专利名称：一枝蒿有效部位在制备抗呼吸道病毒的药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种一枝蒿有效部位酮酸和黄酮的新制药用途。
背景技术：
呼吸道合胞病毒和副流感病毒均属于副粘病毒科肺炎病毒属，为单负股RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病。目前对病毒性感冒尚无有效的治疗措施，我们将一枝蒿有效部位酮酸和黄酮用于临床，对呼吸道病毒引起的上呼吸道疾病有一定疗效。本发明是在CN2004100083763的基础上，将一枝蒿有效部位酮酸和黄酮在制备抗呼吸道病毒的药物用途。
发明内容
本发明目的是提供一枝蒿有效部位酮酸和黄酮在制备抗呼吸道病毒的药物用途。
研究一枝蒿有效部位对呼吸道合胞病毒(RSV)及副流感病毒(PIV)的体外抑制作用。方法①选用鸡胚法考察一枝蒿有效部位对PIV的抑制作用；②微量细胞病变抑制法计算各药物的半数有效量(IC 50)及治疗指数(TI)。结果①血凝滴度实验表明，在对PIV的直接作用，治疗作用和预防作用三方面一枝蒿有效部位有效；②一枝蒿有效部位抗RSV的IC 50为33.15±8.12mg/L，TI值为38.45±5.16；而病毒唑的IC 50和TI值分别为22.23±6.09mg/L及91.89±11.50mg/L。结论一枝蒿有效部位对PIV和RSV具有抑制作用。
具体实施例方式
实施例一枝蒿有效部位酮酸和黄酮抗呼吸道病毒作用的实验研究本研究对该药进行了PIV及RSV的体外抗病毒试验，并判断一枝蒿有效部位酮酸和黄酮的抗病毒效果。
1材料1.1药物一枝蒿有效部位酮酸和黄酮，颗粒型，分别取10g溶解于20m l无菌双蒸水中，0.22μm滤膜除菌过滤，无菌试验96h(-)，4℃保存待测。病毒唑注射液，剂型1ml装(100mg)。
1.2病毒病毒毒株PIV为省防疫站提供；RSV-Long株，购自北京病毒所。
1.3细胞 为HeLa细胞传代株。
1.4鸡胚 将鸡胚在实验室39℃下孵育至12d胚龄，备用。
2方法2.1副流感病毒抑制实验①药物的直接灭活作用将一枝蒿酮酸、一枝蒿黄酮和病毒唑分别与病毒等量混合，37℃作用2h，接种量为0.2ml/胚。②药物的治疗作用先将病毒以0.1ml/胚接种至鸡胚内，4h后再以0.1ml/胚分别接种三种药品注射液。每组实验均接种3个鸡胚，35℃孵育3d，4℃过夜后收获尿囊液，进行血凝实验。在大孔塑料板内用生理盐水将尿囊液先按1∶10稀释，再进行倍比稀释1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，共得7个浓度梯度。每孔加入1％的鸡红细胞悬液，摇匀，静置45min后观察。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以“++”为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度。以上实验均设生理盐水对照(排除血细胞自身的非特异凝集)和病毒对照。判断结果时如果药物实验组血凝滴度为病毒对照组的1/4以下，即说明药物对病毒增殖有抑制作用。
2.2呼吸道合胞病毒抑制实验①药物对HeLa细胞的毒性测定以50mg/ml一枝蒿酮酸为原液，用无血清的DMEM作连续10倍系列稀释后接种于已形成单层的HeLa细胞中，每孔100μl，每一稀释度重复4孔，以DMEM液代替药物作为正常细胞对照，37℃0.05(体积分数，下同)CO2孵育。动态观察结果，记录由药物产生的细胞病变效应(cvtopathiceffect，CPE)，按Reed-Muench法计算CPE不再进展时(约72h)药物的半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。一枝蒿酮酸和阳性对照病毒唑的细胞毒性测定以同法同时进行。
