专利名称：一种补体抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种补体抑制剂，更具体地说，本发明涉及一种以有效量的化合物升麻内酯A为活性成分并配于药学上可接受的载体组成的补体抑制制剂。
背景技术：
自从1889年Buchner报告以单一血清成分提出防御素(alexine，即现在所说的补体)以来，经过一个多世纪的研究，已经清楚补体是由13个固有成分、近20种调节因子及10余种补体受体共同组成的一个适应性防御系统。同时补体包括许多与补体功能相关的分子。所有补体成分都是蛋白质，其组成的众多成分的结构和功能的研究，以及对补体相关学科及临床实践关系的研究，构成了相对独立的分支学科，即“补体学”(Complementology)。Bordet实验证实各种动物红血细胞抗体加入补体可以引起免疫溶血现象。由于对漏出的血红蛋白可以进行定量测定，建立了羊红细胞的免疫溶血系统E(红细胞)、A(抗羊红细胞抗体)及C(补体)，为补体功能的研究提供了优良的实验模型。他还进一步发现，将免疫血清预先与其他抗原抗体系统相作用，则血清可丧失溶血活性，从而建立了体外补体结合试验，在此研究基础上形成了补体(complemetary)的概念，即补体为血清的单一成分，补体的溶菌、溶细胞作用有赖于抗体的存在，任何系统的抗原抗体复合物均具有固定补体的作用。根据英中医学词海解释补体原指血清中引起免疫性细胞溶解(抗体包裹细胞溶解)的不耐热因子，现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能系统，该系统不仅是细胞性溶解的效应物，而且也是生物功能的效应物。补体激活有经典和替代两种途径。经典途径的蛋白质称为“补体成分”，以缩写符号C1至C9表示。C1是三种不同的蛋白(C1q，C1r，C1s)的钙依赖性复合物。替代途径(旁路)的蛋白质(统称为裂解素系统)和补体调节蛋白，则以其半系统名或俗名为众人所熟悉。补体裂解产生的片段，用小写的字母后缀表示(C3a)。未激活的片段用后缀“i”表示，如C3bi。激活的具有生物活性的补体成分或复合物，则在符号前加一横线，如C1-，C4b，2a-。经典途径通过C1与单个IgM分子或相邻的两个IgG分子相结合。替代途径可以被IgA免疫复合物激活，也可以为非免疫物质，包括细菌内毒素、微生物的多糖类和细胞壁激活。经典途径的激活可以产生触发酶系列，涉及C1，C4，C2和C3而替代途径的激活则可触发C3和B、D、P因子的酶系列。二条途径最后都使C5裂解和形成膜攻击复合物。补体激活同时还形成许多具有生物学活性的补体片段，起过敏毒素，调理素或趋化因子的作用。生物学活性补体产物、补体系统酶和活性复合物的描述如下表<CR＝CC40.CR>。
升麻是我国十分常用的著名中药，主要为毛茛科植物三叶升麻Cimicifugaheracleifolia Kom、兴安升麻C.dahurica Maxim、升麻或绿升麻C.foetida L.的干燥根茎。升麻具有发表透疹，清热解毒，升举阳气的功效；常被用于风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑，脱肛，子宫脱垂等病症。升麻Cimicifuga foetida L.主要产于云南、贵州、四川、湖北等地，是大量栽培的常用中药材。升麻是我国十分常用的著名中药，主要为毛茛科植物三叶升麻Cimicifuga heracleifo Kom、兴安升麻C.dahurica Maxim、升麻或绿升麻C.foetida L.的干燥根茎。升麻具有发表透疹，清热解毒，升举阳气的功效；常被用于风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑，脱肛，子宫脱垂等病症。升麻Cimicifuga foetida L.主要产于云南、贵州、四川、湖北等地，是大量栽培的常用中药材。现有技术中尚未有化合物升麻内酯A作为补体生物活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以有效量的化合物升麻内酯A化合物为活性成分并配于药学上可接受的载体组成的补体抑制剂，以及该补体抑制剂的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现一种补体抑制剂，其中含有有效量的化合物升麻内酯A和药学上可接受的载体。
补体抑制剂的制备方法先取升麻Cimicifuga ssp.的根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次约3-4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，用硅胶柱层析分离2-5次，洗脱液用氯仿∶甲醇(或氯仿/丙酮)梯度洗脱，洗脱得到化合物升麻内酯A，然后加入药学上可接受的载体，得补体抑制制剂。
更具体的制备方法为取升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，乙酸乙酯提取部位用1000g硅胶柱层析分离，洗脱液用氯仿∶甲醇从100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脱，由氯仿/甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部位Fr.4，该分离部位Fr.4用1000g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脱，由氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.1，该分离部位Fr.4.1用450g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从50∶1；40∶1梯度洗脱，依次得到两个化合物及分离部位Fr.4.1.1和分离部位Fr.4.1.2，分离部位Fr.4.1.2用150g硅胶柱层析再次分离，用氯仿∶甲醇40∶1洗脱得到化合物升麻内酯A，然后加入药学上可接受的载体，得补体抑制剂。
