰竭动物的血压则具有明显的升高作用。例如，给实验性心力衰竭犬静脉内注射本发明的药物组合物(1.4mg/kg)，可使动物的血压明显升高，并可维持达180分钟以上。此结果与阳性对照药物去乙酰毛花苷的作用相似。
在此基础上，我们特别就本发明的药物组合物对实验性心力衰竭动物(犬和大鼠)的血液动力学进行了多指标观察。其中以生理盐水作为阴性对照，并以去乙酰毛花苷作为阳性对照药物。从心功能的各项指标变化可以看出，静脉注射本发明的药物组合物后，动物心功能各项指标得到显著改善，并且其效果与强心苷类药物去乙酰毛花苷相似，提示本发明的药物组合物具有良好的抗心力衰竭作用。例如，我们的实验结果显示，本发明的药物组合物可明显地改善动物的左心室内压(LVSP)，提高左心室内压最大变化速率(±dp/dtmax)，以及心排出量(CO)、心搏出量(SV)，以及心脏指数(CI)和心博指数(SI)。上述这些结果也与阳性对照药物去乙酰毛花苷的作用相似。
另外，我们的实验结果还表明，不同剂量的辽东楤木叶总皂苷对血流动力学的作用不同，并且随着辽东楤木叶皂苷含量的增加，各项血流动力学指标亦相应升高，从而显示出一定的剂量-效应依赖关系。
本发明的药物组合物适用于预防和治疗心力衰竭和心肌缺血相关的各种疾病，这些疾病或病理条件包括但不只限于例如因先天性心脏病、心脏瓣膜病、肺源性心脏病、冠状动脉硬化性心脏病、高血压性心脏病、感染性和非感染性心肌炎、弥漫性血管内凝血、全身重症感染，以及失血性休克等引起的心力衰竭，以及冠状血管循环障碍等原因引起的心肌缺血。
根据使用目的的不同，本发明的药物组合物除含有作为基本活性成分的辽东楤木叶总皂苷外，还可含有一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物。
根据本发明，所说的其他活性成分包括但不只限于天然来源的或合成的强心剂(如去甲基肾上腺素、洋地黄甙等)、冠状血管扩张剂(如硝酸盐类制剂、钙离子拮抗剂等)、抗高血压剂(如β受体阻止剂、利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂等)，抗感染剂(如青霉素、链霉素等).
一般说来，本发明的药物组合物的口服给药剂量为0.5-50mg/kg/天，最好为1-20mg/kg/天；肌肉或静脉内注射给药剂量为0.1-20mg/kg/天，最好为0.5-10mg/kg/天。当然，确切的给药剂量应根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状态，以及病人对所用药物的敏感性、耐受性和给药方式等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。
下列实施例旨在进一步举例描述而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例实施例1辽东楤木叶总皂苷提取物的制备(1)称取干燥辽东楤木叶1kg，洗净并捣碎后向其中加入约13倍体积的水。浸泡2小时后加热煮沸约2.5小时，滤过，并再加水煎煮两次。其中加水量依次为药材重量的10、8倍，煎煮时间依次为2.0、1.5小时。然后合并煎煮液，并加石灰乳调节溶液pH值至11。放置12～24小时，滤过后，将滤液缓慢注入预处理的AB8型大孔吸附树脂(2kg)柱中，并用水洗脱至流出液无色。弃去水洗脱液，再用80％乙醇洗脱至流出液无色。然后于室温下过强酸性苯乙烯阳离子交换树脂001*7(732)[氢型]树脂(0.1kg)柱，并用95％乙醇洗脱。流出液再过D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂(0.3kg)柱，并用95％乙醇洗脱。然后收集洗脱液，减压浓缩并回收乙醇后，得到干燥的辽东楤木叶总皂苷32g(收率3.2％)。
实施例2辽东楤木叶总皂苷提取物的制备(2)称取干燥辽东楤木叶1kg，洗净并捣碎后向其中加入约13倍体积的水。浸泡2小时后加热煮沸约2.5小时，滤过后再加水煎煮两次(加水量依次为药材重量的10、8倍，煎煮时间依次为2.0、1.5小时)。然后合并煎煮液，并加石灰乳调节溶液的pH值至11。放置12～24小时，滤过后，将滤液缓慢注入预处理的D4020型大孔吸附树脂(2kg)柱中，并用水洗脱至流出液无色。弃去水洗脱液，再用85％乙醇洗脱至流出液无色。然后于室温下过强酸性苯乙烯阳离子交换树脂001*7(732)[氢型]树脂(0.1kg)柱，并用95％乙醇洗脱。流出液再过D941型大孔弱碱性阴离子交换树脂(0.3kg)柱，并用95％乙醇洗脱。然后收集洗脱液，减压浓缩并回收乙醇后，得到干燥的辽东葱木叶总皂苷31g(收率3.1％)。
