抗Smad7的反义寡核苷酸(ODN)及其在医药领域中的用途的制作方法

专利名称：抗Smad7的反义寡核苷酸(ODN)及其在医药领域中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗Smad7的反义寡核苷酸(ODN)及其在医药领域中的用途。
本发明特别涉及适当修饰的Smad7反义ODN序列，该序列显示令人吃惊的特异性抑制Smad7表达的生物学活性，因此可作为生物治疗剂用于医药领域，特别是用于治疗慢性炎性肠病(IBD)。
克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是人的慢性炎性肠病的主要形式。两种疾病均是复合临床实体，其发病机理严格依赖于不同的遗传、环境和免疫因子之间的相互作用。
尽管CD和UC在病理生理学和临床水平上显示明显差异，对患者的治疗方法却共有许多共同的要素。即使药理治疗是首选方法，临床表现、损害的类型和扩展与并发症类型的易变性影响治疗方法的选择。
水扬酰偶氮磺胺吡啶和5-氨基水扬酸是已证明在治疗温和型IBD和缓解维持疗法中有效的药物。
在具有中等到严重活性的阶段和在与普遍状态有关的情况下，需要使用皮质类固醇。从主要的世界性病史的中长期分析可看出仅三分之二接受皮质类固醇的患者可获得临床缓解，停药后仅50％的患者未发生任何复发。
皮质类固醇的连续给药除诱导药物依赖现象外，还会由于副作用的高危险性而使情况更糟。
同样，经常伴随或取代皮质类固醇治疗的免疫抑制治疗不能总是确保遏制炎症和控制症状，并且还具有多种禁忌症和严重副作用的缺点(Podolsky，2002)。
二十世纪九十年代可获得的新一代药物是生物制剂。更彻底的了解IBD的自然历史和主要病理生理学机制有助于以具体方式控制医学干预。从而产生了旨在控制特殊的炎症“途径”通过使用重组人蛋白质、单克隆嵌合人源化抗体和融合蛋白的生物疗法。文中，在治疗CD中显示出较好效力的药物是直接阻断TNF-α的单克隆嵌合抗体，TNF-α是在IBD过程中超量产生的促炎细胞因子(Seegers等，2002)。目前处于临床试验IV期的该化合物在约60-70％的治疗的患者中有效地遏制炎症。然而，相当大的发病率和可看出潜在微生物感染的复活、过敏现象和形成自身抗体已指出该化合物有一些副作用。后一个现象可能是基于抗TNF-α的化合物使得具有多种生物功能的细胞因子TNF-α失效的事实。
除了炎性作用，TNF-α也参与诱导和维持免疫耐受性的机制。因此，阻断TNF-α活性反常地促进过量的免疫反应(Sandborn等，2002)。
所有这些评论说明需要在IBD的动物模型上进行新的研究，通过这些研究可能鉴定用于更好且经久的治疗这种病症的新的活性成分(Fiocchi，2001)。
就其它的生物疗法而言，抗TNF-α治疗，如施用抗炎性细胞因子(例如IL-10)代表目的在于控制炎性细胞分泌分子的生物效应的治疗性胞外方法。
对细胞因子与其受体相互作用激活的信号-转导途径的研究概括描述了使用能特异性和选择性地调节重要的炎性和非炎性分子胞内表达的新治疗性策略的可能性。
在正常条件下，肠粘膜是“生理”炎性渗透的部位，其在促炎性和抗炎性分子之间维持脆弱的平衡。
能调节生长、分化和许多免疫和非免疫细胞活性的多功能细胞因子TGF-β1在与上述有关的情况中扮演了重要角色。
体外和体内的研究证明TGF-β1是能控制肠粘膜发炎的强的免疫调节剂，并且抑制其活性导致发生与CD或UC免疫形态类似的结肠炎(Powrie F.等，1996；Neurath M.F.等，1996；Ludviksson B.R.等，1997)。
事实上，TGF-β1基因缺乏的小鼠表现出严重的多病灶炎性反应(也包括肠)与由多种类型细胞(包括T细胞)产生过量的炎性细胞因子有关(Shull M.M.等，1992；Christ M.等，1994)。
类似地，通过表达TGF-β1受体RII的显性负突变体形式抑制小鼠中TGF-β1信号提高了发生实验性结肠炎的敏感性(Hahm K.B.等，2001)。
最后，通过表达显性负TGF-β受体II型特异性抑制T细胞中TGF-β1信号导致肺部和结肠中严重的炎性浸润以及存在循环自身免疫抗体为特征的自身免疫疾病(Gorelik L.等，2000)。这些数据表明单个抗炎性分子活性的丧失足够改变肠稳态并发生能导致组织损伤的免疫应答。
TGF-β1的抗炎性活性始于该分子与异源二聚体跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合物的相互作用，该复合物由两个亚基组成，分别命名为TGF-β1 R1和TGF-β1 R2。TGF-β1结合时，受体在上述复合物内相对旋转，导致反式磷酸化过程，然后通过结构活性的TGF-β1 R2激活TGF-β1 R1并能自磷酸化。
由属于Smad族的蛋白介导TGF-β1激发的信号传播至核。激活的TGF-β1 R1直接磷酸化Smad2和Smad3蛋白，使得这两个蛋白可与Smad4相互作用，从而使Smad2-3/Smad4复合物移位至核，在那里复合物参与一些基因的转录控制(HeldinC-H.等，1997)。
动物模型的研究支持了Smad在TGF-β1抗炎性活性中的作用，这些研究表明Smad3编码基因的缺失与细胞对TGF-β1应答性降低和相关炎性疾病的发生有关，这些疾病的特征在于胃肠道水平大量浸润T-细胞和形成化脓性脓肿(Yang X.等，1999)。
其它的胞内蛋白，例如Smad7也属于Smad蛋白族。这种占据TGF-β1R1的蛋白干扰Smad2/Smad3与受体的结合，从而阻止了磷酸化和激活。因此Smad7蛋白表达增加与TGF-β1介导的信号抑制有关(Hayashi H.等，1997)。
对IBD患者肠粘膜中的TGF-β1表达的评估显示与普通患者肠中证实的相比所述分子的产量反而增加了(Lawrance IC.等，2001)。
