专利名称：抗hpv疫苗的载体以及该载体转化的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达抗乳突淋瘤病毒表面抗原疫苗的载体、微生物转化株、以及利用所述微生物转化株或其纯化提取物的疫苗。
背景技术：
细胞表面展示是一种新的技术，利用该技术可表达目的蛋白并将其连接到微生物的细胞表面，其通过分子生物学信息对蛋白质分泌的机制进行阐述。更确切地说，细胞表面展示使用来源于细菌、酵母等微生物细胞表面蛋白作为表而锚定基序(motif)而在细胞表面生成外源性蛋白。该技术应用广泛，可用于制备重组活疫苗、制备筛选肽、抗原文库、以及制备全细胞吸收剂和全细胞生物转化催化剂等。也就是说，由于在细胞表面表达的多种外源性蛋白决定了工业应用的范围，因此该项技术具有潜在巨大的工业利用价值。
细胞表面载体对于外源性蛋白在细胞表面成功表达是最重要的因素。对于该项技术来说，必须选择一种用于在细胞表面表达外源性蛋白的有效的锚定基序。
相应地，表面表达载体需要具有下述特征首先，一些分泌信号对于协助外源性蛋白穿过细胞内膜和最终到达细胞表面是必须的。其次，在将外源性蛋白稳定锚定在细胞外表免得过程中需要靶信号。第三，即使在细胞表面大量表达，锚定基序也不影响细胞生长。第四，不论蛋白的尺寸多大，外源性蛋白需保持所表达的3维结构的稳定性。但是，满足上述条件的表面表达载体仍未发现，而仅能对上述缺点进行部分克服。
广义说来，表面锚定载体目前被分为4类，包括细胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、以及诸如鞭毛蛋白等表面细胞器官蛋白。对于戈兰氏阴性细菌来说，诸如Lam B，Pho E(Charbit etal.，J.Immunol.，1391658-1664，1987；Agterbergetal.，Vaccine，885-91，1990)，以及Omp A等表达于细胞外表面的表面蛋白通常可用作表面锚定载体。除此之外，还采用诸如Tra T(Felici etal.，J.Mol.Biol.，222301-310，1991)、肽聚糖相关脂蛋白(PAL)(Fuchs etal.，Bio/Technology，91369-1372，1991)、Lpp(Francisco etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713-2717，1992)等脂蛋白，以及诸如I型纤毛的Fim A或Fim H粘合素(Hedegaard etal.，Gene，85115-124，1989)等纤毛蛋白和诸如Pap A pilu亚单位等菌毛蛋白都曾尝试用于制备外源性蛋白。此外，有报道说，冰核蛋白(Jung etal.，Nat.Biotechnol，16576-560，1998；Jung etal.，Enzyme Microb.Technol，22(5)348-354，1998)；Lee etal.，Nat.Biotechnol.，18645-648，2000)，Klebsiella oxytoca支链淀粉酶(Kornacker etal.，Mol.Micro.，41101-1109，1990)、以及Neisseria IgA蛋白酶(Klauser etal.，EMBOL.，91991-1999，1990)等也可作为表面锚定基序。对于戈兰氏阳性细菌来说，已知通过使用来源于葡萄状球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A作为表面锚定基序能有效制备疟疾抗原，并且来源于乳酸菌的一种表面包衣蛋白在细胞表面有良好展示。因此，已证实戈兰氏阳性细菌的表面蛋白可成为细胞表面锚定蛋白。
此前本发明人对来源于Bacillus sp.菌株的poly-x谷氨酸盐和pgs BCA的合成复合基因是否能用作新的表面锚定基序进行了研究。在实践中，pgs BCA基因能用于开发在微生物表面表达外源性蛋白的新的表达载体以及用于在细胞表而大规模制备外源性蛋白(韩国专利申请No.10-2001-48373)。
此外，还尝试使用上述表面表达载体通过基因工程技术在高表达细菌表面制备多种致病性抗原或抗原决定簇。特别地，有报道说，与诸如减毒致病性细菌或病毒等传统疫苗相比较，当外源性免疫原表达在非致病性细菌表面并口服用作活疫苗时，能产生更加持久且强大的免疫反应。
微生物表面结构作为佐剂增强了在细胞表面表达的外源性蛋白质的抗原性，因此已知免疫反应能在机体内被活细菌所诱导。通过该表面表达系统来开发出非致病性细菌的重组活疫苗是一件值得关注的事件。
据推测，人乳突淋瘤病毒(下文称作“HPV”)在世界范围内感染了50％以上的成人。特别地，已经证实包括HPV16，18，31和45的四种HPV其80％以上能够导致宫颈癌(Lowry D.R.，Kimbauer R.，Schiller J.T.，Proc.Natl.Acad.Sci.，912436-2440，1994)。乳突淋瘤病毒是一种高度种属特异性的小DNA肿瘤病毒，其属于Papovaviridae家族，感染诸如人类、牛、兔、羊等哺乳动物，使得皮肤或者粘膜长疣或者乳突淋瘤(Pfister H..，Adv.Cancer Res.48113-147，1987)。在这些种属中，已知HPV具有约70种不同类型，并且其中的20类以上能够导致皮肤粘膜或者口腔或者生殖器产生肿瘤。更特异地，有报道说，HPV16(型)和HPV18能够导致女性的宫颈癌。
宫颈癌在女性中发生频繁，在世界范围内，仅次于乳腺癌。WHO报道说，世界范围内，每年新发作的宫颈癌超过5百万例，每年因宫颈癌死亡的患者超过3百万例。尤其在发展中国家，宫颈癌是妇女死亡的主要原因(Pisani P.，Parkin D.M.，Ferlay J.，Int.J.Cancer 55891-903，1993)。IARC统计表明，由于发展中国家中的慢性病人要远多于发达国家，因此根除乳突淋瘤病毒感染的最有效途径是提前给予预防性疫苗。
为了开发出针对病毒的某一疫苗，应该正确装备使用动物培养系统以大规模制备纯化病毒颗粒。但是，HPV在体外或体内都难于转变为病毒颗粒，这是由于其病毒粒子仅在完全分化的角化细胞中形成。因此，开发用于预防和治疗宫颈癌的疫苗以及制备足够多的用于该项研究的病毒存在严重问题。广义来说，包括预防性疫苗以及治疗性疫苗在内的两种类型的疫苗都集中在制备针对宫颈癌的疫苗的方法上。为了这一目的，预防性疫苗产生较强的针对HPVL1/L2抗原的中和抗体，从而阻止宿主的HPV感染。即使已经感染，该疫苗也可使疾病不再发展。同时，治疗疫苗使用HPV E6/E7，包括特异性的细胞免疫反应，使损伤或者恶性肿瘤消退。