实施例3本发明的药物组合物对心力衰竭模型犬的血液动力学的影响本实施例说明本发明以辽东葱木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物对实验性心力衰竭犬心脏功能及血流动力学的影响。
将体重约13-17kg的雄性和雌性杂种犬30只随机分成五组，每组六只。以戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)静脉内注射麻醉后，常规行气管插管并连接电动呼吸机(呼吸量3-4kpa)；分离右侧颈总动脉并插入血压测量装置；分离颈外静脉、插管并连接输液用的恒速输液泵。然后，于左侧第四肋间开胸，剪开心包膜分离主动脉根部，置入电磁流量计探头以記录心输出量(CO)。同时分离右侧股动脉，进行左心室插管以备测定并記录左心室内压(LVSP)(信号经直流放大器放大10倍)和左室舒张末压(LVEDP)(Kpa)。将LVSP电信号输入微分器描记dp/dt曲线，并从dp/dt曲线测得左心室内压最大变化速率(±dp/dt max)(Kpa/秒)。动物四肢连接心电电极，記录标II导联心电图(ECG)，同时用心率计测定心率(HR)。上述各心脏功能及血流动力学参数均同时记录于多导生理记录仪上。
完成手术并稳定十分钟后，记录动物用药前的上述各项心脏功能及血流动力学参数。实验前，所有动物均经静脉恒速输入3％戊巴比妥钠溶液，以造成心力衰竭模型(以动物主动脉平均血压(MBP)下降40-50％，±dp/dtmax下降70％以上作为心力衰竭的指征)。然后，阴性对照组和阳性对照组动物分别静脉内注射等体积的生理盐水或去乙酰毛花苷注射液(0.015mg/kg) (无锡市第七制药厂生产，批号990801)。三个实验组的动物则分别静脉内注射小剂量(1.4mg/kg)、中剂量(2.8mg/kg)和大剂量(5.6mg/kg)本发明的药物组合物。
分别于给药后5、30，60，120、180和240分钟检测并记录各组动物的上述血流动力学参数。实验结果如下列表1至表3所示。
表1 本发明药物组合物(注射液)对心衰模型犬的血压的影响(X±SD)
与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表2 本发明药物组合物注射液对左心室内压最大变化速率(Kpa/秒)的影响(X±SD)
与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表3 本发明药物组合物对心力衰竭模型犬的左室舒张期末压(kPa)的影响(X±SD)
从表中可以看出戊巴比妥钠造衰后，犬心功能明显下降，以心力衰竭后的各项心功能参数为对照。静脉注射生理盐水后，心功能无明显改变，而静脉注射辽东葱木叶总皂苷后，心功能显著提高。证明辽东葱木中叶总皂苷具有抗心力衰竭作用，而且其效果与已知的强心苷类药物去乙酰毛花苷相似。
实施例4本发明的药物组合物对心力衰竭模型大鼠的血液动力学的影响本实施例说明本发明以辽东葱木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物对实验性心力衰竭大鼠心脏功能及血流动力学的影响。
将体重约250-320g的Wistar大鼠50只，随机分为五组，每组10只。经腹腔注射20％氨基甲酸乙酯(1.2g/kg)麻醉动物后，分离右侧颈总动脉，行左心室插管，检测并记录心功能参数；分离右侧股动脉并行动脉内插管，记录动脉血压变化；同时分离同侧股静脉行静脉插管，建立给药途径。通过换能器将心室插管和动脉插管的非插入端与四导生理记录仪及微机相连，同步监测并记录左室收缩压(LVSP)，左室最大上升和下降速率(±dp/dtmax)，左室舒末压(LVEDP)，收缩压(SAP)，舒张压(DAP)和心率(HR)。
完成手术并稳定十分钟后，记录动物用药前的上述各项心脏功能及血流动力学参数。实验前，所有动物均经静脉恒速输入3％戊巴比妥钠溶液，以造成心力衰竭模型(以动物主动脉平均血压(MBP)下降40-50％，±dp/dtmax下降40％以上作为心力衰竭的指征)。然后，阴性对照组和阳性对照组动物分别静脉内注射等体积的生理盐水或去乙酰毛花苷注射液(0.015mg/kg)(无锡市第七制药厂生产，批号990801)。实验组静脉内注射本发明的药物组合物10mg/kg。
分别于给药后5、10，20，30分钟检测并记录各组动物的上述血流动力学参数。实验结果如下列表4至表10所示。
表4.本发明的药物组合物对心力衰竭大鼠在体工作心脏收缩压(kPa)的影响(X±SD)
与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
表5.本发明的药物组合物对大鼠在体工作心脏舒张压(kPa)的影响(X±SD)