本发明人在近期的文章中表明IBD患者的粘膜样品以高水平的Smad7和降低水平的活性Smad3为特征，从而说明在IBD期间，TGF-β1介导的信号机制受到损害。本发明人还说明用特异性反义寡核苷酸5′-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3′(SEQ ID No 1)选择性抵消Smad7可恢复固有层单核细胞(LPMC)对TGF-β1的应答性，导致促炎性细胞因子(例如TNF-α)的产量下调。
此外，在IBD患者的肠粘膜样品中进行的先体外后体内实验显示施用Smad7反义ODN可恢复TGF-β1信号机制并降低细胞因子的产量(Monteleone.等，2001)。
在IBD期间，肠粘膜浸润了大量的T-细胞。这些细胞被认为是作用在这种疾病中的组织损伤的主要介体。
IBD患者的肠粘膜中T细胞数量的增加部分依赖于这种细胞抗诱导其死亡(细胞凋亡)的刺激的耐受性。
据信，阻断T细胞凋亡在维持IBD的粘膜炎性应答中起关键作用(Boirivant.等，1999)。实际上，T细胞死亡的增加与肠炎症的消退有关。IBD期间T细胞抗细胞凋亡的耐受性的确切机制仍不清楚，即使似乎涉及局部释放的细胞因子。
体外细胞培养实验和体内研究的数据表明TGF-β1可阻止或激活T细胞死亡并且该因子介导两种应答的能力是位点特异的(Han SH.等，1998；Arsura M.等，1996)。
Smad3敲除的小鼠在肠水平表现出炎性细胞数目大量增加，从而提示TGF-β1在肠水平控制肠T细胞凋亡中的作用(Yang等，1999)。
因此，使用合成的Smad7反义ODN抑制Smad7可代表一种新颖和可接受的“内源性”生物治疗慢性炎性疾病的方法，因为如上所述它恢复了T细胞对TGF-β1的应答性，所以该方法尤其针对IBD。
反义寡核苷酸(ODN)是与编码特异和定向抑制的靶蛋白的信使RNA(mRNA)互补的短合成寡核苷酸序列。这种与mRNA杂交的序列产生了双链杂交特性并激活普遍存在的催化酶，例如RNA酶H，这种酶降解实质上产生激活DNA复制的DNA/RNA杂交链，从而阻止蛋白的翻译。
即使与转录起始区域5’和剪接区域互补的ODN通常会导致更有效的结果，选择与ODN杂交的最合适的mRNA区域和序列是需要经验的。由于近来该领域专门化的公司拥有先进的自动合成技术，在鉴定可能的靶部位后，设计大量的反义ODN不会产生困难。
相反，对可能的治疗应用而鉴定更具活性的ODN需要长期的筛选工作，该工作通过定量测试中测定效力。与上述相关的针对Smad7中的特定靶位的反义ODN序列是已知的(美国专利号6,159,697；受让人ISIS制药有限公司)。
由于这些分子的聚阴离子和亲水性特征以及酶的快速降解作用，一些问题阻碍了使用反义ODN在体外和体内进行基因调控，例如难于穿过细胞膜。
为克服这些障碍，需要借助反义ODN的化学修饰，例如在上述Smad7特异序列的情况中磷酸硫代化(Monteleone.等，2001)，或磷酸酰胺化，即以硫或氮原子取代那些磷酸二酯键中非桥原子的氧原子。
与许多生物技术产品一样，生物活性的证明指出了潜在的治疗活性。
实际上，ODN可用在与不同疾病的发病机制有关的基因和蛋白质功能研究或用于治疗性目的。尽管在前一个应用领域中反义方法对于指导原则的容易是成功的，但由体外转向体内实验更复杂，特别是关于这些新药的药代动力学、药效学和毒理学方面(Maggi A.等，1998)。
例如，本发明人以前进行的体外生物学活性实验中使用的Smad7反义ODN(SEQ ID No 1)在体内显示出不期望效应增加的危险。事实上，这种ODN含有两个核苷酸CG对在磷酸硫代化后变为CpG，这是提高ODN稳定性的基本方法。后者是具有免疫系统强有力的刺激活性的序列，因此使用上述这种ODN会恶化任何免疫疾病的进程，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。
不能假定类似的治疗方法，特别是在克罗恩病的情况下，这是在白介素12刺激下由命名为Th1的特定类T淋巴细胞介导的病理学。实际上作为强有力的IL-12合成的诱导物，CpG分子能进一步诱导Th1细胞的发展。
此外，含有CpG二核苷酸的反义ODN体内给药与不含CpG的寡核苷酸相比副作用的危险增加了。特别是已证实脾、肾和肝的网状内皮组织系统增生的危险增加，以及造血细胞增殖的增加(Agrawal S.等，2002)。
由于ODN的5’和3’端未保护颇易受核酶攻击，使用ODN的另一个问题是来自该分子降解的代谢物的作用必然会导致副作用。
因此需要对硫代磷酸反义ODN骨架的CpG配对和5’与3’端进行化学修饰。然而，修饰上述的ODN序列可能降低或丧失抑制Smad7合成的生物活性，并且有时甚至会逆转体内和体外的所需活性。
同样，处理适合于体内研究的实验性IBD模型是重要的，该模型可扩大涉及免疫应答调控丧失的机制和这些机制在IBD发作病理学中的作用的知识，以及调节或阻止这种应答的可能性，从而限制在粘膜水平的炎症进程。与上述有关的TNBS介导的结肠炎代表了广泛而有效的粘膜炎症模型，该模型与人CD显示出惊人的免疫形态学相似性(Neurath M.等，2000)。
由于上述原因，需要使用通过“内源性”生物治疗方法治疗IBD的、在体内外均有活性的新治疗性生物制剂，如Smad7反义ODN。
本发明人现在发现适当修饰的反义ODN序列，与其体外抑制活性相比它们在IBD实验性模型中表现出较高的抑制Smad7表达的体内生物活性，并且还高于其它已知的显示相同修饰和在相同模型上测试的序列的活性。
特别是，体内表现出较高生物活性的ODN序列是按照靶向人Smad7 RNA的位点403的硫代磷酸反义ODN序列(SEQ ID NO 1)设计的，这是在本发明人以前的实验过程中使用的。
