专利名称：淋巴细胞冷冻保存的方法
技术领域：
本发明涉及一种淋巴细胞分离、保存的方法。
背景技术：
目前的细胞疗法，生物疗法是用患者现时点的材料，如细胞、组织等，甚至使用他人的材料进行治疗。这种方法存在着一些缺点。比如，现时的患者是一个病人，当然其身体状况会反映到所使用的治疗用的材料上。癌症的患者其细胞有可能对癌细胞的杀伤活性已经很低，病毒感染的患者有可能淋巴细胞已经被侵染，老年病人的机体、组织、细胞都有可能已经出现老化等等。癌症患者在经过手术治疗、或放射线治疗、化学治疗之后，机体已经是很虚弱，细胞也有可能在数量上、质量上已经受到了严重的损伤。如果在用其他的方法治疗之后再进行生物治疗的准备，又可能需要花去相当多的时间，而延误治疗的时机。利用他人的材料可以解决材料老化、病弱等问题，但是有可能受到材料提供者的疾病的传染，更有可能出现异体移植而发生的拒绝反应。
如果把人的将来有可能需要的细胞或是组织，在其年轻力壮、细胞或是组织活性最大时加以保存，以供需要之时，通常是年老体弱，罹患疾病之时使用，就可以很好地解决上述问题。
发明内容
为了解决患者，特别是癌症、免疫学疾病、各种感染症的患者，在需要细胞治疗之时，能够提供一种健康或较为健康的、有较大活性的治疗材料，本技术提供一种方法，将健康人或是病期处于初期的患者，比如癌症患者手术之前，或放射线疗法、化学疗法之前，将健康人或患者的细胞取出体外，用适当的方式加以保存，用于将来患者本身疾病的预防或治疗。
要解决的技术问题目前尚未有一种从根本上解决上述问题的方法。本技术方案为解决上述问题提供了可能。通过采取健康或是比较健康时志愿者的细胞，采用体外激活、增殖、保存的方法，可以将健康人的细胞保存20年以上的时间。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，用于人的淋巴细胞保存。首先志愿者为细胞保存提出申请，申请者的血液检查，静脉采血，自静脉血中通过密度离心法分离淋巴细胞，淋巴细胞的激活和培养，活性化淋巴细胞的回收，淋巴细胞的冷冻保存，使用时冷冻细胞的解冻复原等过程。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于癌症的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于免疫低下症的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于各种感染症的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于各种过敏症的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于先天性免疫不全症的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于后天性免疫不全症的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。用于各种自己免疫性疾病的预防或治疗。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自健康人的淋巴细胞。作为各种生物治疗的原材料。
本技术提供了一种细胞的保存方法，在优选的技术方案中，其中保存来自手术之前的癌症病人、或是病情早期病人的细胞，或是其他疾患患者的早期，淋巴细胞较为健康时的细胞。作为治疗的原材料。
为证明本发明技术方案的有效性，可按照下列方法进行试验实施方式1.志愿者签订血液细胞保存同意书。同意书中规定志愿者的细胞没有志愿者的同意不可挪用。
2.对志愿者的血液进行常规检查。为保证细胞的质量，在细胞分离培养之前要对血液进行常规的检查。其中包括艾滋病病毒检查，肝炎病毒的检查，梅毒检查，以及其他有可能影响细胞质量及患者健康的项目的检查。
3.静脉血液的采取。用加有肝素的注射器，18G的注射针头，用通常的方法自志愿者静脉中抽取血液5-100ml。肝素的量根据取血的多少决定。
4.血液的处理。将装有血液的注射器用酒精消毒之后，置于无菌操作台中，将血液轻轻注入离心管或适当的容器中。采取的血液用等量的生理盐水稀释，混匀后待用。
5.细胞的分离。将比重分离液Ficoll(Lymphosepar I)(d＝1.01-1.10)2-20ml加入离心管中，用移液管吸取上述步骤4稀释过的血液，轻轻地重层于比重分离液之上。将离心管轻轻放入离心机中，在室温brake off的状态下，1000-2000rpm离心5-30分钟。