与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表6 本发明的药物组合物对大鼠在体工作心脏左室最大上升速率(kPa/s)的影响(X±SD)
与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表7 本发明的药物组合物对大鼠在体工作心脏左室最大下降速率(kPa/s)的影响(X±SD)
与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表8 本发明的药物组合物对大鼠在体工作心脏左室收缩压(kPa)的影响(X±SD)
与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表9.本发明的药物组合物对大鼠在体工作心脏左室舒末压(kPa)的影响(X±SD)
与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
表10.本发明的药物组合物对大鼠在体工作心脏心率(bpm)的影响(X±SD)
与给药前进行比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001从表4-10所示的结果可以看出，静脉内注射戊巴比妥钠造成心力衰竭后，大鼠心功能明显下降。静脉注射生理盐水后，心力衰竭动物模型的各项心功能参数无明显改变，而静脉注射本发明药物组合物和阳性对照药物去乙酰毛花苷(无锡市第七制药厂)后，则动物的各项心功能参数均得到明显改善。其中+dp/dtmax分别从治疗前的163kPa/s和144kPa/s上升到295kPa/s(上升率为80.9％，P＜0.001)和222kPa/s(上升率为54.2％，P＜0.001)。-dp/dtmax分别从治疗前的-140kPa/s和-130kPa/s下降到-218kPa/s(下降率为55.7％，P＜0.001)和-190kPa/s(下降率为43.9％，P＜0.001)。从这些结果可以看出，本发明的以辽东葱木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物确实可使实验动物各项心脏功能参数得以明显改善，并且其效果可与已知的强心苷类药物去乙酰毛花苷相比。因此，本发明的药物组合物很有可能作为一种候选强心药物，用于各种原因导致的心力衰竭的治疗。
实施例5辽东葱木叶总皂甙对急性心肌梗塞犬心的保护作用本实施例举例说明作为本发明以辽东葱木叶总皂甙为基本活性成分的药物组合物对实验性心肌梗塞犬心电图、血清CPK和过氧化脂质(LPO)水平及心肌梗塞面积的影响。
将体重为11至15kg的健康杂种犬18只。随机分成三组。每组各6只。实验中，在戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉下，与左侧第四肋间开胸，结扎左冠状动脉前降支中点，或最大斜角支根部，造成实验性急性心肌梗塞模型。结扎冠脉30分钟后给药(以1ml/分钟的速度自颈外静脉输注)实验组动物静脉内接受本发明的药物组合物(5.6mg/kg)；阳性对照组动物静脉内接受β受体阻滞剂普萘洛尔(1mg/kg)；阴性对照组动物静脉内接受等体积的生理盐水。
对所有模型动物进行左侧颈总动脉插管及心尖部插管，于造成心肌梗塞前后和给药前后监测并记录心肌力学与血流动力学参数，同时在左心室的缺血区，边缘区，正常区用多点吸附电极记录心外膜电图，同时记录多导联心电图。这些参数包括心率(HR)、左室收缩压(LVSP)、室内压最大升降率(±dp/dtmax)、左室舒末压(LVEDP)、主动脉收缩压(SAP)、主动脉流量(AF)、每搏输出量(SV)、冠脉流量(CEF)。
同时定时采集血样并以常规方法检测血清磷酸激酶(CPK)(IU/L)，和过氧化脂质(LPO)(ug/ml)浓度。并且计算心外膜电图ST段抬高的总和(∑ST)，以抬高≥2mv的导联数占总电极数的百分比(NST)。另外，还于实验记录结束后处死动物，用硝基四氮唑蓝(N-BT)着染心脏组织并以称重法测定心肌梗塞面积(MIS)。结果如下列表11-13所示。
表11 龙芽葱木叶总皂甙组合物对犬血清CPK和LPO含量的影响
*与阴性对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表12 龙芽葱木叶总皂甙对犬梗塞后6小时胸前多导联ECG的影响
*P＜0.05。
表13 龙芽葱木叶皂甙对心肌梗塞犬心肌梗塞面积的影响(x+SD，n＝6)
与生理盐水对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01***p＜0.001；变化百分率与盐水组比较，*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001。