由于这种Smad7硫代磷酸反义ODN在治疗人类疾病中潜在和将来的用途，所述序列在其中含有的CpG二核苷酸处(因为它们已述及的致免疫性)进行修饰，以下称为XY。
本发明人进行的研究测试了各种已知和新颖的Smad7反义ODN的体内与体外效力以及可能的毒性，并检测了阻断Smad7表达是否导致IBD实验性模型中粘膜炎症的消退。
尽管在相同的研究过程中其它序列施用后动物中发生副作用，上述本发明的适当修饰的反义ODN序列除了具有较高的体内生物活性外，还表现出意外的无副作用。此外，本发明的ODN序列表现出限制淋巴细胞浸润和以后的炎症传播的功效，这是其它反义ODN序列在本文测试中未发现的证据。
实验性模型中的这些研究和对其抑制的可能的疗效可明显看出Smad7作为生物靶的作用。
此外，本发明还发现了Smad7在IBD过程中诱导T细胞凋亡的作用。事实上，通过使用一些Smad7反义ODN已显示TGF-β1调控肠T细胞凋亡并且缺损因子活性是导致细胞对凋亡刺激的耐受性的原因，这些刺激负责维持粘膜炎性应答。
因此，本发明的目的是长度为21个核苷酸的Smad7硫代磷酸化的反义寡核苷酸，该寡核苷酸含有至少10个核苷酸的部分具有以下序列(SEQ ID No 2)5’-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’，其中X是含有选自胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2’-O-甲基胞嘧啶的含氮碱基的核苷酸并且Y是含有选自鸟嘌呤、5-甲基鸟嘌呤和2’-O-甲基鸟嘌呤的含氮碱基的核苷酸，只要核苷酸X或Y中至少一个含有甲基化的含氮碱基或其互补序列。
本发明其它的目的是各种反义寡核苷酸立体异构体的寡核苷酸序列，例如非对映异构体和对映异构体，这些立体异构体是对于序列中所包括的核苷酸间连键的磷原子而言的。实际上，核苷酸间连键可是硫代磷酸酯或甲基磷酸酯并且在两种情况下与四个不同的化学基团结合的磷代表一个手性中心。
本发明的反义寡核苷酸可在序列中具有至少一个甲基磷酸酯核苷酸，其位于，例如仅在5’或3’端之一或5’和3’端，或沿着寡核苷酸序列。
在优选的实施方案中，甲基磷酸酯核苷酸可是X或Y，在这种方式中核苷酸间连键是在所述核苷酸之间的键。
在5’和3’端和/或沿着反义ODN的核苷酸序列可进行其它的修饰以增加分子稳定性从而阻止核酶的降解并减少从代谢物的作用产生不良效应的危险。
本发明的反义寡核苷酸还可在序列中具有至少一个2’-O-甲基核糖核苷酸5’-单磷酸酯，例如其仅位于5’或3’端之一或5’和3’端，或沿着寡核苷酸序列。
本发明其它的目的是以上所述的反义寡核苷酸，其中2’-脱氧核糖核苷酸为核糖核苷酸所取代而2’-脱氧胸苷为尿苷所取代，以此方式将反义脱氧核糖核苷酸序列转为对应的反义核糖核苷酸序列。
本发明优选的实施方案是具有以下序列(SEQ ID No 3)的反义寡核苷酸5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯。
另一个优选的实施方案是具有以下序列(SEQ ID No 4)的反义寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯，Z是2’-脱氧鸟苷甲基磷酸酯。
按照另一方面，本发明的优选实施方案是具有以下序列(SEQ IDNo 15)的反义寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3’，其中X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯，Z是2’-脱氧鸟苷甲基磷酸酯。
本发明的反义ODN可有利地用于医药领域；因此本发明的其它目的是含有至少一种上述的反义寡核苷酸作为活性成分以及一种或多种本领域技术人员已知的药学上可接受的佐剂和/或赋形剂的药物组合物。
本发明还涉及前述反义寡核苷酸序列在制备用于治疗与Smad7表达相关疾病的药物中的用途。特别与是这种Smad7表达相关疾病是IBD，例如CD和UC。
以下将按照优选的实施方案，特别是参考附图对本发明进行阐述性而非限制性的说明，其中

图1显示了用Smad7 ODN反义和有义5′-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3′(SEQ ID No 4)处理CD患者的粘膜样品40小时之后对肠T淋巴细胞数目的影响；图2显示了分析p-Smad2/Smad3复合物和总的Smad2/Smad3复合物在LPMC中的表达，LPMC分离自TNBS处理的小鼠(TNBS)、未处理的小鼠(Unt)和作为对照的乙醇处理的小鼠(EtOH)的肠；图3显示了分析Smad7在LPMC中的表达，LPMC分离自TNBS处理的小鼠(TNBS)、未处理的小鼠(Unnt)和作为对照的乙醇处理的小鼠(EtOH)的肠；图4显示了患TNBS诱导结肠炎的小鼠的体重变化百分率，这些小鼠分别用Smad7反义寡核苷酸MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC(SEQ.IDNo 15)处理或不处理或用作为对照的(有义寡核苷酸)处理；该图代表三个独立的实验，其中每组研究了14只小鼠；图5是从患TNBS诱导结肠炎的小鼠和患TNBS诱导结肠炎并用Smad7反义寡核苷酸(SEQ.ID No 15)处理的小鼠中提取的结肠的肉眼可视图；该图代表三个独立的实验，其中每组研究了14只小鼠；图6是无结肠炎的小鼠和患TNBS诱导结肠炎并用Smad7反义寡核苷酸(SEQ.ID No 15)或用对照(有义寡核苷酸)处理的小鼠的结肠切片的组织学图；该图代表三个独立的实验，其中每组研究了14只小鼠。放大率40×。