本发明的化合物升麻内酯A用作药物上时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1-99％，优选0.5-90％的升麻内酯A，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效部位以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服给药。
口服可用其固体或液体制剂，如片剂、散剂、糖衣剂、胶囊、溶液、乳剂、糖浆、滴丸剂等。
具体实施例方式下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。
实施例11、升麻内酯A化合物(以下简称K-13)的提取分离及制备方法取升麻Cimicifuga foetida L.的干燥根茎2.5Kg，粉碎后用甲醇提取三次，每次约4小时；甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇；再加一定量的水稀释之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，浓缩得到187g石油醚提取部位；然后水层再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，浓缩得到245g乙酸乙酯提取部位。245g乙酸乙酯提取部位用1000g硅胶柱层析分离，洗脱液用氯仿∶甲醇从100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脱，由氯仿/甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部位Fr.4重约97g。该分离部位97g Fr.4用1000g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脱，由氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.1重约21.6g。该分离部位21.6g Fr.4.1用450g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从50∶1；40∶1梯度洗脱，依次得到两个化合物K-12，K-15，及分离部位Fr.4.1.1和分离部位Fr.4.1.2，分离部位Fr.4.1.2约重2.5g。该分离部位Fr.4.1.2用150g硅胶柱层析再次分离，用氯仿∶甲醇40∶1洗脱得到化合物K-13，重约17mg。
2、K-13化合物的结构确定K-13化合物C33H50O9，无色针状晶体(甲醇)，mp 255-256℃，[α]D＝-36.7°(c 0.75，CHCl3-MeOH 1∶1)。
氢核磁共振谱数据δ(ppm)5.05(1H，dd，J＝9，3Hz，12-H)，4.78(1H，dd，J＝14，7.5Hz，16-H)，3.49(1H，dd，J＝11，4Hz，3-H)，2.69(1H，dd，J＝16.2，3.1Hz)1.15(1H，dd，J＝16.2，3.1Hz)(11-H)；2.45(1H，m)2.25(1H，m)(22-H)；2.26(1H，d，J＝10.8)1.83(1H，m)(2-H)，2.12(1H，d，J＝7.5Hz，17-H)，1.99(1H，m，20-H)，1.96(1H，m)1.80(1H，m)(15-H)，1.60(1H，dd，J＝11.5，5Hz，8-H)，1.49(1H，m)1.10(1H，m)(1-H)；1.46(1H，m)0.70(1H，m)(6-H)；1.25(3H，s，29-H)，1.23(1H，m，5-H)，1.24(1H，m)0.92(1H，m)(7-H)；1.23(3H，s，18-H)，1.00(3H，s，30-H)；0.95(3H，d，J＝6Hz，21-H)，0.83(3H，s，28-H)，0.56(1H，d，J＝3.4Hz)0.19(1H，d，J＝3.4Hz)(19-H)。COCH3部分2.12(3H，s，COCH3)。木糖部分4.84(1H，d，J＝7.5Hz，1’-H)，4.21(1H，m，4’-H)，4.15(1H，dd，J＝8.5，8.0Hz，3’-H)，4.03(1H，dd，J＝8.0，7.5Hz，2’-H)，3.73(2H，m，5’-H)。
碳核磁共振谱数据δ(ppm)174.0(s，23-C)，88.2(d，3-C)，80.6(d，16-C)，76.8(d，12-C)，53.7(d，17-C)，48.4(s，13-C)，47.0(s，14-C)，47.0(d，5-C)，46.0(d，8-C)，43.9(t，15-C)，38.7(t，22-C)，41.3(s，4-C)，36.5(t，11-C)，32.0(t，1-C)，30.0(t，19-C)，29.7(t，2-C)，27.0(s，10-C)，27.0(d，20-C)，25.8(q，29-C)，25.7(t，7-C)，22.1(q，21-C)，20.4(t，6-C)，19.6(s，19-C)，19.6(s，28-C)，15.4(q，30-C)，13.3(q，18-C)。COCH3部分170.9(s，CO)，21.5(q，COCH3)。木糖部分107.6(s，1’-C)，78.7(d，3’-C)，75.7(d，2’-C)，71.3(d，4’-C)，67.2(t，5’-C)。
红外光谱数据IR(KBr)νmax3650-3200，1740，1720，1290，1255，1090，1045cm-1。
