专利名称：一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种利用高速逆流色谱法从土贝母中制备高纯度贝萼皂苷元的方法。
背景技术：
土贝母系葫芦科植物土贝母 Bolbostemma pan i cu latum (Maxim. )Franquet 的干燥块茎，始载于清代《本草纲目拾遗》，具有散结、消肿、解毒之功效。皂苷类为土贝母的主要活性成分，含量较大。贝萼皂苷元(Bayogenin)是一种齐墩果酸五环三萜类化合物，分子式C30H4805，分子量为488. 7。中国专利申请号200410101074. O以贝萼皂苷元为活性成分，单独与药用辅料或与其它药物联合制备成抗肿瘤药物。有文献研究表明贝萼皂苷元具有中等强度的糖原磷酸化酶抑制活性以及抗肿瘤等作用，可作为糖原磷酸化酶抑制剂。目前贝萼皂苷元的提取分离方法主要采用乙醇回流提取、大孔树脂或硅胶柱层析、酸水解、碱调 PH，溶剂萃取、重结晶等步骤获得贝萼皂苷元，这些方法生产周期长、样品损失较大，所用有机溶剂毒性较大，不适用于大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效分离土贝母中贝萼皂苷元的方法，即采用高速逆流色谱法从土贝母中分离制备贝萼皂苷元的方法。该分离方法分离效率高、分离时间短，能得到高纯度的贝萼皂苷元。本发明提供一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，包括以下步骤a.取干燥土贝母鳞茎，粉碎，用石油醚脱脂后，以乙醇、甲醇、丙酮和水的混合溶剂超声提取2-4次，提取液浓缩至相对密度I. 11-1. 18，得总皂苷；b.将总皂苷溶于水并以此加入酸液和乙酸乙酯后加热进行酸水解，待水解完成后趁热分取乙酸乙酯层并浓缩，得乙酸乙酯浸膏；c.在分液漏斗中配制两相溶剂系统，充分振摇后在室温下静置过夜，分取漏斗中的上相和下相，超声脱气，取步骤b中的乙酸乙酯浸膏用下相溶解，作为样品溶液备用；将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后，调整主机转速，泵入下相，待下相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在210nm波长下检测，根据色谱图收集得到单体化合物贝萼皂苷元。步骤a中所述提取混合溶剂与药材质量比为8-20 I。步骤b中所述酸水解中所用酸为l-4mol/L盐酸或硫酸，温度为65_85°C。步骤c中所述溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，体积比为(10-12) (4-6) (5-10) (1-5)。步骤c中所述高速逆流色谱仪的主机转速为850-1000r/min,流动相流速为
2.0-4. Oml/min。本发明的优势在于
(I)酸水解时加入乙酸乙酯，使水解后产生的目标产物贝萼皂苷元及时进入乙酸乙酯层，既避免了长时间与酸接触可能产生的化学变化，又使水解、萃取操作同时完成，简化了工艺。(2)本发明采用合理的溶剂系统，控制高速逆流色谱仪的主机转速及流动相流速等条件，可得到纯度较高的贝萼皂苷元，该分离条件容易控制、分离时间短。
具体实施例方式实施例I :取土贝母干燥鳞茎2kg，用石油醚脱脂后，用40%乙醇超声提取3次，每次2小时，合并提取液，提取液浓缩至相对密度I. 15，得总皂苷，将总皂苷溶于IL水中，加入盐酸使溶液中盐酸浓度达到2mol/L，然后加入乙酸乙酯2L，70°C回流5小时，冷却至乙酸乙酯不再沸腾，趁热分取乙酸乙酯层，减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比11 : 4 : 8 : 3混合，置于分液漏斗中，充分振摇后在室温下静置过夜，分取漏斗中的上·相(作为固定相)和下相(作为流动相)，超声脱气，将乙酸乙酯浸膏用下乡溶解，作为样品溶液备用。将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后，调整主机转速960r/min,再以2. Oml/min流速泵入下相,待下相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在210nm波长下检测，根据色谱图收集流分，回收试剂，干燥得到单体化合物贝萼皂苷元737mg，高效液相检测，含量为95. 7%。实施例2:取土贝母干燥鳞茎2kg，用石油醚脱脂后，用50%丙酮超声提取2次，每次3小时，合并提取液，提取液浓缩至相对密度I. 11，得总皂苷，将总皂苷溶于I. IL水中，加入硫酸使溶液中硫酸浓度达到3mol/L，然后加入乙酸乙酯2L，75°C回流4小时，冷却至乙酸乙酯不再沸腾，趁热分取乙酸乙酯层，减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比12 6 10 5混合，置于分液漏斗中，充分振摇后在室温下静置过夜，分取漏斗中的上相(作为固定相)和下相(作为流动相)，超声脱气，将乙酸乙酯浸膏用下乡溶解，作为样品溶液备用。将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后，调整主机转速850r/min，再以3. Oml/min流速泵入下相，待下相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在210nm波长下检测，根据色谱图收集流分，回收试剂，干燥得到单体化合物贝萼皂苷元724mg，高效液相检测，含量为96. 