专利名称：以贝萼皂苷元为活性成分的药物及其在药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及以贝萼皂苷元(Bayogenin)为活性成分的药物及其在药物方面的应用，具体地涉及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用，本发明还涉及贝萼皂苷元的制备工艺。
背景技术：
贝萼皂苷元(Bayogenin)是一种已知化合物，属齐墩果酸类五环三萜，是多种自然界中常见的皂苷的苷元(参见Pharmazie，38(1)，73(German)1983)，其皂苷报道多具有抗肿瘤作用。由于皂苷的直接药用往往伴随着毒性或刺激性等不良反应，更重要的是皂苷在人体内受到水解或破坏而发生结构的改变，真正吸收入血并起药理作用的往往并不是皂苷的原型，而是皂苷的代谢产物。因此对皂苷进行水解，模拟其在体内的降解过程，得到其代谢产物，或进行结构改造以得到全新的化合物，再进行药效学的评价，对于科技工作者来说是一件很有意义的工作，有希望能获得低毒而高效的化合物。在自然界中以贝萼皂苷元为母核的皂苷往往具有一定的药理活性，但贝萼皂苷元的药理活性未见研究报道。本发明人采取水解的方法得到了纯度较高的贝萼皂苷元，经体内、外药理实验证明其具用药理活性，可以作为药物使用，进一步我们发现其抗肿瘤作用明显，是一种有开发前途的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明提供了以贝萼皂苷元(Bayogenin)为活性成分的药物。
本发明提供了贝萼皂苷元的制备工艺。
本发明提供了贝萼皂苷元在药物方面的应用。
本发明提供了贝萼皂苷元在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明提供的以贝萼皂苷元为活性成分的药物，可以是贝萼皂苷元与其它药物联合制备而成，也可以是贝萼皂苷元与药物上可接受的辅料制备而成；均采用药学常规方法。
本发明提供的贝萼皂苷元的制备方法为以葫芦科植物土贝母Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet根茎为原料，根茎粉碎后，以70％-100％乙醇加热回流提取，优选为90％-100％乙醇加热回流提取，提取液回收乙醇得浓缩液。浓缩液上大孔吸附树脂D-101、AB-8或其组合，以30％-80％乙醇水溶液洗脱，优选为40％-60％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得总皂苷。总皂苷溶于乙醇和盐酸溶液的混合溶液中，盐酸浓度为0.1mol/L-3mol/L，优选为1mol/L，加热回流使总皂苷水解。水解后的溶液以NaOH溶液调节pH值至6-8，优选为6-7，过滤不溶物，不溶物以氯仿、甲醇混合溶液反复重结晶，或不溶物经硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇(100∶I-10∶1)梯度洗脱，优选为以氯仿∶甲醇(10∶1-1∶10)梯度洗脱，更优选为以氯仿∶甲醇(2∶1-1∶2)梯度洗脱，均可得贝萼皂苷元纯品。
具体实施例方式
实施例1制备贝萼皂苷元20kg土贝母根茎粉碎后，80升无水(100％)乙醇回流提取2小时，提取液回收乙醇后上大孔吸附树脂，以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得总皂苷317.7g，总皂苷溶于乙醇经1mol/L盐酸水解，以1mol/L NaOH溶液调溶液pH值至7，过滤不溶物，以氯仿∶甲醇(1∶1)重结晶，得贝萼皂苷元111.3g。
实施例2制备贝萼皂苷元20kg土贝母根茎粉碎后，80升90％乙醇回流提取2小时，提取液回收乙醇后上大孔吸附树脂，以50％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得总皂苷286.3g，总皂苷溶于乙醇经0.5mol/L盐酸水解，以0.5mol/LNaOH溶液调溶液pH值至6，过滤不溶物，经硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇(10∶1)洗脱，收集含贝萼皂苷元的成份，得贝萼皂苷元93.3g。
实验例1贝萼皂苷元对体外肿瘤细胞的抑制作用1.1药物及试剂贝萼皂苷元按实施例1制备。
注射用硫酸长春新碱，上海华联制药有限公司，批号000901B，1mg/支。
RPMI1640培养基GIBCO公司生产；
新生牛血清(超级)，杭州四季青生物工程材料有限公司，生产批号020523。