在对过去20年的研究中发现，感染人上皮细胞的HPV具有多种基因型，与几种良性和恶性肿瘤相关。对HPV的这些实验数据以及研究促进了HPV疫苗的发展。在几种HPV疫苗候选物中，HPV重组病毒样的颗粒被认为更具前景，这是由于在动物和人的疫苗有效性实验中发现，其比除乳突淋瘤病毒外的其它病毒具有更好的免疫反应(Koutsky L.A.，Ault K.A.，Wheeler C.M.，Brown D.R.，Barr E.，Alvarez F.B.，Chiacchierini L.M.，Jansen K.U.，N.Engl.J.of Med.347(21)1645-1651，2002)。此外，近来还证实HPV感染是癌症发作的基本原因，科学家对HPV研究的兴趣浓厚，并直接参与到该项研究中，从而加速了全球HPV疫苗的研发。目前，已知的HPV疫苗有HPV重组蛋白，HPV重组病毒样的颗粒，以及HPV DNA等加工制品。
在细菌、酵母、以及动物细胞等中，通过重组DNA技术制备的一些HPV部分组合物以及一些主要表位通过化学合成的合成肽都试图用于开发疫苗。一般说来，重组蛋白通过诸如细菌、酵母、杆状病毒、重组牛痘病毒等常规系统进行制备，已经完成了一些制备HPV重组蛋白的研究，并鉴别了其对血清中HPV的抗体形成能力以及诱导细胞免疫反应的能力等。但是，利用动物和昆虫细胞的病毒系统并不适于使用，因为其在培养过程中容易污染且难于纯化。由于在发展中国家经常发现乳突淋瘤病毒感染患者，因此包括合成肽在内，全部费用过高，不适于工业应用。
实际上，已有报道说将HPV L1病毒样的颗粒(下文称作“VLP”)通过哺乳动物腺细胞培养制备成为活的重组牛痘病毒(Hagensee，M.E.，Yaegashi，N.，Gallowat，D.A.，J.Virol.67315-322，1993)，并报道说VLP在小鼠模型系统中产生中和抗体(Schiller J.T.，Lowry，D.R.，Seminars in Cancer Biol.7373-382，1996)。利用仅在宫颈癌中表达的HPV E6和E7蛋白来开发治疗疫苗(Bubenik J.，Neoplasma 49285-289，2002)。此外，研究发现HPV E6/E7蛋白是治疗宫颈癌的免疫靶点，并且由于其是癌症特异性抗原并且与HPV感染细胞的癌化相关，因此将其用于开发治疗疫苗。实际上已经证实，当给肿瘤细胞感染小鼠注射由微生物系统制备的HPV E6/E7蛋白时，肿瘤形成将得到阻止及延迟(GaoL.，Chain B.，Sinclair C.，J.Gen.Virol.75157-164，1994；MeneguzziG.，Cern C.，Kieny M.P.，Virology 18162-69，1991)。如在其它情况下所示，活病毒疫苗具有促进病毒过度增殖以及易于保持在研究水平的问题。不幸地，需要很长时间才能将其商业化并且需要相当的临床试验。为了克服上述问题，尝试了被抑制或具有复制缺陷的病毒载体，但是还尚未商业应用(Moss B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311341-11348，1996)另一方而，目前利用细菌载体进行疫苗研究非常活跃。已经发现由减毒Salmonella typhimurium生成的HPV 16VLP在小鼠黏膜或者整个体内能够诱导性生成抗原特异性抗体。此外，由合成肽所构成的疫苗仅使用必要合成表位就能诱导接种疫苗的免疫反应，并特别阐述了诱导针对HPV 16 E6/E7细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Ressing M.E.，Sette A.，Brandt R.M.，J.Immunol.1545934-5943，1995)。
除了上述研究外，还利用包括番茄、马铃薯等蔬菜在植物中制备病毒抗原，并且还尝试利用蔬菜转化株本身制备成疫苗或者可食用的疫苗。作为模型，举出了乙型肝炎表面抗原颗粒(Thavala Y.F.and C.J.Artzen.Proc.Natl.Acd.Sci.USA 923358-3361)以及乳突淋瘤病毒的衣壳蛋白L1和L2(韩国专利申请10-2000-0007022)。但是，在植物系统中，HPV L1蛋白的表达量太小，难于进行纯化，因此限制了其商业应用。
因此，由于入乳突淋瘤病毒被认为通常感染发展中国家的人群，为了抑制并有效控制由于皮肤粘膜或者口腔或者生殖器官的乳突淋瘤病毒引起的肿瘤，迫切需要开发出更加经济稳定的制备人乳突淋瘤病毒抗原的新方法。
本发明公开为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供重组载体以及微生物转化株，其能通过微生物表面表达系统生成HPV抗原。
另外，本发明另一目的在于提供一种治疗和预防粘膜肿瘤的疫苗，该疫苗包括HPV抗原表达至细胞表面的微生物转化株、由转化株提取的粗的HPV抗原或者由微生物转化株纯化的HPV抗原作为有效成分。
为了完成上述目的，本发明提供了用于制备疫苗的表面表达载体，该载体包括一种或两种以上编码poly-x-谷氨酸合成酶复合物的基因，选自pgs B、pgsC和pgs A和人乳突淋瘤病毒(HPV)的表面抗原蛋白基因。
本发明所提及的基因pgs B，pgs C和pgs A分别包括SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3序列。
本发明的表面抗原蛋白基因可以是编码HPV表面成分蛋白的任意基因。例如，人乳突淋瘤病毒的衣壳蛋白，HPV L1或HPV L2蛋白基因可单独使用或者两种以上基因一同使用。优选使用主要衣壳，HPV L1抗原蛋白基因。
本发明的肿瘤相关抗原基因可以是编码HPV的肿瘤相关蛋白和人乳突淋瘤病毒的肿瘤相关抗原HPV E6或HPV E7的抗原蛋白基因中任意类型的基因，可单独使用或者两种以上基因一同使用。还可将修饰的肿瘤相关基因E6和E7用作抗原，并且HPV的主要肿瘤相关抗原蛋白E7抗原蛋白优选被使用。
更优选地，编码本发明的poly-x-谷氨酸合成酶复合物的基因可以是pgs A。
进一步地，本发明涉及利用重组载体转化的微生物转化株来制备上述疫苗。
只要对活体无毒或者减毒，任意类型的微生物都可用于本发明。例如，大肠杆菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、牛分枝杆菌、以及志贺氏痢疾杆菌等可选择作为戈兰氏阴性细菌，杆状菌、乳酸菌、乳球菌、葡萄球菌、单核细胞增生利斯特菌(Lysteria monocytogenesis)、链球菌等可作为戈兰氏阳性细菌。
本发明提供了多种用于治疗和预防粘膜肿瘤的疫苗，其利用在细胞表面表达抗原蛋白的微生物转化株本身，或利用裂解微生物之后提取的细胞膜成分的粗提取物，或者利用由微生物提纯的抗原蛋白本身作为有效成分。也就是说，本发明的疫苗能被用于治疗或预防由HPV引起的并在口腔或生殖器的粘膜中发生的肿瘤的治疗剂或预防剂，尤其用作女性宫颈癌的治疗剂或预防剂。
本发明的疫苗可口服给药或者可食用，可通过皮下或者腹膜内给药，也可做成生殖器官用的洗液。当直接施用至女性生殖器官时，宿主细胞优选自本领域技术人员所知的乳酸菌sp菌株等可用细菌。
此外，本发明的疫苗还可为鼻腔喷雾剂。
由于HPV感染通常发生于粘膜表面，因此黏液免疫对于控制HPV感染是非常重要的。由于在细胞表面表达HPV抗原的微生物能更有效地诱导膜上的黏液反应，因此预计利用微生物转化株本身的疫苗在抑制HPV方面要比传统的疫苗具有更好的效果。
具体地说，本发明提供了用于疫苗的重组载体，pHCE2LBpgsA-HPV L1(参见
