专利名称：土贝母皂苷丙在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及土贝母皂苷丙的用途，特别是土贝母皂苷丙在制药领域中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是一种严重危害身体健康的疾病，自20世纪70年代以后，恶性肿瘤的发病人数以每年3％-5％的速度递增。目前常规的治疗方法有外科手术治疗、放射治疗、化学药物治疗和生物调节治疗等，其中化学药物在恶性肿瘤的临床治疗应用中占据主导地位，但其强烈的毒副作用也一直困扰着广大的医务人员。常规的癌症化学治疗是自上个世纪50年代开始的，由于大多数药物都是针对细胞分裂过程中DNA合成的，因此，这些治疗方法必然伤及正常细胞和组织器官，尤其是骨髓，患者为此付出的代价极高。
中医药特别是中药复方长期以来在治疗某些恶性肿瘤疾病上起到了一些独特的作用，但由于技术手段上的相对落后，使我们目前无法阐明中药治病的基本原理，这已成为广泛推广应用复方中药的一个巨大障碍。因此，从天然植物或中药中寻找能够说明作用机理的单体活性成分，已成为当今的热门研究领域，并取得了一定的成绩。例如从红豆杉树皮中分离出抗癌活性成分紫杉醇，从喜树果实中分离出的抗癌活性成分喜树碱和10-羟基喜树碱等衍生物，从中药斑蝥中分离出抗肝癌活性成分斑蝥素等。这些成功的例子都为我们寻找更多更新的化合物用于治疗癌症展示了广阔的美好前景。
目前，以齐墩果酸为先导化合物进行结构改造来研制新的活性化合物已成为继紫杉醇结构修饰研究之后的又一热门研究课题。令人感兴趣的是，齐墩果酸在不同部位连上不同的基团，就会产生不同的生物活性，特别是与糖基相连形成皂苷后更加显示出其独特的活性。土贝母皂苷正是齐墩果酸同系物皂苷。
从土贝母中已经分离出的土贝母皂苷甲在中国专利94104124.7，95113751.4中被证明可以治疗阴道炎、宫颈炎、宫颈糜烂、宫颈息肉、直肠炎、直肠癌等，而且还能杀伤白血病细胞并对白血病细胞有诱导分化作用；另一种同系物是土贝母皂苷乙，在中国专利99106201.9中公开了其在预防和治疗各种恶性肿瘤药物中的应用。
土贝母皂苷丙是从中草药土贝母Bolbostemma paniculatum[Maxim]Franquet鳞茎中分离出来的一种单体有效成分，分子式为C64H100O31，分子量为1364，结构式为 其结构为大环三萜皂苷，由齐墩果酸为母核的贝萼皂苷元(bayogenin)和组成糖链的四种糖—葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖，以及3-甲基-3-羟基戊二酸组成。该皂苷易溶于水和极性溶剂，稳定性好，适合于制作任何现代制剂如片剂、胶囊剂、栓剂、各种搽剂软膏、注射剂等，但至今未见土贝母皂苷丙在制备用于治疗恶性肿瘤药物中应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供土贝母皂苷丙在制药中的新用途，具体地说是提供土贝母皂苷丙在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用，以制备能有效治疗恶性肿瘤的药物。
土贝母皂苷丙可从土贝母鳞茎中用如下方法提取将干燥的土贝母鳞茎粉碎后，过2mm孔径筛网，用20倍药材重量的95％乙醇分3～4次冷浸，减压回收乙醇，将提取液浓缩至无醇味。分别用三分之一倍量的氯仿和正己烷萃取脱脂，水层冻干，收率为16％。
冻干粉用水溶解后上DIAION HP20(日本NIPPON RENSUI公司)离子交换树脂分离组分，分别用30％、70％和100％乙醇洗脱，得到3部分，收率分别为6.5％、11.1％和2.2％。
将70％乙醇洗脱部分上硅胶柱，用氯仿-甲醇-水(7∶3∶1)混合液洗脱，得到土贝母皂苷甲和其他两部分，其中一部分上C18反相硅胶柱，用75％甲醇溶液洗脱即得到土贝母皂苷乙和另一部分；将其上制备型HPLC分离，流动相为70％甲醇水溶液，流速6ml/min，检测波长210nm，即可得到土贝母皂苷丙。