3、化合物K-13的化学结构 化合物K-13，为从升麻干燥地上部分用80％乙醇提取物中分离得到的升麻内酯A(Cimilactone A)。
4、化合物K-13的抗补体生物活性作用化合物K-13的抗补体生物活性实验将含有80μl补体血浆的正常人血浆稀溶液，和加了样品和没有加样品的80μl明胶GVB2+缓冲液混合。每个样品溶于DMSO，并将其作为阴性对照。混合液在加进40μl被激活的血红细胞(羊血红细胞)之后，将混合物在37℃下预培养30分钟。在相同的实验条件下培养之后，混合物在4℃下1500rpm离心，取100μl上清液用在450nm下测定光密度(Yamada et al.，1985)用Yamata H.，Ohtani K.，Kiyohara H.，Cyong J.C.，Otsuka Y.，Ueno Y.，Omura S.，1985.Purification and chemical properties of anti-complementarypolysaccharide from the leaves of Artemisia princes.Planta Medica 51121-125.的方法做；然后采用三次测定方法计算抗补体活性，IC50值由对照的补体依赖溶血作用计算给出(Oh et al.，1996)。按Oh S.R.，Jung K.Y.，Lee H.K.，1996.Invitro anti-complementary activity of phenylpropanoids from Agastache rugosa.Korean Journal of Pharmacognosy 2720-25.报道的方法做。
表1 K-13化合物抗补体活性实验数据阳性对照Tiliroside Conc.79μM IC50＝78.58μM
从化合物K-13的抗补体IC50值为28.62μM与阳性对照Tiliroside的IC50＝78.58μM比较，抗补体活性强2.7倍，可以推断化合物K-13具有较强的抗补体生物活性。
实施例2按实施例1制得K-13，按K-13与赋形剂重量比1∶5的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例3按实施例1制得K-13，按K-13与赋形剂重量比1∶6的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4片剂K-13 20mg淀粉 100mg玉米浆 适量硬脂酸镁 适量实施例5按实施例1制得K-13，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
实施例6胶囊剂K-1320mg淀粉100mg葡萄糖 200mg硬脂酸镁适量制备方法将K-13与助剂研匀混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
实施例7散剂K-13 20mg淀粉 100mg蔗糖 200mg制备方法将K-13、淀粉、蔗糖研细，混合均匀，过筛，分包即得。
权利要求
1.一种补体抑制剂，其中含有有效量的化合物升麻内酯A和药学上可接受的载体。
2.权利要求1补体抑制剂的制备方法，其特征在于取升麻Cimicifugafoetida L.的根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次3-4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释，用石油醚萃取2-3次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取2-3次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，用硅胶柱层析分离2-5次，洗脱液用氯仿∶甲醇(或氯仿/丙酮)梯度洗脱，洗脱得到化合物升麻内酯A，然后加入药学上可接受的载体，得补体抑制剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于取升麻Cimicifuga foetidaL.的干燥根茎，粉碎后用甲醇提取三次，每次4小时，甲醇提取液过滤除去药渣后，减压浓缩至蒸不出甲醇，再加一定量的水稀释之后，用石油醚萃取三次，回收石油醚后，浓缩得到石油醚提取部位，然后水层再用乙酸乙酯萃取三次，回收乙酸乙酯，浓缩得到乙酸乙酯提取部位，乙酸乙酯提取部位用1000g硅胶柱层析分离，洗脱液用氯仿∶甲醇从100∶0；100∶1；50∶1；20∶1到1∶1梯度洗脱，由氯仿/甲醇20∶1洗脱液洗脱得到的部位Fr.4，该分离部位Fr.4用1000g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从40∶1；30∶1；20∶1梯度洗脱，由氯仿∶甲醇40∶1洗脱液洗脱得到的部分，浓缩后得到分离部位Fr.4.1，该分离部位Fr.4.1用450g硅胶柱层析再次分离，继续用洗脱液用氯仿∶甲醇从50∶1；40∶1梯度洗脱，依次得到两个化合物及分离部位Fr.4.1.1和分离部位Fr.4.1.2，分离部位Fr.4.1.2用150g硅胶柱层析再次分离，用氯仿∶甲醇40∶1洗脱得到化合物升麻内酯A，然后加入药学上可接受的载体，得补体抑制制剂。
全文摘要
提供一种以有效量的化合物升麻内酯A化合物为活性成分并配于药学上可接受的载体组成的补体抑制制剂，以及该补体抑制剂的制备方法。
文档编号A61P43/00GK1618432SQ200410040179
公开日2005年5月25日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者邱明华, 孙丽荣, 闵炳善, 李烔奎, 李忠荣, 裴盛基 申请人:中国科学院昆明植物研究所