图1)，其包括pgs A基因，它是来源于杆状菌sp菌株并能表达HPV L1蛋白的poly-x-谷氨酸合成酶复合物基因、将pgs A的C-末端和HPV L1的N-末端连接到戈兰氏阴性细菌或者戈兰氏阳性细菌的细胞表面的融合蛋白、以及用于表面表达的微生物转化株。将利用上述载体转化的用于疫苗的大肠杆菌进行了单独的保藏(保藏号KCTC 10349 BP)。
此外，本发明还提供了用于疫苗的表面表达重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7(参见图5)，其包括pgs BCA基因、来源于杆状菌sp菌株并能表达HPV E7蛋白的poly-x-谷氨酸合成酶复合物基因、将pgs A的C-末端和HPV E7的N-末端连接到戈兰氏阴性细菌或者戈兰氏阳性细菌的细胞表面的融合蛋白、以及用于表面表达的微生物转化株。将利用上述载体转化的用于疫苗的大肠杆菌进行了单独的保藏(保藏号KCTC 10520 BP)。
附图简要说明本发明的上述以及其它目的、特征、优点将通过下述描述并结合附图进行详细描述。其中图1描述了重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1的基因图谱，其使用戈兰氏阳性细菌和戈兰氏阴性细菌用于表面表达。
图2A和图2B描述了在沙门氏菌株和乳酸菌株内与pgs A融合的HPV L1抗原的表达，其中所述菌株被表面表达重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1所转化。
图3A描述了小鼠血清中针对HPV L1抗原的IgG抗体的滴度，其中所述小鼠采用合适的剂量几次口服用本发明的重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化了的干酪乳杆菌，然后检测细胞表面表达的抗原决定簇。
图3B描述了针对小鼠肠、支气管、肺和阴道的洗出液中的HPV L1抗原的IgG抗体的滴度，其中所述小鼠采用合适的剂量几次口服用本发明的重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化了的干酪乳杆菌，然后检测细胞表面表达的抗原决定簇。
图4描述了由小鼠获得的脾细胞中细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性，其中所述小鼠采用合适的剂量几次口服用本发明的重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化了的干酪乳杆菌，然后检测细胞表面表达的抗原决定簇。
图5描述了重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7的基因图谱，所述重组载体用于在戈兰氏阳性细菌和戈兰氏阴性细菌宿主中进行表面表达。
图6描述了与乳杆菌菌株中的pgs A融合的HPV E7抗原的表达，所述表达通过对特定抗体的Western印迹法进行，其中所述菌株被用于表面表达的重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7所转化。
图7描述了从小鼠获得的肿瘤细胞的增殖速率，其中所述小鼠采用合适的剂量几次口服以本发明的重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化了的干酪乳杆菌，然后检测细胞表面表达的抗原决定簇。
图8描述了本发明间接实施例所述的克隆载体pGNBCA和用于表面表达的重组载体pGNBCA-HB168的基因图谱。
图9描述了采用本发明间接实施例所述的Western印迹和荧光激活细胞分拣法对乙型肝炎病毒的表面抗原蛋白的表面表达进行检测，其中所述表面抗原蛋白来自被重组载体pGNBCA-HB 168转化的戈兰氏阴性细菌。
图10描述了本发明间接实施例所述的克隆载体pGNCA和用于表面表达的重组载体pGNCA-HB 168的基因图谱。
图11描述了采用本发明间接实施例所述的Western印迹和荧光激活细胞分拣法对乙型肝炎病毒的表面抗原蛋白的表面表达进行检测，其中所述表面抗原蛋白来自被重组载体(pGNCA-HB168A2，pGNA-HB168A3和pGNHB-AA4)转化的戈兰氏阴性细菌。
具体实施例方式
下属实施例对本发明的实用、优选的实施方案进行了描述。
但是，对本领域技术人员来说，可在不偏离本发明的精神以及本申请公开内容所述范围的情况下，对本发明进行修饰以及改良。
特别地，在下述实施例中采用HPV 16型的L1抗原蛋白，但是任何类型的抗原蛋白基因，诸如L1，L2等来源于任何类型的HPV菌株的HPV衣壳蛋白基因都可单独或者结合使用。在下面的实施例里面，使用了与癌症诱导相关的一种主要的抗原蛋白基因-HPV 16型的E7基因，但是也可单独或者结合选择其它HPV菌株的其它癌症诱导抗原蛋白基因。
除下述实施例外，还从Bacillus subtilis var.chungkookjang(保藏号KCTC0697 BP)收集了参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因pgsBCA，但是本发明的载体可包括所有种类的来源于制备poly-x-谷氨酸的菌株的pgsBCA基因以及利用所述载体的微生物转化株等。更确切的说，与Bacillissubtilis chungkookjang的pgsBCA序列具有高于80％同源性的其它pgs BCA基因以及来源于其它微生物的菌株可用于构建疫苗用的载体，这也在本发明的保护范围之中。
如下述实施例以及间接实施例所述，可利用pgs BCA基因的全部或者部分来构建疫苗用的载体，这也在本发明的保护范围之中。
进一步地，在下述实施例中，对于上述载体，采用戈兰氏阴性细菌伤寒沙门菌、戈兰氏阳性细菌乳酸菌作为宿主细胞，但除这些细菌外，也可使用其它戈兰氏阳性或者戈兰氏阴性细菌，并可得到相同的结果，这对本领域技术人员是已知的。
在下述实施例中，仅公开了将微生物转化株本身应用于活体作为活疫苗，其中所述微生物被用于疫苗的载体所转化。但是，即使将由上述微生物转化株提取的粗产物或者纯化蛋白施用至活体，根据疫苗相关技术领域的一般性知识可以很自然地得到相同或类似的结果。
实施例1 用于表面表达的重组载体pHCE2LBpgsAHPV L1的构建使用来源于Bacillus sp.菌株并参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白。在细胞外膜基因pgsBCA中，采用基因pgsA来制备重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1，该载体能够使戈兰氏阴性细菌和戈兰氏阳性细菌的宿主细胞在细胞表而表达人乳突淋瘤病毒16型(下文称作“HPV”)的主要衣壳蛋白L1。
首先，将编码HPV L1的基因引入表面表达载体pGNA中，所述表达载体采用戈兰氏阴性细胞作为宿主细胞(来自韩国专利申请No.10-2001-48373的申请人)。更确切地说，采用在PUC19中克隆的约1.5kb的人乳突淋瘤病毒基因作为模板，以及采用具有SEQID.NO.4或者SEQ ID.NO.5所示核苷酸序列的编码HPV L1的寡聚核苷酸作为模板，进行聚合酶链反应。结果，扩增了1518bp大小的基因。