②药物对RSV-Long株病毒的抑制作用一枝蒿有效部位酮酸和黄酮和病毒唑3种药物在同一块96孔板中同时进行。倾去已形成单层的HeLa细胞培养上清，加入100 TCID 50RSV-Long株病毒(种子病毒取0.1ml作1×10-3.6倍稀释即得)，每孔100μl，37℃吸附1h后甩去上清，用PBS洗2次，洗去游离病毒。选用3种药物的最大无毒浓度(TD0)为第一孔，以无血清的DMEM作连续2倍系列稀释6个浓度，每个浓度均做4孔，分别加入上述已感染病毒的HeLa细胞孔内，每孔100μl，33℃0.05 CO2培养，同时分别设立正常细胞对照及病毒对照。连续动态观察，以细胞对照形态正常，CPE(-)，病毒对照CPE达“++”时记录结果(RSV致CPE特征是感染细胞与邻近细胞融合，形成合胞体。病变范围＜25％为+，25％～50％为++，50％～75％为+++，＞75％为++++。按Reed-Muench法计算3种药物对RSV致CPE产生50％抑制的浓度，即药物的半数有效量(IC 50)。整个实验重复3次(n＝3)，计算IC50平均值，并对3种药物的结果进行分析，经固定染色后拍照。③药物治疗指数(TI)按TI＝TD 50/IC 50进行计算。
3结果3.1药物对副流感病毒的抑制作用实验中测得病毒对照组的血凝滴度为1∶340，生理盐水对照组为“0”，所以，若实验组血凝滴度低于1∶80，则说明有效。由表1可见，一枝蒿有效部位酮酸和黄酮和病毒唑在对副流感病毒的直接作用、治疗作用上均有效，且一枝蒿酮酸对副流感病毒直接作用有效率较好。
表1 不同药物抗副流感病毒作用
3.2 药物对呼吸道合胞病毒的抑制作用(1)药物对HeLa细胞的毒性作用以量化单位药物半数中毒量TD50和最大无毒量TO0来表示，结果见表2。可见3种药物在高浓度时对HeLa细胞均有一定的毒性作用。我们在进行药物的抗病毒试验时选用药物的最大无毒量TD0开始，以排除药物本身的CPE干扰，保证结果的正确性、可靠性。
(2)药物对RSV-Long株的抑制作用将一枝蒿有效部位酮酸和黄酮及阳性对照药分别作连续2倍系列稀释后，与100TCID50RSV-Long株进行抑病毒试验，计算药物的抑病毒百分率及半数有效量IC50，结果见表3。由表3可见，一枝蒿有效部位酮酸和黄酮的IC50介于阳性对照药之间，其体外抗RSV-Long株的效果较病毒唑差。
(3)TI值大小经计算3种药物的TI结果见表4。TI值愈大，表明药物的安全范围愈大，可见一枝蒿酮酸的安全范围大于一枝蒿黄铜，小于病毒唑。
表2 药物对HeLa细胞的毒性作用(mg/L)
表3 药物对RSV-Long株的IC50(±s，mg/L)
表4 药物的治疗指数TI(±s)
讨论 呼吸道感染是一种常见病、多发病，临床表现多种多样，其病原相当复杂。但呼吸道感染中90％以上是由呼吸道病毒引起，如RSV、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)等等。目前对病毒性疾病尚缺乏有效的防治措施，特别是对易产生变异的病毒如RSV、IFV等。实践一枝蒿有效部位酮酸和黄酮，对呼吸道病毒引起的上呼吸道疾病有显著疗效。
从抗病毒试验结果表明，一枝蒿有效部位酮酸和黄酮对于副流感病毒的抑制作用同病毒唑相近，一枝蒿酮酸抑制呼吸道合胞病毒作用的半数有效量(IC50)为33.15±8.12mg/L，与一枝蒿黄酮和病毒唑相比，小于一枝蒿黄酮而大于病毒唑；并且一枝蒿酮酸的安全范围大于一枝蒿黄酮而小于病毒唑，其中一枝蒿酮酸的抗PIV和RSV效果优于一枝蒿黄酮和病毒唑。
权利要求
1.一枝蒿有效部位酮酸和黄酮在制备抗呼吸道病毒的药物用途。
全文摘要
本发明公开了一枝蒿有效部位酮酸和黄酮在制备抗呼吸道病毒的药物用途。
文档编号A61P31/00GK1754552SQ200410084850
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月28日 优先权日2004年9月28日
发明者斯拉甫·艾白, 哈木拉提·吾甫尔 申请人:斯拉甫·艾白