实施例1本发明Smad7反义寡核苷酸对肠道T细胞凋亡作用的研究材料与方法反义ODN的合成所有Smad7反义ODN由MWG Biotech AG(MWG Biotech S.r.l.，Florence)采用标准氨基磷酸盐化学方案(Lesiak K.等，1993；Xiao W.等，1996)以标准自动技术使用自动DNA合成仪合成。
按照已知的合成方法(Sanghvi.等，1993)使用可市售的氨基磷酸盐合成含有5-甲基-2’-脱氧胞苷(5-Me-dC)的寡核苷酸，而含有甲基磷酸酯基团(MeP)的修饰的寡核苷酸用已知的方法合成(Maier MA.等，2002)。
用MWG Biotech开发的HPSF技术纯化寡核苷酸分子。由于这种纯化方法能去除标准经典纯化方法不能去除的自动化学合成过程中的失误序列(例如n-1、n-2和n-x序列)，所以具有高效率。
上述技术除了能得到100％的所需长度序列而无不需要的失效产物，还可避免下一个脱盐操作，因为纯化的序列不含有盐和金属离子。
假定不含任何盐，寡核苷酸最终按标准方法(Guerlavais T.等，2002；Ragas JA.等，2000)用MALDI-TOF质谱技术分析。然后寡核苷酸灭菌并用紫外/可见分光光度计将所得溶液定量为光密度(OD)。最后，在使用前这些分子重悬浮在无菌的PBS1×中。
所有使用的反义ODN以人和小鼠间具有100％同源性的Smad7mRNA为靶位。在下列所有寡核苷酸中，核苷酸间连键是硫代磷酸酯键。
用于本项研究的反义ODN序列按照以靶向人Smad7 mRNA的位点403的硫代磷酸酯反义ODN序列5’-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’(SEQ ID No 1)设计，该序列用于本发明人以前的实验过程中(Monteleone.等，2001)。
Smad7反义ODN序列5′-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3′(SEQ ID No 4)以人Smad7mRNA的位点403为靶位。这是一混合骨架的寡核苷酸，其中属于SEQ ID NO 1的CpG对的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(文中用Me-dC表示)。此外，甲基磷酸酯键位于分子的两端(文中以Mep表示)。
Smad7反义ODN序列5’-GTYTGGTCCTGAACATGC-3’(SEQ ID No 5)以人Smad7 mRNA的位点294为靶位。
粘膜样品取自6位中等到严重的CD患者和4位严重的UC患者的切除标本。此外，肠粘膜样品取自10位因结肠癌进行结肠切除术的未受影响的IBD患者(得到当地委员会的伦理批准)。LPMC用DTT-EDTA-胶原酶方法制备并重悬在补充有血清替换试剂HL-1(Biowhittaker，Wokingham，UK)的RPMI 1640(Sigma-AldrichS.r.l.，Milan)中。
在有和没有TGF-β1(Sigma-Aldrich，终浓度约为1到5ng/ml)中培养细胞并在接种48小时后分析凋亡的水平。
在其它实验中，分离自IBD患者肠的LPMC重悬浮在补充有HL-1的RPMI1640中并在有和没有上述Smad7反义ODN(SEQ ID No 4，SEQ ID No 5)以及有对照有义寡核苷酸(使用的浓度均是2μg/ml)中培养。24小时后，LPMC的等份用于抽提蛋白质并评估Smad7的表达。剩余的细胞彻底洗涤并重悬浮在加了HL-1的RPMI 1640中并在有或没有TGF-β1(5ng/ml)中培养48小时，然后分析细胞凋亡。
用流式细胞术分析细胞凋亡用碘化丙锭(PI)染色然后用流式细胞术分析细胞凋亡。
洗涤细胞，于37℃在5μl核糖核酸酶A(0.6μg/ml，30-60 Kunitz单位，Sigma-Aldrich)中温育15分钟，然后在并冰浴上冷却。在用流式细胞术分析之前加入碘化丙锭(100μg/ml)。
用特定的单克隆抗CD3抗体(DAKO Ltd.，Cambridgeshire，UK)鉴定T细胞。
蛋白质抽提和Western印迹分析匀质LPMC并在含有10mM Hepes(pH7.9)、10mM KCl、0.1mM EDTA和0.2mM EGTA的缓冲液A中抽提总蛋白。缓冲液补充有1mM二硫苏糖醇(DTT)、10μg/ml抑肽酶、10μ/ml亮肽素和1mM苯甲磺酰氟(所有的试剂均来自Sigma-Aldrich)。
使用特定的兔抗人Smad7抗体(终稀释度1∶400，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，CA；USA)分析Smad蛋白。偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体(Dako Ltd)以终稀释度1∶20,000用于测定一抗结合，免疫反应性用化学发光试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)目测。
器官培养取自患者的外科标本的粘膜移植物在有或没有Smad7反义ODN(SEQ ID No4，SEQ ID No 5；以终浓度10μg/ml使用)培养40小时。
培养在有Smad7有义ODN中的粘膜移植物作为负对照。
在培养末期收集粘膜移植物并用于通过免疫组织化学分析固有层T淋巴细胞的数目。
对于此目的，制备粘膜切片并用单克隆抗CD3抗体(DAKO)染色。偶联于碱性磷酸酶的山羊抗鼠抗体(DAKO)用于测定一抗结合。
结果在不同实验中得到的结果显示了TGF-β1如何以剂量依赖方式提高分离自正常受试者肠道的T淋巴细胞的凋亡。
表1显示了培养48小时之后凋亡的T淋巴细胞的百分率。数字是4个独立实验的结果，其中使用分离自4位正常受试者肠的T细胞。
表1