制备引物SEQ ID.NO.4和SEQID.NO.5使之包括限制性酶BamHI和Hind III的识别序列，其中所述限制性酶识别序列存在于表面表达所用的克隆载体pGNA中。上述扩增的HIPA L1抗原基因用限制性酶Bam HI和Hind III消化，并连接，调节翻译密码子与细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域，其中所述基因pgsA参与poly-x-谷氨酸的合成并来源于克隆载体pGNA，从而制备重组载体pGNA-HPVL1。
为了获得上述重组载体制备的含有HCE启动子的DNA片段、pgsA和HPVL1，将重组载体pGNA-HPV L1用限制性酶Nhe I和Sca I进行消化，将所得片段插入到戈兰氏阳性细菌的一般克隆载体pAT19的多克隆位点中的限制性酶Xba I和Sma I位点，从而构建重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1(参见图1)。
将本发明中用于表面表达的重组载体转化至大肠杆菌中，包括pHCE2LBpgsA-HPV L1的细菌株转化被保藏于韩国生命科学和生物技术研究院的基因库(KCTC，Taejon-si，Eusung-gu，Eoun-dong 52)中，保藏号为KCTC 10349 BP。
实施例2与pgsA融合的HPV L1的表面表达以上述用于表面表达的重组载体pHCE21LBpgsA-HPV L1转化戈兰氏阴性细菌伤寒沙门菌Ty21a，然后检测伤寒沙门菌Ty21a中与pgsA融合的HPVL1抗原的蛋白表达。然后，转化戈兰氏阳性细菌乳酸菌，在乳酸菌菌株中鉴别重组载体pHCE21LBpgsA-HPV L1的存在，然后检测与pgsA融合的HPVL1抗原的蛋白表达(参见图2)。利用针对HPV L1的特定抗体通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹来检测与参与poly-x-谷氨酸合成的pgsA基因的C-末端相连的HPV L1抗原的细菌表达。
具体地说，将以重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化的伤寒沙门菌Ty21a在500ml的培养瓶中进行培养，诱导表面表达，其中所述培养瓶内包括含有100mg/L抗生素的50ml的LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，盐5g/L，pH 7.0)。此外，用重组载体pHCE2LBpgsA-HPVL1转化干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)，在37℃静态环境于MRS培养基(Lactobacillus MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中进行培养，进行增殖并诱导表面表达。
随后，对伤寒沙门菌和Lactobacillus casei诱导表面表达，在同样细胞密度下获得蛋白，变性用作样品。然后利用SDS聚内烯酰胺凝胶电泳对蛋白进行分析，转移至PVDF薄膜上(聚偏氟乙烯薄膜Bio-Rad)。所得PVDF薄膜浸于封闭液(50mM Tris-HCL，5％脱脂奶，pH 8.0)，振摇1小时进行封闭，然后与单克隆第一抗体反应12小时，其中所述第一抗体为鼠源的HPV L1蛋白抗体，并用封闭液1000倍稀释。然后，将所得薄膜用缓冲液洗涤，与第二抗体共同孵育4小时，其中所述第二抗体为与生物素偶联的小鼠第二抗体，并用封闭液1000倍稀释。将反应薄膜用缓冲液洗涤，与将所得薄膜用缓冲液洗涤，与抗生物素蛋白一生物素试剂反应1小时，然后再次洗涤。通过加入H2O2和DAB，洗涤后的薄膜具有发色团，鉴别出在针对HPV L1的特异性抗体和上述融合蛋白之间具有特异性结合(参见图2)。
在图2A中，泳道1是未转化的宿主细胞伤寒沙门菌Ty21a，泳道2、3是以重组载体pHCE2LBpgsA-HPVL1转化的伤寒沙门菌Ty21a。在图2B中，泳道1是未转化的Lactobacillus casei，泳道2是以重组载体pHCE2LBpgsA-HPVL1转化的Lactobacillus casei。如图所示，在97.4Kda条带鉴别到由重组载体pHCE21LBpgsA-HPV L1表达的融合蛋白。由于pgsA约为41.8KDa，L1蛋白约为55.6Kda，因此说明具有约97.4Kda的条带为pgsA和L1蛋白的融合蛋白。
实施例3用细胞表面表达HPV L1抗原的乳酸菌诱导免疫反应将用于表面表达的重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化至戈兰氏阳性细菌Lactobacillus casei，如实施例2所述，在Lactobacillus casei细胞表面诱导抗原的表达，接下来在抗原性检测中检测到参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白pgsA以及与L1抗原融合的HPV16。
具体地说，将本发明的重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化至Lactobacillus casei进行表面表达，收集并调整每孔具有相同浓度，并用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤几次。然后，对4-6周龄的BALB/c小鼠以5×1010细菌的浓度通过口腔给予在细胞表面表达HPV16 L1抗原的乳酸菌以及未转化的乳酸菌，在第一周和第二周隔天给予三次，两周以后再注射，隔天给予三次。在标准组，对小鼠隔天施用两次由酵母表达的HPV16 L1病毒样颗粒(VLP)。
口服施用和静脉注射间隔2周后，处死小鼠，收集每组小鼠的血清，利用ELISA方法(酶联免疫吸附法)测量血清以及内脏、支气管、肺和阴道漂洗悬液中针对HPV16 L1抗原的IgG抗体滴度(参见图3a、3b)。在利用ELISA计算针对HPV16 L1抗原的IgG和IgA抗体滴度的方法中，利用酵母表达的HPV16 L1病毒样颗粒(VLP)作为抗原。更确切地说，为测定IgG抗体滴度，采用辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG，为测定IgG抗体滴度，采用辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgA。
在图3a中，()为未转化组，口服给予Lactobacillus casei；()为静脉注射HPV16(VLP)的L1病毒样颗粒组；()为口服给予经pHCE2LBpgsAHPV载体转化的Lactobacillus casei组。在图3b中， 为未转化组，口服给予Lactobacillus casei； 为静脉注射HPV16(VLP)的L1病毒样颗粒组； 为口服给予经pHCE2LBpgsAHPV载体转化的Lactobacillus casei组。