6.细胞的回收离心机完全停稳之后，将离心管轻轻地取出，用吸管将上层溶液吸出弃去，或另行保存作细胞培养时的血清用。中间层用吸管轻轻吸出，回收于一新离心管中。
7.细胞的洗净。往回收的细胞中加入10-40ml生理盐水，放入离心机中，在室温brake on的状态下，1000-2000rpm离心5-30分钟。上清液弃去后，再加入10-40ml生理盐水，用台式混合器混合后，在同样条件下再离心一次。
8.细胞的调配洗净后的细胞用含有1-10％的人血清和1000-100000 U/ml IL-2的RPMI-1640 5-50ml悬浮，备用。
9.培养瓶的准备平底培养瓶中加入用生理盐水或是PBS(-)溶解的1-40μg/ml的抗CD3抗体1-10ml，4℃-室温静置1-24小时。弃去溶液后用生理盐水或是PBS(-)溶液洗涤3次，备用。
10.细胞的培养将步骤8的细胞溶液移入步骤9处理过的培养瓶中，置于37℃ 5％CO2培养箱中培养1-3天。
11.冷冻保存液的准备将5ml DMSO加入到RPMI-1640 40ml中，在加入人血清1-5ml。
12.保存细胞的调整将步骤10培养后的细胞洗净后，计数。用步骤11的细胞冷冻保存液将细胞的浓度调整为1×107-1×108，移入试管中保存。每试验管中保存1-10ml细胞液。
13.细胞的保存将盛有细胞的试管置于程控保温杯中，放入4℃冰箱，1-12小时后，转入-80℃冰箱，4-24小时后，放入液氮保存。
14.细胞的解冻在需要时，将冷冻保存的细胞从液氮中取出，置于37℃水浴锅中使之快速解冻。解冻后的细胞用RPMI-1640洗涤两次之后，加入所需要的培养液中培养。
有益效果本技术可以为健康人的将来提供一个治疗多种疾病的选择，或是为病程初期的患者保留一些比较健康且安全的治疗材料。
权利要求
1.一种血液细胞的保存方法，涉及将人的淋巴细胞进行保存。其内容包括志愿者为细胞保存提出申请，申请者的血液检查，静脉采血，自静脉血中通过密度离心法分离淋巴细胞，淋巴细胞的激活和培养，活性化淋巴细胞的回收，淋巴细胞的冷冻保存，使用时冷冻细胞的解冻复原等过程。
2.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗癌症。
3.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗各种免疫低下症。
4.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗各种感染症。
5.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗各种过敏症。
6.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗各种先天性免疫不全症。
7.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗后天性免疫不全症。
8.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于预防或是治疗各种自己免疫性疾病。
9.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存健康人的淋巴细胞，用于作为各种生物治疗的原材料。
10.权利要求1所述的血液细胞的保存方法，保存癌症病人手术之前、或是病情早期的细胞，或是其他疾患的患者的早期，淋巴细胞较为健康时的细胞，用于作为治疗疾病的原材料。
全文摘要
一种细胞分离、保存的方法，是将健康或较为健康的、有较大活性的细胞取出体外，进行分离、激活、增殖，然后冷冻保存或不进行冷冻保存，以期在需要的时候，提供一个有效的、且安全可靠的、疾病预防或治疗的材料。其内容包括志愿者为细胞保存提出申请，申请者的血液检查，静脉采血，通过密度离心法自静脉血中分离淋巴细胞，淋巴细胞的激活和培养，活性化淋巴细胞的回收，淋巴细胞的冷冻保存，使用时冷冻细胞的解冻复原等过程。
文档编号A61K35/12GK1715400SQ20041006223
公开日2006年1月4日 申请日期2004年7月1日 优先权日2004年7月1日
发明者宋清华 申请人:宋清华