将其用于治疗恶性肿瘤，即口服土贝母皂苷丙以治疗恶性肿瘤，其剂量为5-15mg土贝母皂苷丙/日，每日分两次口服，土贝母皂苷丙可以制成胶囊、片剂、栓剂或颗粒剂等药剂学上所说的各种口服剂型和各种搽剂软膏、注射剂等。
实验证明，从土贝母中分离纯化出的土贝母皂苷丙具有更高活性的抗癌作用，并具备广谱抗肿瘤效果，对膀胱癌、胃癌、急性髓性白血病、红白血病、肝癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌细胞均有杀伤作用，毒副作用低，且活性比土贝母皂苷甲强。机理研究证明其主要是通过诱导细胞凋亡和影响细胞脂代谢导致坏死而对癌细胞产生作用。
为了更好地理解本发明的实质，以下用土贝母皂苷丙的药效试验、急性毒性试验和作用机理研究结果来说明其在治疗恶性肿瘤中的功效作用。
1.药效试验1.1 MTT法检测土贝母皂苷甲和土贝母皂苷丙药物对8种肿瘤细胞的生长抑制效应1.1.1细胞株HL-60(急性髓性白血病)，K562(红白血病)，HePG2(肝癌)，SKOV3(卵巢癌)，SW480(直肠癌)，A549(肺癌)，T24(膀胱癌)BGC(胃癌)3T3(小鼠成纤维细胞，转化细胞)，ECV304(人脐静脉内皮细胞)。由重庆医科大学病理生理教研室提供。细胞培养在10％小牛血清RPMI1640(美国GIBCO)培养液中(内含0.1％青链霉素)，并置37℃，5％CO2培养箱备用。
1.1.2药物用生理盐水分别配制土贝母皂苷甲和土贝母皂苷丙溶液，使药物最终浓度均为5.6、11.2、22.5、45、90μg/ml五种浓度。
1.1.3试验方法分别收集对数生长期8株细胞，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔培养板中，每孔加200μL(1×104个细胞/孔)。实验分为试剂对照组，细胞对照组，土贝母皂苷甲和土贝母皂苷丙药物5种不同浓度的实验组，每孔加药物溶液20μL，每组设8个平行孔，培养3天后，吸去上清液，加1640培养液200μL/孔及浓度为5mg/ml的MTT溶液20μL/孔，继续培养4h，吸去上清夜，加二甲亚砜200μL/孔，震荡溶解后，在自动酶标仪(Bio-Rad-550型)上测定每孔的吸光值，测定波长570nm。实验重复3次，取平均值计算药物对8株细胞作用的中效浓度(即IC50)及相关系数。结果见表1、2、3。
表1土贝母皂苷甲抑制8株肿瘤细胞系结果土贝母皂苷甲抑制率(X±std，n＝3)细胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/mlHL-60 0.15±0.007 0.308±0.0220.720±0.0730.837±0.0050.908±0.010＜0.001K562 0.360±0.0390.574±0.0280.770±0.0160.871±0.0370.930±0.022＜0.001HePG2 0.382±0.0380.632±0.0300.822±0.0350.870±0.0120.906±0.012＜0.001SKOV3 0.156±0.0160.419±0.0660.648±0.0190.807±0.0040.894±0.014＜0.001SW480 0.347±0.0330.628±0.0180.786±0.0250.865±0.0330.928±0.021＜0.001A549 0.325±0.0180.609±0.0140.805±0.0100.865±0.0170.923±0.017＜0.001T24 0.306±0.0240.544±0.0310.757±0.0200.837±0.0220.918±0.006＜0.001BGC 