因而如图3a所示，由给予了经pHCE2LBpgsA-HPV L1载体转化的Lactobacillus casei的BALB/c小鼠组中获得的血清溶液及其稀释液证实了其比标准BALB/c小鼠组具有更高的针对人HPV L1抗原的IgG抗体滴度，与静脉注射HPV16 L1病毒样颗粒(VLP)组相比，其抗体滴度增加。
如图3b所示，由给予了经pHCE2LBpgsA-HPV L1载体转化的Lactobacillus casei的BALB/c小鼠组内脏、支气管、肺和阴道内部等的漂洗悬液以及稀释液证实了其比静脉注射HPV16 L1病毒样颗粒(VLP)的标准组具有更高的针对人HPV L1抗原的IgG抗体滴度。特别地，内脏器官悬液具有更显著的针对HPV L1抗原的IgA抗体滴度。
相应地，证实了本发明的微生物转化株能够产生针对HPV的IgG抗体，该抗体为整个机体的免疫诱导的标志；同时能够产生针对HPV的IgA抗体，该抗体为局部免疫，粘膜免疫诱导的标志。因此，可将微生物转化株用作活的疫苗。
实施例4用细胞表面表达HPV L1抗原的乳酸菌免疫后的试验动物中提取脾细胞进行细胞毒活性分析为了观察采用同样过程的免疫反应是否也诱导了细胞介导的免疫反应，用细胞表面表达HPV L1的乳酸菌免疫试验小鼠，分离小鼠脾细胞，检测细胞毒性淋巴细胞(CTL)的活性。
具体地说，取未免疫的Balb/c小鼠的脾细胞和10ug合成的HPV16 L1肽一起在37℃孵育3小时，然后以4000rad进行照射，以制备刺激细胞。
如实施例3所述，分离在细胞表面表达HPV L1抗原的乳酸菌免疫的Balb/c小鼠的脾细胞，与加载合成肽的刺激细胞相混合，并培养6天，制备效应细胞。此时，调整刺激细胞和效应细胞的细胞比率为2∶1，然后再刺激6天。检测前1大，在用作靶细胞的细胞中加入10ug的合成HPV16 L1肽进行孵育。在检测当天，向加载了肽的靶细胞中加入51CrO4，加入浓度为100uCi/106细胞，孵育2小时，然后进行洗涤。将制得的效应细胞等分至96孔板中，加入的5000细胞/孔的靶细胞的范围为1∶100-1∶25。混合靶细胞和效应细胞，在37℃孵育4小时。4小时后，收集上清，检测51CrO4的释放。最大释放是通过1％TritonX-100与靶细胞混合所得到的，白发释放通过培养基和靶细胞混合所得到，根据下式计算特异性裂解。
特异性裂解＝100*(实验cpm-自发cpm)/最大cpm-自发cpm细胞毒活性的转化结果如图4所示。
结果如图4所示，可以看出，与仅施用了未转化的乳酸菌的Balb/c小鼠的脾细胞相比，施用了以重组载体pHCE2LBpgsA-HPV L1转化的Lactobacilluscasei的Balb/c小鼠脾细胞的特异性细胞毒性的比率更高。
因此鉴别出，由本发明的表达HPV16 L1抗原的乳酸菌所诱导的免疫反应为细胞介导的免疫反应，其活化细胞毒性淋巴细胞作为口服疫苗的主要效应。
实施例5用于表面表达的重组载体pHCE2LBpgsBCAHPV E7的构建研究了来源于Bacillus sp.菌株并参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白。在细胞外膜基因中，利用pgs BCA基因来制备重组载体pHCE2LBpgsA-HPV-E7，该载体能够以戈兰氏阴性细菌和戈兰氏阳性细菌作为宿主细胞，在细胞表面表达与癌症诱导相关的主要抗原蛋白HPV 16的E7。
首先，将编码HPV16 E7的基因引入使用戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞的表面表达载体pGNBCA中(由韩国专利申请No.10-2001-48373的专利人处性得)。更确切地说，利用在pUC19中克隆的大约324bp的人乳突淋瘤病毒基因作为模板，以及利用含有SEQID.NO.6或者SEQ ID.NO.7序列的编码HPV16 E7的寡核苷酸作为模板，然后进行聚合酶链反应。结果扩增得到324bp大小的基因。
制备引物SEQID.NO.6和SEQ ID.NO.7，使之包含限制性酶Bam H1和Hind III的识别位点，其中所述限制性酶存在于用于表面表达的克隆载体pGNBCA中。利用限制性酶Bam H1和Hind III对上述扩增的HPV L1抗原基因进行消化，并连接，调节细胞外膜蛋白基因pgsA的C-末端区域的翻译密码子，其中所述pgsA基因参与poly-x-谷氨酸的合成并来源于克隆载体pGNBCA，从而制备重组载体pGNBCA-HPV E7。
为了获得含有HCE启动子的DNA片段、上述制备的重组载体pGNBCA-HPV E7的pgsBCA和HPV L1，将重组载体用限制性酶Nhe I和ScaI进行消化，将所得片段插入到戈兰氏阳性细菌的一般克隆载体pAT19的多克隆位点中的限制性酶Xba I和Sma I位点，从而构建重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7(参见图5)。
将本发明用于表面表达的重组载体转化至大肠杆菌中，包括pHCE2LBpgsA-HPV L1的细菌转化株被保藏于韩国生命科学和生物技术研究院的基因库(KCTC，Taejon-si，Eusung-gu，Eoun-dong 52)中，保藏号为KCTC 10520 BP。
实施例6与pgsA融合的HPV E7的表面表达以上述用于表面表达的重组载体pHCE21LBpgsA-HPV E7转化戈兰氏阴性细菌乳酸菌，然后鉴别乳酸菌中重组载体pHCE21LBpgsBCA-HPV E7是否存在，并检测与pgsA融合的HPV E7抗原的蛋白表达(参见图6)。
为了完成这一目的，采用与实施例2同样的步骤将表面表达载体转化至乳酸菌中并进行诱导。然后，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及针对pgsA(参见图6A)和HPV E7(参见图6B)的特异性抗体的Western印迹，来检测与参与了poly-x-谷氨酸合成的pgsA基因的C-末端相融合的HPV E7抗原蛋白的表达(参见图6)。在图6中，泳道1是未转化的Lactobacillus casei，泳道2、3是以重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7转化的Lactobacillus casei。
如图所示，由重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7鉴别到约60.8Kda的融合蛋白的条带。由于pgsA约为41.8KDa，HPV16 E7抗原蛋白通常约为19Kda，因此说明具有约60.8Kda的条带为pgsA和HPV16 E7抗原蛋白的融合蛋白。