胰蛋白酶，Sigma公司生产；磺基罗丹明B(sulforhadamine B，SRB)，Sigma公司；注射用链霉素，山东瑞阳制药有限公司，1g(100万单位)/支，批号200105101；注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司，80万单位/支，批号L020318。
其它常用化学试剂为国产分析纯。
细胞株人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌细胞株HO8910、人前列腺癌胞PC-3M、人肺腺癌细胞株A549、人结肠癌细胞株HCT-8、人食管癌细胞株CaEs-17、人脑胶质瘤细胞株U251、人胃癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株SGC-7901，均购自中国医学科学院北京肿瘤研究所药理室。
CO2培养箱，超净工作台，酶标仪，倒置显微镜，细胞培养瓶(Costar，USA)，96孔细胞培养板(Costar，USA)。
软件Microsoft Excel 7.0统计分析软件；Microcal Origin 6.0数据处理软件。
1.2实验方法药物及试剂配制RPMI1640培养基一袋加水一升，补加2克碳酸氢钠，10万单位青霉素和100mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22μm除菌滤膜过滤除菌。90ml培养基加灭活新生牛血清10ml即为完全培养液。胰蛋白酶用D-hanks缓冲液配成0.25％溶液后过滤除菌。
准确称取贝萼皂苷元20.0mg于灭菌离心管中，加入DMSO 1ml，配成20mg/ml原液。取10μl原液加到10ml的完全培养液中，即成为20μg/ml应用液，再分别用完全培养液稀释为10、5、2.5和1.25μg/ml的应用液。
细胞培养及传代所有细胞均贴壁培养于含10ml完全培养液细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2、饱合湿度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌D-hanks液洗两次，加0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30ml后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，继续培养。
药物处理取刚刚长满的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后加10ml完全培养液悬浮细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液于显微镜下计数细胞数目，用完全培养液调整细胞数目至105个细胞/毫升。取96孔板一块，用移液枪吸取100ul细胞悬液加到96孔板中，每株细胞加4列，一块培养板可加3株不同细胞。另用一培养板同样细胞悬液各四个孔做本底对照。加完细胞的培养板于CO2培养箱中培养12小时后倒掉原培养液，96孔板中A行加入新鲜完全培养液200μl，B行加入200μl含0.02％二甲基亚砜(DMSO)的完全培养液作溶剂对照，C行加入200μl含25μg/ml长春新碱的完全培养液作阳性对照，D行到H行加入含不同浓度贝萼皂苷元的完全培养液200ul，最高浓度为20μg/ml，按0.5倍倍比稀释，分别为10、5、2.5、1.25μg/ml。加完药后培养板置于CO2培养箱中培养。
上述实验均在严格无菌条件下进行。
结果测定将对照用培养板取出于含细胞孔中轻轻加入25ul 50％预冷的三氯醋酸溶液于培养液面上，静置5分钟后，在4℃冰箱放置1小时，弃去上层液体，用去离子水洗5遍，置空气中干燥后留待与加药培养板一并染色分析。
细胞加药培养48小时后，取出培养板，于每孔加入50ul预冷的50％三氯醋酸，静置5分钟后移入4℃冰箱中静置1小时，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥，待完全干燥后每孔加入1％的乙酸配制的0.4％的SRB 100ul，染色20分钟后倒掉染液，用1％乙酸洗5次，去除未结合的染料。空气中干燥后用pH 10.5的10mmol/L的非缓冲Tris碱液150ul溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，在BioRad酶标仪上测定各孔在490nm的光吸收。本底对照板的细胞同样处理测定OD490。
根据各孔OD490计算药物对细胞增殖的抑制率
根据药物浓度对数与抑制率，用Microcal Origin软件作直线回归，得到直线方程，计算抑制率在50％时对应的药物浓度即为贝萼皂苷元对肿瘤细胞的半抑制浓度(IC50)。于上述同样条件下测定每株细胞的IC50。