表2显示了培养48小时后凋亡T淋巴细胞的百分率。相反，如表2的重复结果所示，分离自4位IBD患者的T淋巴细胞显示出对TGF-β1诱导的凋亡信号的部分耐受性。
Table 2
特别是，当IBD患者的T细胞在有0.2ng/ml或1ng/ml浓度的TGF-β1中培养时，表2的数据分析未见凋亡有意义的增加。相反，以5ng/ml的TGF-β1刺激IBD患者的T细胞导致凋亡少量增加。
如表3重复的T淋巴细胞百分率值所示，用Smad7反义ODN SEQ ID NO4处理分离自IBD患者的T淋巴细胞恢复了细胞对TGF-β1的应答性，导致细胞凋亡增加。数据涉及T细胞分离自4位IBD患者肠的4个独立的实验，T细胞单独用培养基(未刺激)培养或用培养基和有义(对照)或反义寡核苷酸预处理过夜，然后用TGF-β1(1ng/ml)刺激。
Table 3
此外，如图1的免疫组织化学所示，本发明人用先体外后体内器官培养证明用本发明Smad7反义ODN处理IBD活组织检查显著降低了粘膜CD3+T细胞的数量。后者表现出用反义ODN处理降低了粘膜CD3+T细胞的数量。
结合这些观察提示高Smad7水平在延长T细存活中起至关重要的作用，从而有助于IBD患者中局部炎症的传播。
因此，阻断Smad7是控制这些疾病中粘膜炎症的有希望的方法。
实施例2在TNBS-诱导的结肠炎实验性模型中施用Smad7反义和有义寡核苷酸的体内和体外作用的研究材料与方法采用前述的标准技术由MWG Biotech S.r.l.(Firenze)合成所有的Smad7反义和有义ODN。
使用的反义ODN以在人和鼠之间具有100％同源性的Smad7mRNA位点为靶位。在以下所有寡核苷酸中，核苷酸间连键是硫代磷酸酯键。以下所有序列用于实验性诱导结肠炎模型上进行实验。
Smad7反义ODN SEQ ID No 1(5’-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’)以人Smad7 mRNA的位点403为靶位，本发明人在公布于以前文章的实验过程中已经使用(Monteleone等，2001)。
以下反义寡核苷酸序列SEQ ID No 4和SEQ ID No 5用于进一步研究Smad7在调节分离自IBD患者肠的LPMC中的T细胞凋亡中的作用。
Smad7反义ODN序列5′-MePGTMe-dCGCCCCTICTCCCMe-dCGCAMePG-3′(SEQ ID No 4)以人Smad7mRNA的位点403为靶位。这是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 1的3位和16位的CpG对的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶(以Me-dC表示)取代。此外，甲基膦酸酯键位于该分子的末端(以MeP表示)。
Smad7反义ODN序列5’-GTTTGGTCCTGAACATGC-3’(SEQ ID No 5)以人Smad7 mKNA的位点294为靶位。包括于其中的核苷酸间连键是硫代磷酸酯键。
Smad7反义ODN序列5’-GTTTGGTCCTGAACAT-3’(SEQ ID No 6)以人Smad7 mRNA的位点296为靶位。
Smad7反义ODN序列5’-GTITGGTCCTGAACATG-3’(SEQ ID No 7)以人Smad7 mRNA的位点295为靶位。
Smad7反义ODN序列5’-AGCACCGAGTGCGTGAGC-3’(SEQ ID No 8)以人Smad7 mRNA的位点577为靶位。
Smad7反义ODN序列5′-MePAGCACMedCGAGTGMedCGTGAGCMeP-3′(SEQ ID No 9)以人Smad7mRNA的位点577为靶位。这是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 86位和12位的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代。此外，甲基膦酸酯键位于该分子的末端。
Smad7反义ODN序列5’-CGAACATGACCTCCGCAC(SEQ ID No 10)以人Smad7 mRNA的位点233为靶位。
Smad7反义ODN序列5′-Me-d CGA ACA TGA CCT CMe-d CG CAC-3′(SEQID No 11)以人Smad7 mRNA的位点233为靶位。这是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 10的1位和14位的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代。
Smad7反义ODN序列5′-GTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAG-3′(SEQ IDNo 12)以人Smad7 mRNA的位点403为靶位。这是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 1的3位和16位的CpG对的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(以Me-dC表示)。
Smad7反义ODN序列5’-GATCGITTGGTCCTGAA-3’(SEQ ID No 13)以人Smad7 mRNA的位点299为靶位。
Smad7反义ODN序列5’-ATCGTITGGTCCTGAAC-3’(SEQ ID No 14)以人Smad7 mRNA的位点298为靶位。