0.219±0.0310.630±0.0280.784±0.0310.859±0.0390.927±0.024＜0.001表2土贝母皂苷丙抑制8株肿瘤细胞系结果土贝母皂苷丙抑制率(X±std，n＝3)细胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/mlHL-600.243±0.0310.458±0.0350.786±0.0240.874±0.0230.924±0.013＜0.001K5620.454±0.0280.616±0.0290.829±0.0340.878±0.0240.927±0.026＜0.001HePG20.414±0.0130.632±0.0300.827±0.0240.875±0.0230.927±0.014＜0.001SKOV30.263±0.0230.549±0.0210.756±0.0250.823±0.0160.954±0.007＜0.001SW4800.365±0.0260.742±0.0300.858±0.0340.907±0.0170.951±0.013＜0.001A5490.336±0.0180.628±0.0190.818±0.0060.893±0.0140.934±0.007＜0.001T24 0.344±0.0120.630±0.0170.792±0.0090.878±0.0190.938±0.011＜0.001BGC 0.297±0.0190.665±0.0290.828±0.0330.871±0.0110.941±0.017＜0.001
表3土贝母皂苷甲、丙抑制8株肿瘤细胞系中效浓度结果中效浓度(IC50，μg/ml)细胞系土贝母皂苷甲 土贝母皂苷丙HL-60 15.95 11.66K5628.10 6.27HePG27.00 5.95SKOV316.85 11.16SW480 8.18 6.33A5498.53 8.06T24 9.02 7.56BGC10.48 8.321.2土贝母皂苷甲、丙抑制荷瘤小鼠肿瘤试验1.2.1对接种S180瘤株的昆明小鼠的抑制试验受试药物分别称取土贝母皂苷甲、乙一定量，加生理盐水溶解即可。
给药途径腹腔注射(ip)或尾静脉注射(iv)。
实验动物昆明小鼠、SPF级动物(合格证号为医动字第310101001)。
瘤株腹水瘤细胞株(S180)，来自重庆医科大学病理生理教研室。
实验环境实验在一级标准动物实验室进行，设施合格证书20000330号。
实验方法昆明小鼠50只、体重18～22g、雌雄兼用。取接种7～8天之腹水瘤按1∶10稀释计数、使终浓度为瘤细胞1000万个/ml；每只鼠右腋皮下接种0.2ml(含200百万个瘤细胞)。次日随机均分3组药物组(剂量3mg/kg)、空白对照组及环磷酰胺(Cy，剂量50mg/kg)阳性对照组。药物组每天给药一次，连续给药7天；空白对照组则给予相应体积NS液；阳性对照组(Cy组)间日给药一次。末次给药后停药一天。脱颈处死动物，称体重及剖瘤称重。计算各组瘤重，按下列公式求出肿瘤抑制率，并进行t检验。
表4土贝母皂苷甲、丙对荷S180肿瘤小鼠的抑制作用剂量给药途径 药前/药后 药前/药后 瘤 重抑制率组别P值(mg/kg) ×次数动物数 体重 (x±sd)(％)对照组 17/1719.4/28.4 1.57±0.34苷甲8 ip×6 10/1019.5/22.5 1.03±0.3534 ＜0.01苷丙6 ip×6 10/1019.5/20.8 0.70±0.2355 ＜0.01Cy50 sc×3 10/1019.5/27.7 0.67±0.2557 ＜0.001
由表4可见，土贝母皂苷甲、丙对荷S180肿瘤小鼠有明显抑制作用(p＜0.01)，而皂苷丙的作用明显高于皂苷甲。
1.2.2对接种肝癌细胞株(H22)的昆明小鼠的抑制试验实验方法同上。瘤株肝癌细胞株(H22)，来自重庆医科大学病理生理教研室。