当心肌缺血缺氧时，胞浆膜通透性增大，致使胞内酶释入血流并因而使血清CPK活性和LPO含量增加。从表11中所示的结果可以看出，结扎冠状血管导致心肌缺血性损伤的缺血对照组动物的血清CPK总活性显著高于空白对照组(P＜0.05)。经口投用β受体阻滞剂普萘洛尔或辽东葱木叶总皂甙组合物后可使血清CPK活性的增加受到显著抑制，并抑制作为心肌缺血性损伤指征的心肌LPO水平，表明本发明的辽东葱木叶总皂甙组合物与已知的抗心肌损伤药物普荼洛尔具有几乎完全相同的保护功能。
表12显示了动物心肌梗塞后6小时胸前多导联心电图相关检测参数的检测结果。作为监测心肌梗塞发生和其严重程度、评价梗塞面积大小的粗略定量指标，胸前多导联ECG中的NST可大致反映心肌梗塞面积，∑ST大致反映心肌梗塞程度，∑Q大致反映心肌坏死程度，NQ则大致反映左心室收缩能力降低程度。从表12中所示的数据可以看出，心肌梗塞后静脉内投用龙芽葱木叶总皂甙组合物，可显著地减小胸前多导联ECG缺血性改变(P＜0.05)。
大体心肌组织标本的N-BT染色结果表明，投用龙芽葱木叶总皂甙组合物可明显地减小心肌梗塞面积(参见表13)，这一直观结果与ECG检测结果完全相符。
权利要求
1.包括选自辽东楤木皂苷V、VII、X、楤木叶皂苷A(1)、楤木叶皂苷B(2)、常春藤皂甙-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖甙、常春藤皂甙-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-l-吡喃阿拉伯糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯甙、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯甙、槲皮素-3-O-β-l-吡喃鼠李糖甙、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯甙、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖甙的至少十一种单体成分的辽东楤木总皂苷提取物。
2.根据权利要求1的提取物，其中所说的辽东楤木总皂苷是由辽东楤木植物的叶中提取得到的。
3.生产权利要求1的辽东楤木叶总皂苷提取物的方法，特征在于其中包括使用大孔吸附树脂分离，并使用阳离子交换树脂及脱色树脂纯化辽东楤木叶总皂苷。
4.以辽东楤木总皂苷提取物为基本活性成分，并且含有一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
5.根据权利要求3的药物组合物，其中作为基本活性成分的辽东楤木叶总皂苷包括选自辽东楤木皂苷V、VII、X、楤木叶皂苷A(1)、楤木叶皂苷B(2)、常春藤皂甙-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖甙、常春藤皂甙-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-l-吡喃阿拉伯糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯甙、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯甙、槲皮素-3-O-β-l-吡喃鼠李糖甙、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃半乳糖-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯甙、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖甙的至少十一种单体成分。
6.根据权利要求3的药物组合物，其中还可另外含有一种或多种天然或化学合成的、与基本活性成分辽东楤木叶总皂苷有辅助或协同作用的其他活性成分。
7.根据权利要求1或2的辽东楤木总皂苷提取物在生产用于预防和治疗心力衰竭及心肌缺血的相关病理条件或疾病中的应用。
全文摘要
本发明涉及辽东楤木叶总皂苷及其药物组合物，特别是涉及以辽东楤木叶总皂苷为基本活性成分的药物组合物，其制备方法以及在生产用于预防和治疗人或动物心肌功能不全相关病理条件中的应用。
文档编号A61K31/704GK1552723SQ20031010993
公开日2004年12月8日 申请日期2003年10月24日 优先权日2003年10月24日
发明者赵春燕, 王志才, 陈燕萍, 张雷, 马兴元 申请人:吉林大学