Smad7反义ODN序列MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC(SEQ ID No 15)以人Smad7 mRNA的位点403为靶位。这是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 1的3位和16位的CpG对的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(以Me-dC表示)。此外，甲基膦酸酯键位于该寡核苷酸末端之一端和20位的鸟嘌呤残基处。
结肠炎的诱导5至6周龄的雄性SJL/J小鼠供养在特定无病原体的动物设施中。对于结肠炎的诱导，通过3.5F导尿管向轻微麻醉的小鼠施加每直肠2.5mgTNBS(pH1.5-2.0；Sigma Aldrich)的50％乙醇溶液。导尿管尖插入邻近肛门边缘约4cm，然后将100ml液体(TNBS/乙醇)缓慢注入结肠。
为保证TNBS分布于整个结肠和盲肠，小鼠在注射后保持直立姿势30秒。用相同方法向一些小鼠单独施加50％乙醇用作对照。
结肠炎的组织学评价在指定时间处死小鼠，分离出的组织固定于10％福尔马林溶液(Sigma Aldrich)，埋植于石蜡中，切成组织切片并用苏木精和曙红染色。使用各种标准检查染色切片的结肠炎证据，所用的标准例如存在淋巴细胞浸润、腺管的伸长和/或畸变、肠壁的侧翼溃疡和增厚。
在结肠的显微截面上炎症的程度按以下0到4分级0无炎症的证据；1在＜10％高倍视野(hp＝高倍视野)中观察到低水平淋巴细胞浸润，未观察到结构变化；2在＜10-25％hpf中观察到中等淋巴细胞浸润、腺管伸长和未伸出超过粘膜层的肠壁增厚；3在＜25-50％hpf中观察到高水平淋巴细胞浸润、伸出超过粘膜层的肠壁增厚；4在＜25-50％hpf中观察到明显程度的淋巴细胞浸润、高脉管密度、腺管伸长和畸变与具有溃疡的透壁性肠壁增厚。
分离固有层单核细胞(LPMC)和用Smad7反义ODN处理细胞固有层单核细胞(LPMC)分离自结肠样本。样本首先以无钙镁的HBSS(Hanks’平衡盐溶液，Sigma-Aldrich)洗涤并切成0.5cm小片。这些小片于37℃在含有EDTA(0.37mg/ml)和二硫苏糖醇(0.145mg/ml)的HBSS中孵育两次各15分钟。然后这些组织在含有胶原酶D(400U/ml，Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)和DNA酶I(0.01mg/ml，Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)的RPMI中消化，于37℃在振荡培养箱培养。
释放自组织的LPMC重悬浮于100％Percoll，在40％Percoll梯度(PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden)下分层并以1,800rpm离心30分钟得到富集淋巴细胞群。
为评价Smad7反义ODN的体外效力，分离自TNBS处理小鼠的LPMC以1×106/ml的终浓度在24孔板上重悬浮于补充有血清取代试剂HL-1(Biowhittaker)的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)中。为转染反义ODN，该步骤后每ml细胞培养基使用2μl的lipofectamine 2000试剂(LF，Invitrogen Italia SRL，San Giuliano Milanese)。然后，结合2μg/ml的反义ODN与LF并于室温孵育20分钟。然后将得到的混合物直接加入细胞。培养过夜后，细胞从板上移去并用于以Western印迹分析Smad7。
用Smad7反义ODN处理小鼠用TNBS处理两天后，按每直肠150μg将Smad7反义或有义寡核苷酸施用于小鼠。至少五只小鼠一组进行检查。在第五天处死小鼠，取出完整的肠粘膜样品并用Western印迹分析Smad7和Smad3含量。此外评价了肠粘膜炎症的程度。
蛋白质抽提和Western印迹分析固有层单核细胞和完整的结肠样本用上述方法匀浆化。然后用Western印迹展示Smad7表达。
最终，印迹用可市售溶液(Pierce)剥离并用抗肌动蛋白抗体(Sigma-Aldrich)检测以证实在每孔中充满有相同量的蛋白质。使用化学发光试剂盒(Pierce)进行检测。带的强度用光密度计分析。
LPMC和完整的结肠样品蛋白质也用特异性的可市售抗体(Santa Cruz)以Western印迹分析了磷酸化蛋白质和Smad3总蛋白质的含量。
为分析磷酸化的Smad3，使用能识别作为抗原的磷酸化Smad2/3蛋白质的特异性兔抗人抗体(1∶500终稀释度)和偶联于辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体(1∶20000稀释度)。免疫反应性用化学发光试剂盒(Pierce)目测。
检测之后，印迹用可市售溶液(Pierce)剥离并与特异性的山羊抗人Smad3抗体(1∶500终稀释度)和偶联于辣根过氧化物酶的兔抗山羊抗体(1∶20000稀释度)孵育；然后用上述的化学发光试剂盒(Pierce)目测免疫反应性。
FLISA测试活性TGF-β1的量在肠粘膜样品中检测。为此目的，抽提如上所述有或没有TNBS诱导结肠炎的小鼠粘膜样品的总蛋白质。使用可市售的ELISA试剂盒(R&DSystems，Space Import-Export Srl，Milano)分析活性TGF-β1的水平。在DynatechMR 5000ELISA读数器上测量490nm波长处的光密度。数据以pg/100g总蛋白质表示。
结果在接受TNBS后，小鼠出现腹泻和体重降低等诱导结肠炎的证据。肉眼可见结肠增大并且对其粘膜的组织学分析显示中等到严重的炎性病变。