3%。实施例3:取土贝母干燥鳞茎2. 5kg，用石油醚脱脂后，用45%甲醇超声提取2次，每次I小时，合并提取液，提取液浓缩至相对密度I. 18，得总皂苷，将总皂苷溶于I. 4L水中，加入硫酸使溶液中硫酸浓度达到lmol/L，然后加入乙酸乙酯2. 5L，85°C回流6小时，冷却至乙酸乙酯不再沸腾，趁热分取乙酸乙酯层，减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比10 6 7 I混合，置于分液漏斗中，充分振摇后在室温下静置过夜，分取漏斗中的上相(作为固定相)和下相(作为流动相)，超声脱气，将乙酸乙酯浸膏用下乡溶解，作为样品溶液备用。将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后，调整主机转速1000r/min，再以4. Oml/min流速泵入下相，待下相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在210nm波长下检测，根据色谱图收集流分，回收试剂，干燥得到单体化合物贝萼皂苷元866mg，高效液相检测，含量为95. 4%。实施例4:取土贝母干燥鳞茎5kg，用石油醚脱脂后，用45%乙醇超声提取3次，每次3小时，合并提取液，提取液浓缩至相对密度I. 14，得总皂苷，将总皂苷溶于2L水中，加入盐酸使溶液中盐酸浓度达到4mol/L，然后加入乙酸乙酯4L，65°C回流8小时，冷却至乙酸乙酯不再沸腾，趁热分取乙酸乙酯层，减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏。取正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比10 : 5 : 5 : 2混合，置于分液漏斗中，充分振 摇后在室温下静置过夜，分取漏斗中的上相(作为固定相)和下相(作为流动相)，超声脱气，将乙酸乙酯浸膏用下乡溶解，作为样品溶液备用。将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后，调整主机转速900r/min,再以2. Oml/min流速泵入下相,待下相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在210nm波长下检测，根据色谱图收集流分，回收试剂，干燥得到单体化合物贝萼皂苷元I. 63g，高效液相检测，含量为97. 8%。
权利要求
1.一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，其特征在于包括如下步骤 a.取干燥土贝母鳞茎，粉碎，用石油醚脱脂后，以乙醇、甲醇、丙酮和水的混合溶剂超声提取2-4次，提取液浓缩至相对密度I. 11-1. 18，得总皂苷； b.将总皂苷溶于水并以此加入酸液和乙酸乙酯后加热进行酸水解，待水解完成后趁热分取乙酸乙酯层并浓缩，得乙酸乙酯浸膏； c.在分液漏斗中配制两相溶剂系统，充分振摇后在室温下静置过夜，分取漏斗中的上相和下相，超声脱气，取步骤b中的乙酸乙酯浸膏用下相溶解，作为样品溶液备用；将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后，调整主机转速，泵入下相，待下相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入样品溶液，在210nm波长下检测，根据色谱图收集得到单体化合物贝萼皂苷元。
2.根据权利要求I所述的一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，其特征在于步骤a中所述提取混合溶剂与药材质量比为8-20 I。
3.根据权利要求I所述的一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，其特征在于步骤b中所述酸水解中所用酸为l-4mol/L盐酸或硫酸，温度为65-85°C。
4.根据权利要求I所述的一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，其特征在于步骤c中所述溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-7K，体积比为(10-12) (4-6) (5-10) (1-5)。
5.根据权利要求I所述的一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，其特征在于步骤c中所述高速逆流色谱仪的主机转速为850-1000r/min，流动相流速为2. 0-4. Oml/min。
全文摘要
本发明公开了一种制备高纯度贝萼皂苷元的方法，本发明采用脱脂、提取、酸水解、萃取及高速逆流色谱分离的方法提取的贝萼皂苷元，纯度高于95％。本发明制备方法操作简单、分离效率高、产品纯度好，适合工业化生产。
文档编号C07J63/00GK102911240SQ20111021872
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者李法庆, 刘东锋 申请人:苏州宝泽堂医药科技有限公司