1.3实验结果表1.不同浓度药物对细胞的增殖抑制率和半抑制浓度(IC50)药物浓度(μg/ml)IC50细胞株2010 5 2.5 1.25 (μg/ml)SMMC-7721 91.8 80.055.737.223.63.72Bel 740285.8 66.431.620.011.16.41HO8910 80.1 70.142.923.99.6 5.95CaEs-17 88.7 71.234.227.29.9 5.69A54991.3 70.041.230.512.85.15PC-3M 86.4 64.435.728.89.1 6.03HCT-8 77.7 65.336.530.813.06.27U25183.0 51.130.527.811.67.34BGC 81.4 55.536.023.38.6 7.11SGC 83.3 57.439.926.817.16.21实验结果表明，贝萼皂苷元对多种人源肿瘤细胞株，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌细胞、前列腺癌、结肠癌、食管癌、神经胶质瘤等均有较强的抑制其增殖作用，IC50均小于10μg/ml。
实验例2贝萼皂苷元体内抑瘤作用2.1材料和试剂贝萼皂苷元按实施例2方法制备。
昆明种小鼠，体重18-22g，雄性，山东省天然药物工程技术研究中心动物中心提供。C57BL/6小鼠，体重18-22g，雄性，购自上海西普尔-毕凯实验动物有限公司。S180肉瘤、H22肝癌、U14宫颈癌和Lewis肺癌瘤株，购自中国医学科学院北京药物所。
2.2实验方法S180肉瘤、H22肝癌和U14宫颈癌接种取于昆明鼠腹腔内接种传代七天的上述荷瘤小鼠，消毒腹部皮肤后，抽取腹水，加入三倍体积的注射用生理进水稀释，消毒昆明鼠腋下皮肤，每只小鼠于腋下注射瘤细胞悬液0.2ml，各瘤株分别接种50只小鼠。
Lewis肺癌接种取已接种10天的Lewis肺癌、生长状态良好的小鼠，脱颈处死，用酒精消毒皮肤后，剥取肿瘤组织，加入五倍重量的生理盐水后用组织匀浆器研磨成匀浆，100目灭菌不锈钢网过滤。消毒每只小鼠左侧腋下皮肤，接种瘤液0.2ml。接种50只小鼠。接瘤后第二天随机分为5组，分别为模型组、环磷酰胺对照组(80mg/kg)、贝萼皂苷元高(50mg/kg)、贝萼皂苷元中(5mg/kg体重)和贝萼皂苷元低(0.5mg/kg)组。环磷酰胺用生理盐水配成4mg/ml，贝萼皂苷元用聚乙二醇做助溶剂，配成2.5、0.25和0.025mg/ml，给药量0.2ml/10g体重。环磷酰胺接瘤后第二天给药一次，贝萼皂苷元各组于接瘤后第二天给药，隔日一次，共5次。贝萼皂苷元末次给药后第三天处死小鼠，剥取瘤组织称重。计算抑瘤率。
2.3实验结果实验结果分别见表2、3、4、5。
结果表明，贝萼皂苷元注射给药对小鼠S180、H22、U14和Lewis等肿瘤均具有明显的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性。高剂量和中剂量组抑瘤率均超过50％。给药组各组小鼠一般状态观察表明，环磷酰胺组小鼠被毛稀少，暗淡，活动减少，精神状态较差，体重明显低于模型组及其他各给药组。而贝萼皂元高、中、低剂量的三组小鼠除高剂量组体重较对照组稍低外，一般状态明显优于环磷酰胺组，中剂量组和低剂量组体重与模型组比较没有明显降低。表明贝萼皂苷元具有明显的抗肿瘤作用，且毒副作用较环磷酰胺小。
表2.贝萼皂苷元对S180肉瘤体内增殖的抑制作用剂量 体重瘤重 抑瘤率组别 鼠数(mg/kg) (g) (g) (％)模型组10 —— 29.8±2.1 7 2.41±0.68环磷酰胺组1080 25.8±1.68**0.82±0.21**66.01050 27.4±2.33＝0.91±0.35**62.2贝萼皂苷元105 29.4±2.41＝＝0.88±0.31**63.5100.5 30.1±2.64＝＝1.67±0.47*30.7与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。与环磷酰胺组比较＝，P＜0.05；＝＝，P＜0.01。
表3.贝萼皂苷元对H22肝癌体内增殖的抑制作用剂量 体重瘤重 抑瘤率组别 鼠数(mg/kg) (g) (g) (％)模型组10 ——29.6±2.69 1.77±0.33环磷酰胺组10 8024.9±1.89**0.77±0.28**56.510 5026.4±2.13＝*0.68±0.30**61.6贝萼皂苷元10 5 28.7±2.47==0.78±0.36**55.910 0.5 29.5±2.26＝＝1.34±0.47*24.3与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。与环磷酰胺组比较#，P＜0.05；##，P＜0.01。