为检测TNBS结肠炎的诱导是否与TGF-β1的产量变化有关，从有或没有结肠炎的小鼠取得结肠样本并用ELISA分析活性TGF-β1的含量。
因为在肠道水平存在几种具有合成TGF-β1潜力的细胞类型，它可用于评价整个肠道粘膜而非仅评价LPMC。
在无结肠炎的情况中，检测到低水平的活性TGF-β1(未刺激和对照小鼠各为85±12和94±26pg/g总蛋白质)。在患TNBS诱导结肠炎小鼠的粘膜样品中检测到TGF-β1水平显著(985±120pg/g总蛋白质)(p＜0.01)。即使该结果似乎提示在TNBS诱导结肠炎期间可增加TGF-β1的活性，但对分离自患结肠炎小鼠的肠LPMC中活性Smad3的胞内水平的分析令人吃惊地表现出降低的Smad3磷酸化作用，该磷酸化作用与Smad7的诱导量增加相关(图2和3)。特别是图2说明了在分离自未受影响肠而非患TNBS诱导的结肠炎小鼠的LPMC中存在对应于活性(磷酸化)Smad2/3的带。图3显示仅在分离自患TNBS诱导结肠炎小鼠的肠的LPMC样本中存在两条带，较低的47Kda的带对应于游离Smad7而较高102Kda的带对应于TGF-β1 R1-Smad7复合物。这些数据说明局部炎症刺激了TGF-β1的合成，但TGF-β1未能减弱粘膜炎症。
本发明评价了用Smad7反义ODN治疗TNBS小鼠是否可恢复内源性TGF-β1功能并限制正在进行中的炎症。
首先，测试上述Smad7反义ODN(SEQ ID No 1和SEQ ID No 4-15)在体外和体内实验中降低Smad7表达的效力。
关于体外实验，分离自患TNBS诱导结肠炎的小鼠的肠的LPMC用各种Smad7反义ODN转染并孵育过夜。用Western印迹分析Smad7。
关于体内实验，TNBS处理的小鼠施用Smad7反义ODN并在3天后处死小鼠，取出组织样本并用Western印迹分析Smad7。
表4总结了这些实验的结果并显示了各种Smad7反义寡核苷酸在体外和体内实验中所得的抑制百分率。数据表明4个独立的体外实验的平均±标准偏差(SEM)和5个独立的体内实验的平均±SEM。
表4
(*)和(**)分别是ISIS的专利US6159697的第16条序列和第12条序列。
当在分离自TNBS处理的鼠科模型的LPMC中体外转染时，所有反义ODN有效地降低Smad7表达。分析表4所示的抑制百分率值可明显发现反义寡核苷酸序列SEQ ID No 4、10、11、12和15显示主要的效力。
然而，用寡核苷酸序列SEQ ID No10和11体内处理得到的Smad7表达抑制百分率与体外实验所得的没有明显差别。
用反义ODNSEQ ID No4、12和15处理小鼠得到的Smad7抑制百分率明显大于体外试验所得结果，即分别为55％对34％、42％对32％、56％对34％(P＜0.01)。
相反，用反义寡核苷酸SEQ ID No7处理小鼠导致体内Smad7表达降低，其值低于体外反义寡核苷酸在LPMC中转染所得值，即10％对17％，P＜0.01。
总体而言，这些结果表明只有在Smad7反义ODN序列中进行特异性修饰能改善其药代动力学、生物化学和生物物理图谱。
在接受反义寡核苷酸(SEQ ID No 1和SEQ ID No 4-15)的小鼠中未证实有急性毒性迹象。1/5用TNBS处理的小鼠在3天后死亡(20％)。类似地，1/5接受Smad7有义寡核苷酸的小鼠在4天后死亡。
用Smad7反义ODN SEQ ID No1和SEQ ID No4-15处理的小鼠组中无死亡率。
反义序列SEQ ID No13和SEQ ID No14的用途与合理的体外抑制活性(分别为11％和9.5％)相关。然而，这种序列的体内施用出人意料地伴随着显著的结肠炎恶化，直至导致小鼠在治疗72小时后全部死亡。
肉眼分析取自这些小鼠的肠样品发现存在严重的结肠炎并且这与肠中Smad7表达本质上的增加相关。
如上所述，测试了Smad7反义ODN限制正在进行中的炎症的效力。对此目的，向诱导结肠炎后的小鼠施用反义寡核苷酸SEQ ID No1、4、5和15并将5只小鼠视为一组。
用Smad7反义ODN治疗后，发现粘膜炎症减轻。该结果在用反义寡核苷酸4和15治疗的小鼠中尤其明显。事实上，未接受反义寡核苷酸的患结肠炎小鼠在分别施用了反义寡核苷酸序列1或5后3-4级的结肠炎严重性达到2或3级，而用反义寡核苷酸序列4或15治疗的小鼠的炎症未超过1级。
未检测Smad7口服是否也有效，TNBS诱导结肠炎的小鼠在诱导结肠炎后一天用Smad7反义寡核苷酸4、5或15或对照(有义寡核苷酸)治疗。
对此目的，寡核苷酸重悬浮在碳酸氢盐溶液中。施用于每只小鼠的溶液的终体积为3501μl并且含有剂量等于250、500或1000μg的寡核苷酸，这种溶液通过导管口服给药。
在第5天处死小鼠，Smad7表达和炎症程度的分析按前文所方法评价。所有用反义寡核苷酸而不是用对照有义寡核苷酸治疗的小鼠表现出Smad7表达有意义的降低和Smad3磷酸化的增加，这些作用均不依赖于所使用的寡核苷酸剂量。
如图4所示，抑制Smad7基本上与体重恢复相关。图4显示了用或不用Smad7反义寡核苷酸(SEQ.No.15)或用对照(有义)治疗有TNBS诱导结肠炎小鼠的体重变化百分率。两种寡核苷酸在诱导结肠炎后第二天用导管以250μg剂量口服给药。第二天3组中每一组可证实体重减少表明TNBS处理诱导发生结肠炎。此外证实了从第四天开始用Smad7反义寡核苷酸而不是用对照治疗的小鼠表现出体重恢复。第五天患TNBS诱导结肠炎小鼠体重明显和轻微的恢复是因为21.4％患结肠炎小鼠在第四天死亡，因此第五天评价体重时未计入。