表5土贝母皂苷甲、丙对荷H22肿瘤小鼠的抑制作用剂 量 给药途径 药前/药后 药前/药后 瘤 重 抑制率组 别P值(mg/kg) ×次数动物数 体重(x±sd) (％)对照组 17/17 23.3/32.12.62±0.71苷甲 12 ip×5 10/10 23.3/27.81.77±0.3632.4＜0.01苷丙 8 ip×5 10/10 23.3/25.61.39±0.5746.9＜0.001Cy 50 sc×3 10/10 23.3/27.41.12±0.4657.0＜0.001由表5可见，土贝母皂苷甲、丙对荷H22肿瘤小鼠有明显抑制作用(p＜0.001)。而皂苷丙的作用明显高于皂苷甲。
2.急性毒性试验2.1小鼠静脉注射毒性试验实验动物小鼠为昆明种，一级动物(合格证号为医动字第310101001)，体重18～22g。雌雄各半，由重庆市中药研究院实验动物研究室提供。小鼠领取后于实验室观察3天，供给充足饲料，自由饮水，确定实验动物健康无病后方供实验用。
实验环境实验在一级标准动物实验室进行，设施合格证号为24303013。
数据处理LD50测定用半数效量概率单位法(加权直线回归法)计算，所用PEMS统计软件由华西医科大学研制。
给药途径静脉注射。
实验方法根据预试结果，初步确定土贝母皂苷丙静脉注射的全死剂量为24mg/kg，全不死剂量为14.0/kg，即以24mg/kg为最大剂量，按0.85的等比依次递减进行试验，测定小鼠LD50值。
取昆明种小鼠40只，雌雄各半，分4组，每组10只，禁食不禁水12小时，按剂量(24.00、20.40、17.34、14.7mg/kg)分别给动物一次性静脉注射，记录动物毒性反应及死亡情况，连续观察7天，并计算LD50。
表6土贝母皂苷丙对正常小鼠静脉注射急性毒性结果计量 动物数 死亡数存活数(mg/kg) (只)(只) (只)24.00 10 10 020.40 10 6 417.34 10 1 914.70 10 010实验结果24mg/kg组，小鼠全部死亡(给药后10分钟死亡9只)，死前动物双腿后弹，心跳加快呼吸加深、随后扑腹而亡。尸检见有1只动物鼻孔出血、眼球突出、余未见明显肉眼见病变；20.40mg/kg组动物药后72小时内有6只动物死亡，尾部见紫黑色炎性坏死，成活4只动物均未见尾根部断掉成庄尾。见表6。
本次实验结果LD50为19.79mg/kgLD50的95％可信区间为18.55～21.20mg/kg。
2.2小鼠腹腔注射毒性试验试验所有条件与上述相同。给药途径腹腔注射。根据预示结果按0.8等比级数设计给药计量。见表7。
表7.土贝母皂苷丙对正常小鼠腹腔注射急性毒性结果计量动物数 死亡数 存活数(mg/kg) (只) (只) (只)24.00 10 10019.20 109115.36 107312.29 10469.83 1028本次实验结果LD50为13.34mg/kg。LD50的95％可信区间为10.96～15.30mg/kg。
2.3对正常细胞的毒性试验试验方法同1.1.3项。结果表明，土贝母皂苷甲、丙对正常细胞均有一定的细胞毒作用。见表8、9、10。
表8土贝母皂苷甲对正常细胞的毒性试验土贝母皂苷甲抑制率(X±std，n＝3)细胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/ml3T3 0.233±0.0230.567±0.0200.787±0.0170.862±0.0140.914±0.011＜0.001ECV3040.161±0.0180.326±0.0180.574±0.0240.814±0.0130.899±0.008＜0.001表9.土贝母皂苷丙对正常细胞的毒性试验土贝母皂苷丙抑制率(X±std，n＝3)细胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/ml3T30.335±0.0190.654±0.0130.801±0.0040.874±0.0160.936±0.009＜0.001ECV304 0.321±0.0110.634±0.0260.775±0.0080.833±0.0120.918±0.008＜0.001表10.