表4.贝萼皂苷元对U14宫颈癌体内增殖的抑制作用剂量 体重 瘤重 抑瘤率组别 鼠数(mg/kg)(g) (g) (％)模型组 10—— 28.4±1.74 2.54±0.58环磷酰胺组 10 80 25.4±1.33**1.07±0.45**57.910 50 26.9±1.31＝*1.24±0.51**51.2贝萼皂苷元 10 5 27.9±1.67＝＝1.33±0.43**47.610 0.5 28.1±1.88＝＝1.92±0.68*24.4与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。与环磷酰胺组比较＝，P＜0.05；＝＝，P＜0.01。
表5.贝萼皂苷元对Lewis肺癌体内增殖的抑制作用剂量体重瘤重 抑瘤率组别 鼠数(mg/kg) (g) (g) (％)模型组 10 ——25.6±0.37 1.68±0.33环磷酰胺组 10 80 22.3±0.48**0.52±0.31**69.010 50 24.4±0.47＝*0.64±0.36**61.9贝萼皂苷元10 5 26.0±0.34＝＝0.66±0.44**60.710 0.525.5±0.28＝＝1.28±0.34*23.8与模型组比较*，P＜0.05；**，P＜0.01。与环磷酰胺组比较＝，P＜0.05；＝＝，P＜0.01。
权利要求
1.一种以贝萼皂苷元为活性成分的药物。
2.根据权利要求1所述的药物，其可以与药物上可接受的辅料制成药物组合物，也可以与其它药物联合制备成药物组合物。
3.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于该药物中含有1％至99％的贝萼皂苷元。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于该药物中优选含有30％至80％的贝萼皂苷元。
5.根据权利要求1或2所述的药物，化合物贝萼皂苷元的制备方法包括(1)取土贝母根茎粉碎后，以乙醇加热回流提取，提取液回收乙醇得浓缩液；(2)浓缩液上大孔吸附树脂，以一定浓度的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂得总皂苷；(3)总皂苷溶于乙醇和酸溶液的混合溶液中，加热回流使总皂苷水解；(4)水解后的溶液以NaOH溶液调节pH值；(5)过滤得不溶物；(6)不溶物以氯仿、甲醇混合溶液反复重结晶，得贝萼皂苷元纯品。或不溶物经硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇(100∶1~10∶1)梯度洗脱，也可得贝萼皂苷元纯品。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于步骤(1)中所用的乙醇的浓度为70％至100％，步骤(2)中所用的大孔吸附树脂选自D-101、AB-8或其组合；步骤(2)中所用的乙醇水溶液的浓度为30至80％；步骤(3)中所用的酸为浓度0.1mol/L至3mol/L的盐酸；步骤(4)中所述的pH值为6至8；步骤(6)中所用的氯仿、甲醇溶液为10∶1-1∶10。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于步骤(1)中所用的乙醇的浓度优选为优选90％至100％；步骤(2)中所用的乙醇水溶液的浓度优选40％至60％；步骤(3)中所用的盐酸浓度优选为1mol/L；步骤(4)中所述的pH值为优选为6至7；步骤(6)中所用的氯仿、甲醇溶液比优选为2∶1-1∶2。
8.根据权利要求1或2所述的药物，其可以通过口服途径、注射或外用途径给药。
9.贝萼皂苷元在制备药物方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于贝萼皂苷元在制备抗肿瘤药物方面的应用。
全文摘要
本发明提供了以贝萼皂苷元(Bayogenin)为活性成分的药物，其可单独与药用辅料或与其它药物联合制备成药物，本发明还提供了其在制备药物方面的应用，具体地提供了其在制备抗肿瘤药物方面的应用，本发明还提供了规模制备贝萼皂苷元(Bayogenin)的工艺。
文档编号A61K31/56GK1650869SQ20041010107
公开日2005年8月10日 申请日期2004年12月7日 优先权日2003年12月8日
发明者刘军锋, 王振华, 姜永涛, 刘珂 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司