实施例7以细胞表面表达HPV E7抗原的乳酸菌免疫后的试验动物施用肿瘤细胞的实验将用于表面表达的重组载体pHCE21LBpgsBCA-HPV E7转化至戈兰氏阳性细菌Lactobacillus casei中，按照与实施例2同样的方法在Lactobacilluscasei细胞表面诱导上述抗原的表达，然后通过用HPV16 E7抗原免疫来检测对肿瘤增殖的抑制作用，其中所述抗原与细胞外膜蛋白pgsA相融合，该蛋白参与poly-x-谷氨酸的合成。
具体地说，按照实施例3的方法对用表面表达的重组载体pHCE2LBpgsBCA-HPV E7转化的Lactobacillus casei和未转化的乳酸菌进行处理，对4-6周龄的BALB/c小鼠以5×1010细菌的浓度通过口腔给予转化株，在第一周和第二周隔天给予三次，两周以后再注射，隔天给予三次。
末次注射后，将表达HPV E7的肿瘤细胞系TC-1(1×104/50ul)通过皮下注射到待测小鼠的左侧。
表达HPV E7蛋白的肿瘤细胞系TC-1在C57/BL/6小鼠的原代肺细胞中被诱导，该细胞系被HPV16 E6和E7基因所免疫和转化，并采用现有技术来活化人c-Ha-ras基因[Lin etal.，Cancer Res.5621-26，1996]。
肿瘤刺激2周后，测定肿瘤的尺寸。每周隔天3次，计算并指出增大一倍的最长以及最短长度。用肿瘤刺激后肿瘤尺寸测量的数据如图7所示。
如图7所示，与采用了未转化的乳酸菌的C57/BL/6小鼠中获得的结果相比，在以载体pHCE2LBpgsBCA-E7转化的Lactobacillus casei的C57/BL/6小鼠中，肿瘤细胞的增殖被显著抑制。
因此，可以证实，由在细胞表面表达本发明的HPV16 E7抗原的乳酸菌诱导的免疫反应能够抑制肿瘤细胞的增殖。
间接实施例用于联合pgs B，pgs C和pgs A疫苗的重组载体的构建以及采用该系统在细胞表面表达外源蛋白的实验已经证实，构建的表面表达载体可包含任意一个或两个以上的pgs B、pgsC和pgs A基因用于编码poly-x-谷氨酸合成酶复合物，以及包含编码外源蛋白的基因，将表达载体转化到微生物中，从而所述基因表达至微生物表面。
相应地，还间接证实，能够制备包括编码poly-x-谷氨酸合成酶复合物的任意一个或两个以上的pgs B、pgs C和pgs A基因以及编码外源蛋白的基因的载体，用在疫苗上。
在间接实施例中，所述质粒pGNBCA和pGNCA分别与本发明的质粒载体pGNpgsBCA和pGNpgsCA相同。
间接实施例1重组载体pGNBCA-HB168的构建以及形成S抗原的中和抗体的抗原决定簇的表面表达利用来源于Bacillus sp.菌株的参与poly-x-谷氨酸合成酶的细胞外膜基因pgs BCA来构建重组载体pGNBCA-HB168，该重组载体以戈兰氏阴性细菌为宿主细胞，在细胞表面表达能产生乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇。
为了将乙型肝炎病毒S抗原引入到戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞的表面表达载体pGNBCA中，采用在一般克隆载体pUC8中克隆的大约1.4kb的乙型肝炎病毒基因作为模板，以包括SEQ ID NO.8和SEQID NO.9核苷酸序列的寡核苷酸作为引物。通过聚合酶链反应扩增S抗原的基因。此时，扩增得到的基因为168bp大小。
上述制得的引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9包含限制性酶Bam HI和Hind III的识别位点，这些位点也存在于表面表达载体pGNBCA上。利用限制性酶Bam HI和HindIII消化上述扩增的乙型肝炎病毒S抗原基因，连接至参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜基因的C末端，进行预先制备，并调节翻译密码子。结果，如上所述制备了重组载体pGNBCA-HB168(参见图8)。
采用表面表达所用的重组载体pGNBCA-HB168在大肠杆菌中表达抗原决定簇，该抗原决定簇能形成乙型肝炎病毒S抗原的中和抗体，并对表面表达进行检测。
将实施例2中构建的表面表达载体转化至大肠杆菌中，并以50ml含有100mg/L抗生素的LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，盐5g/L，pH7.0)进行培养，然后诱导表面表达。
在细菌中表达了与poly-x-谷氨酸合成酶基因的C末端融合的能形成S抗原中和抗体的抗原决定簇，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及针对S抗原特异性抗体的Western印迹来进行检测。具体地说，将在相同细胞浓度中得到的蛋白质进行灭活以制备样品，并利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，然后，将分离的蛋白转移至PVDF薄膜上。将完成蛋白转移的PVDF薄膜采用封闭液(50mM Tris-HCL，5％脱脂奶，pH8.0)进行振摇并封闭1小时。然后与多克隆第一抗体反应12小时，其中所述第一抗体为针对S抗原的来源于羊的的多克隆第一抗体，并用封闭液稀释1000倍。然后，将所得薄膜用缓冲液洗涤，与第二抗体共同孵育4小时，其中所述第二抗体是与生物素偶联的针对羊的第二抗体，并用封闭液稀释1000倍。将反应薄膜用缓冲液洗涤，与抗生物素蛋白一生物素试剂反应1小时，然后再次洗涤。向洗涤后的薄膜加入H2O2和DAB作为底物以及生色试剂，结果其显色，从而鉴别出在针对S抗原的特异性抗体和上述融合蛋白之间具有特异性结合(参见图A)。在图9中，泳道1为未转化的宿主细胞JM109，泳道2为转化株pGNBCA-HB168/JM 109。如图所示，通过质粒pGNBCA-HB168证实了融合蛋白的约48KDa的条带。
为了证实形成S抗原中和抗体的抗原决定簇的直接表达，将诱导的大肠杆菌利用外膜分离方法分别分成可溶性、内膜、以及外膜组分，然后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和针对S抗原的抗体进行的Western印迹来进行检测。具体地说，收集在细胞表面诱导表达融合蛋白的大肠杆菌转化株以及并未转化的大肠杆菌，将其调整到相同的细胞浓度，用缓冲溶液(10mM HEPES缓冲液，pH7.4)洗涤几次，重悬于包括10ug/ml裂解酶、1mM PMSF和1mM EDTA的缓冲溶液中，反应4-10分钟。随后，加入DNase(0.5mg/pl)口RNase(0.5mg/ml)，将细胞用超声破碎，于10,000×g离心4、20分钟分离大肠杆菌细胞碎片，收集包括大肠杆菌外周胞质和细胞质的部分。然后，将收集的沉淀用含有1％Sarcosyl(N-肌氨酸月桂酯，钠盐)的PBS缓冲液(pH7.4)进行重悬，在15,000×g离心4，2小时分离上清中的大肠杆菌内膜蛋白以及细胞沉淀中的外膜蛋白，从而获得各组分。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳以及针对S抗原的抗体的Western印迹法对各组分进行鉴别，证实在大肠杆菌各组分中，形成S抗原中和抗体的抗原决定簇的部分存在于外膜组分(参见图9A；大肠杆菌膜组分的Western印迹的结果)。在图9中，泳道1为未转化的JM109菌株；泳道2为转化株pGNBCA-HB168/JM 109的全细胞；泳道3为转化株pGNBCA-HB168/JM 109的可溶性组分；泳道4为转化株pGNBCA-HB168/JM 109的外膜组分；泳道5为转化株pGNBCA-HB168/JM 109的外膜组分。