如图5和6所示，Smad7的抑制与组织炎症的显著抑制相关。图5显示了取自有TNBS诱导结肠炎的小鼠和用Smad7反义寡核苷酸(SEQ.ID.No.15)治疗有TNBS诱导结肠炎小鼠的结肠的图像。寡核苷酸在诱导结肠炎后的第二天以250μg剂量通过导管口服给药。有TNBS结肠炎的小鼠的结肠显示高度发炎、变短和增厚。相反，接受Smad7反义寡核苷酸的小鼠显示结肠长度与厚度正常且无肉眼可见的炎症迹象。图6显示没有结肠炎的小鼠或用或不用Smad7反义寡核苷酸(SEQ.ID.No.15)或对照(有义)治疗有TNBS诱导结肠炎的小鼠的结肠切片的组织学状况。两种寡核苷酸在诱导结肠炎后第二天通过导管以250μg剂量口服给药。已显示没有结肠炎的小鼠中腺体显现为直线且均匀，具有正常含量的含粘液的细胞和固有层的炎性成分。相反，在接受或未接受对照寡核苷酸的TNBS处理小鼠的结肠中，腺结构遭到完全破坏，含粘液的和大量的炎性细胞浸润在固有层中。证明在用TNBS处理并接受Smad7反义寡核苷酸的小鼠的结肠切片中存在正常的腺结构且无炎症。
反义ODN体内给药之后显示较高Smad7抑制效力且无副作用，结合这些观察提示，特别是如果将效力和毒性的这些性质与使用在Smad7体外抑制中具有相同效力的其它反义ODN序列所得的结果比较，表明使用反义ODN序列可代表一种控制IBD期间粘膜炎症的有希望的治疗方法。
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<221>modified_base<222>(20)..(20)<223>2’-脱氧鸟苷甲基膦酸酯<400>15ntngcccctt ctcccngcan c 2权利要求
1.抗Smad7的反义寡核苷酸硫代磷酸酯，其长度直至21个核苷酸并包含具有以下序列(SEQ.ID.No.2)或其互补序列的至少10个核苷酸的部分5’-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’其中X是含有选自胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2’-O-甲基胞嘧啶的含氮碱基的核苷酸，并且其中Y是含有选自鸟嘌呤、5-甲基鸟嘌呤和2’-O-甲基鸟嘌呤的含氮碱基的核苷酸，条件是核苷酸X或Y中至少一个含有甲基化的含氮碱基。
2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，该序列中至少一个核苷酸是甲基膦酸酯。
3.如权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述至少一个甲基膦酸酯核苷酸仅位于3’或5’端之一或位于3’和5’端或沿着反义寡核苷酸序列。
4.如权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述甲基膦酸酯核苷酸是Y。
5.如权利要求2所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述甲基膦酸酯核苷酸是X。
6.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，该序列中至少一个核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸5’-单磷酸酯。
7.如权利要求6所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述至少一个2’-O-甲基核糖核苷酸5’-单磷酸酯仅位于3’或5’端之一或位于3’和5’端或沿着反义寡核苷酸序列。
8.如上述权利要求中任一项所述的反义寡核苷酸，其特征在于，2’-脱氧核糖核苷酸被对应的核糖核苷酸取代。
9.如上述1到8项权利要求中任一项所述的含有以下序列(SEQ.ID.No.4)的反义寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’其中，X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯，并且Z是2’-脱氧鸟苷甲基磷酸酯。
10.如上述1到8项权利要求中任一项所述的具有以下序列(SEQ.ID.No.15)的反义寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3’其中，X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯，并且Z是2’-脱氧鸟苷甲基磷酸酯。
11.如权利要求1所述的具有以下序列(SEQ.ID.No.3)的反义寡核苷酸5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’其中，X是5-甲基2’-脱氧胞苷5’-单磷酸酯。
12.如权利要求1到11所定义的反义寡核苷酸用于医药领域。
13.一种或多种药学上可接受的佐剂和/或赋形剂的药物组合物，其特征在于，含有作为活性成分的至少一种如权利要求1到11所定义的反义寡核苷酸。
14.权利要求1到11所定义的反义寡核苷酸在制备治疗与Smad7的表达相关的病症的药物中的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述与Smad7表达相关的病症是慢性炎性疾病。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述慢性炎性疾病是克罗恩病和溃疡性结肠炎。
全文摘要
本发明涉及适当修饰的抗Smad7的反义寡核苷酸序列(ODN)及其作为治疗性生物制剂在医药领域中的用途，特别是用于治疗慢性炎性肠病，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎。
文档编号A61K48/00GK1788086SQ200480012344
公开日2006年6月14日 申请日期2004年3月8日 优先权日2003年4月2日
发明者G·蒙特里昂 申请人:吉利亚尼国际有限公司