土贝母皂苷甲、丙抑制正常细胞系中效浓度结果中效浓度(IC50，μg/ml)细胞系土贝母皂苷甲 土贝母皂苷丙3T310.81 9.37ECV304 17.98 8.693.作用机理研究3.1流式细胞仪检测药物对细胞周期的变化及细胞凋亡率影响收集SW480细胞株对数生长期细胞，将1×106个细胞接种于200ml培养瓶中，实验分为对照组，实验组(分别使用土贝母皂苷甲和土贝母皂苷丙药物1/2中效浓度)，培养3天，胰酶消化，分别收集对照组及实验组细胞，PBS洗2次，检测细胞周期用预冷的70％乙醇固定，检测细胞凋亡用10％甲醛固定，进行流式细胞仪检测。
结果表明，SW480细胞株在用药后，其细胞周期主要表现G1期细胞数量明显增加，S期细胞减少。使用ANNEXIN V-FITC试剂盒检测细胞凋亡，对于土贝母皂苷甲和土贝母皂苷丙处理后细胞均检测到凋亡细胞和坏死细胞。结果见表11。
结论土贝母皂苷丙作用于肿瘤细胞可以引起细胞凋亡，从而起到杀死肿瘤细胞的作用。
表11.土贝母皂苷甲、丙对SW480细胞周期及凋亡率影响序号 G1 S G2凋亡率(％)对照组36.761.02.3皂苷甲32.666.31.1 9.9皂苷丙46.447.56.2 14.33.2电镜观察药物对细胞形态的影响细胞样品的准备同3.1项，收集对照组及实验组细胞，PBS洗2次，细胞用戊二醛固定，按常规方法切片后制备样品于电镜下检测。
电镜下观察结果显示，药物作用后的细胞呈现三种类型1)凋亡细胞，其形态出现细胞核碎裂，胞浆电子密度加深等现象；2)坏死细胞；3)变性细胞，其形态出现空泡，胞浆中存在脂滴。
结论从用药后细胞形态的改变来看，土贝母皂苷丙可以导致肿瘤细胞脂肪代谢的紊乱，在细胞中形成脂滴，最终导致细胞坏死，同样起到杀死肿瘤细胞的作用。
具体实施例方式
实施方式一制备土贝母皂苷丙注射剂称取0.25g土贝母皂苷丙溶于400ml的无水乙醇中，加注射用水至1000ml，用3号垂熔漏斗或其他滤器滤材过滤至澄明，灌封，100℃灭菌30分钟即得注射用针剂。本品为无色澄明液体。pH值为5.5～7.0。
实施方式二制备土贝母皂苷丙片剂按下列配比准备原料土贝母皂苷丙 10克羟丙甲纤维素(Methocel E50)200克羟丙甲纤维素(Methocel K4M) 75克羟丙纤维素 25克无水乳糖 65克硬脂酸 6克硬脂酸镁 6克微粉硅胶 3克将两种规格的羟丙甲纤维素和羟丙纤维素在相对湿度小于40％的环境中至少贮存24小时，两种不同粘度的羟丙甲纤维素混合约1.5小时，加羟丙纤维素后混合15分钟，放置。加土贝母皂苷丙和乳糖混合，再加硬脂酸、硬脂酸镁和微粉硅胶混匀，直接压片，每片含药物10mg。
权利要求
1.土贝母皂苷丙在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及土贝母皂苷丙的用途，特别是土贝母皂苷丙在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。药效及急性毒性试验证明，从土贝母中分离纯化出的土贝母皂苷丙具有更高活性的抗癌作用，并具备广谱抗肿瘤效果，对膀胱癌、胃癌、急性髓性白血病、红白血病、肝癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌细胞均有杀伤作用，毒副作用低，且活性比土贝母皂苷甲强。机理研究证明其主要是通过诱导细胞凋亡和影响细胞脂代谢导致坏死而对癌细胞产生作用。
文档编号A61K31/7028GK1559419SQ20041002184
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月15日 优先权日2004年2月15日
发明者于超, 邱宗荫, 李惠芝, 何俊琳, 汤为学, 于 超 申请人:于超, 邱宗荫, 于 超