已经通过荧光激活细胞分拣(FACS)流式法证实了形成S抗原中和抗体的抗原决定簇在大肠杆菌细胞表面表达。对于免疫荧光染色来说，收集被诱导的大肠杆菌，将细胞浓度调节至相同水平，以PBS缓冲液(pH7.4)洗涤几次，重悬于1ml含有1％小牛血清白蛋白的缓冲液中，与多克隆第一抗体反应4～12小时，其中所述第一抗体为针对S抗原的来源于羊的多克隆第一抗体，并1000倍稀释。将完成反应的细胞用缓冲液洗涤几次，重悬于1ml含有1％小牛血清白蛋白的缓冲液中，并与稀释的生物素偶联的第二抗体反应3～4小时。然后再次将完成反应的细胞用缓冲液洗涤几次，重悬于0.1ml含有1％小牛血清白蛋白的缓冲液中，与1000倍稀释的染色剂生物素特异性的链霉亲和素-R-藻红蛋白进行反应。
将反应的大肠杆菌洗涤几次，通过荧光激活细胞分拣流式法进行检测。结果发现，与未转化的大肠杆菌相比，形成S抗原中和抗体的抗原决定簇蛋白在细胞表面表达(参见图9B)。在图9B中，白色来源于未转化的JM109，黑色来源于转化株pGNBCA-HB168/JM109。如图9所示，在未转化的大肠杆菌中并未表达形成S抗原中和抗体的抗原决定簇，但是在以表面表达载体转化的大肠杆菌转化株中可清楚看出形成S抗原中和抗体的抗原决定簇的表达。
间接实施例2重组载体pGNCA-HB168的构建以及形成乙型肝炎S抗原中和抗体的抗原决定簇的表面表达利用来源于Bacillus sp.菌株的参与poly-x-谷氨酸合成酶的细胞外膜基因pgs BCA中的pgs C和pgs A来构建以戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞的用于表面表达的重组载体。
为了从参与poly-x-谷氨酸合成酶的细胞外膜蛋白中获得编码pgs C和pgsA的N末端和C末端的基因，以全染色体作为模板，以包括核苷酸序列SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11的寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链反应。
制备与N末端相应的引物，该引物包含存在于表达载体pHCE 19T(II)中的限制性酶Nde I的识别位点。此时，扩增区域从pgsC的N末端至pgsA的C末端区域具有约1.6kb的大小，其中pgsA是参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜基因。
将聚合酶链反应扩增得到的基因用限制性酶Nde I和Bam HI消化，并插入至已经用Nde I和Bam HI消化的组成性高表达载体pHCE19T(II)中。结果，制备了约5.3kb大小的新的载体，并命名为pGNCA，其中参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白基因不具有翻译终止密码子，并且加入了限制性酶的新的识别位点。
利用参与poly-x-谷氨酸合成的细胞外膜基因pgs BCA中的pgs C和pgs A，并如实施例2所述，以戈兰氏阴性细菌作为宿主细胞来构建重组载体pGNCA-HB168，该载体能在细胞表面表达形成乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇。，上述制备的重组载体pGNCA-HB168如图10所示。
利用重组载体pGNCA-HB168在大肠杆菌中制备形成乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇，并检测表面表达。
为了这一目的，将重组载体转化至大肠杆菌中，按照实施例3同样的方法诱导表达，然后，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及采用针对S抗原的抗体的Western印迹法来验证能与细胞外膜蛋白pgsCA融合的形成乙型肝炎病毒S抗原中和抗体的抗原决定簇的表达。
在图11中，泳道1为未转化的宿主细胞JM109；泳道2为转化的pGNCA-HB168/JM109。如图11所示，证实了来自质粒pGNCA-HB168的与蛋白融合的约48KDa的条带。
工业实用性本发明人开发出了一种利用poly-x-谷氨酸合成酶基因以及来源于Bacillussp.菌株的pgsBCA基因在微生物表面，尤其是在用作疫苗菌株的口服施用的乳酸菌的微生物表面、以及沙门氏菌的细胞表面有效表达人乳突淋瘤病毒的衣壳L1蛋白的方法。此外，该重组菌株可用作治疗以及预防用疫苗等。由于对于HPV来说，并不能大规模诱导性制备抗体，因此，本发明的表达HPV抗原的重组菌株在大规模且非常经济地增殖后，可作为经济实用的疫苗，例如，可作为口服疫苗或者对阴道损伤直接有效的疫苗。
本领域技术人员可以看出，可以前述说明书中公开的概念以及特定实施方式为基础来修饰或者设计可完成本发明目的的其它实施方案。
本领域技术人员可以明白，这种等价的实施方案并未偏离所附权利要求所阐明的本发明的精神和范围。
序列表SEQUENCE LISTING<110>生物领先公司韩国生命工学研究院<120>抗HPV疫苗的载体以及该载体转化的微生物<130>PCF050560C<140>PCT/KR2003/002163<141>2003-10-17<150>10-2002-0063378<151>2002-1017<160>11<170>PatentIn version 32<210>1<211>1182<212>DNA<213>Bacillus subtilis<400>1atgggctggt tactcattat agcctgtgct gtcatactgg tcatcggaat attagaaaaa 60cgacgacatc agaaaaacat tgatgccctc cctgttcggg tgaatattaa cggcatccgc 120ggaaaatcga ctgtgacaag gctgacaacc ggaatattaa tagaagccgg ttacaagact 180gttggaaaaa caacaggaac agatgcaaga atgatttact gggacacacc ggaggaaaag 240ccgattaaac ggaaacctca ggggccgaat atcggagagc aaaaagaagt catgagagaa 300acagtagaaa gaggggctaa cgcgattgtc agtgaatgca tggctgttaa cccagattat 360caaatcatct ttcaggaaga acttctgcag gccaatatcg gcgtcattgt gaatgtttta 420gaagaccata tggatgtcat ggggccgacg cttgatgaaa ttgcagaagc gtttaccgct 480acaattcctt ataatggcca tcttgtcatt acagatagtg aatataccga gttctttaaa 540caaaaagcaa aagaacgaaa cacaaaagtc atcattgctg ataactcaaa aattacagat 600gagtatttac gtaattttga atacatggta ttccctgata acgcttctct ggcgctgggt 660gtggctcaag cactcggcat tgacgaagaa acagcattta agggaatgct gaatgcgccg 720ccagatccgg gagcaatgag aattcttccg ctgatcagtc cgagcgagcc tgggcacttt 780gttaatgggt ttgccgcaaa cgacgcttct tctactttga atatatggaa acgtgtaaaa 840gaaatcggtt acccgaccga tgatccgatc atcatcatga actgccgcgc agaccgtgtc 900gatcggacac agcaattcgc aaatgacgta ttgccttata ttgaagcaag tgaactgatc 960ttaatcggtg aaacaacaga accgatcgta aaagcctatg aagaaggcaa aattcctgca1020gacaaactgc atgacctaga gtataagtca acagatgaaa ttatggaatt gttaaagaaa1080agaatgcaca accgtgtcat atatggcgtc ggcaatattc atggtgccgc agagccttta1140attgaaaaaa tccacgaata caaggtaaag cagctcgtaa gc 1182<210>2<211>447<212>DNA<213>Bacillus stbtilis<400>2atgttcggat cagatttata catcgcacta attttaggtg tactactcag tttaattttt 60gcggaaaaaa cagggatcgt gccggcagga cttgttgtac cgggatattt aggacttgtg 120
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权利要求
1.用于制备疫苗的载体，其包括编码poly-x-谷氨酸合成酶复合物的一种或两种以上选自pgs B，pgs C和pgs A的基因，以及人乳突淋瘤病毒抗原蛋白基因。
2.权利要求1的用于制备疫苗的载体，其中所述的抗原蛋白基因选自人乳突淋瘤病毒衣壳HPV L1和HPV L2基因中的一种或两种以上。
3.权利要求1的用于制备疫苗的载体，其中所述抗原蛋白基因选自与肿瘤诱导相关的HPV E6和HPV E7抗原蛋白基因中的一种或两种以上。
4.权利要求1的用于制备疫苗的载体，其中包括编码所述poly-x-谷氨酸合成酶复合物的pgsA基因。
5.一种戈兰氏阴性微生物，其被权利要求1的用于制备疫苗的载体所转化。
6.权利要求5的微生物，其中所述微生物选自大肠杆菌、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门氏菌、牛分枝杆菌、以及志贺氏痢疾杆菌。
7.一种戈兰氏阳性微生物，其被权利要求1的用于制备疫苗的载体所转化。
8.权利要求7的微生物，其中所述微生物选自杆状菌、乳酸菌、乳球菌、葡萄球菌、单核细胞增生利斯特菌以及链球菌。
9.用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其包含在细胞表面表达抗原蛋白的权利要求5和7所述的微生物、从所述微生物上提取的粗抗原蛋白提取物、或者从所述微生物上纯化的抗原蛋白作为有效成分。
10.权利要求9的用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其可口服施用或可食用。
11.权利要求9的用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其可通过皮下或腹腔注射。
12.权利要求9的用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其可向鼻腔喷雾。
13.权利要求1的用于制备疫苗的载体，其具有图1所示的基因图谱并且被命名为pHCE2LBpgsA-HPV L1。
14.权利要求1的用于制备疫苗的载体，其具有图5所示的基因图谱并且被命名为pHCE2LBpgsBCA-HPV E7。
15.一种微生物，其被权利要求13或14所述的用于制备疫苗的载体所转化。
16.权利要求15的微生物，其使用乳酸菌或者沙门氏菌作为宿主细胞。
17.一种用权利要求13的载体转化的大肠杆菌转化株(保藏号KCTC10349 BP)。
18.一种用权利要求13的载体转化的大肠杆菌转化株(保藏号KCTC10520 BP)。
19.一种用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其包含在细胞表面表达抗原蛋白的权利要求16所述的微生物、从所述微生物中提取的粗抗原蛋白提取物、或者从所述微生物中纯化的抗原蛋白作为有效成分。
20.权利要求19的用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其可口服施用或可食用。
21.权利要求19的用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其可通过皮下或腹腔注射。
22.权利要求19的用于治疗或预防粘膜肿瘤的疫苗，其可向鼻腔喷雾。
23.一种生殖器用洗液，其包括能在细胞表面表达抗原蛋白的权利要求16所述的微生物、从所述微生物中提取的粗抗原蛋白提取物、或者从所述微生物中纯化的抗原蛋白作为有效成分。
全文摘要
本发明涉及在微生物表面能够有效生成病毒颗粒衣壳蛋白以及人乳突淋瘤病毒肿瘤相关蛋白的表达载体，以及能够载荷该表面展示载体的菌株和所述菌株或其提取物、纯化产物作为复合疫苗的应用。更特异地，本发明涉及的表面展示载体包括一种或两种以上的选自pgsB，pgsC，pgsA的基因，来编码Bacillus sp.菌株的poly－x－谷氨酸合成酶复合物(pgsBCA)，以及编码病毒颗粒衣壳蛋白、人乳突淋瘤病毒的肿瘤相关蛋白基因，本发明还涉及上述物质的制备方法。
文档编号A61K31/00GK1705747SQ200380101373
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月17日 优先权日2002年10月17日
发明者成文喜, 夫夏玲, 李宗洙, 郑昌敏, 洪承杓, 金哲仲, 朴顺姬, 表贤美 申请人:生物领先公司, 韩国生命工学研究院