在癌症治疗中用于抑制多药耐药性的靶向p－糖蛋白170的治疗性疫苗的制作方法

专利名称：在癌症治疗中用于抑制多药耐药性的靶向p－糖蛋白170的治疗性疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于这样的领域，即寻找和研制用于治疗某些患者在癌症治疗期间出现的多药耐药性(多效耐药性或者多药耐药性)的新试剂。
本发明特别描述了在癌症治疗过程中可用于诱导多药耐药性患者的免疫反应的试剂，其目标是降低、甚至是逆转这种抗性。本发明还涉及用于预防出现多药耐药性的这样的试剂。
就此而言，本发明涉及的组合物包含载体和由肽部分和含有C12-C24之间的碳链的脂肪酸分子通过共价键形成的缀合物，其中所述肽部分衍生自至少一个P-170蛋白的胞外环。在合适条件下服用所述免疫原性组合物，能诱导产生抗-P-170抗体。
本发明还涉及使用与药学上可接受的载体如脂质体联合的、基于缀合物的上述组合物进行免疫的方法。本发明特别涉及这样免疫的方法，即其实施是在对患者进行化疗治疗之前、与之同时或者在其之后。
最后，本发明涉及根据本发明的组合物在体内治疗癌症患者用抗癌药物进行治疗时出现的多药耐药性的用途，或者在适当的情况下，用于预防这样的多药耐药性。
背景技术：
在二十世纪七十年代末期，在赋予了针对化疗药物(特别是用于治疗癌症的药物)的抗性的癌细胞系上证明了多药耐药性(MDR)的现象。就用于治疗患者的化疗药物而言，当多效耐药性药物具有不同的结构和特性时，多药耐药性的特征在于多效耐药性。在能够选择或诱导癌细胞的多效耐药性的药物中，将要提及秋水仙碱、阿霉素、放射菌素、长春新碱、长春碱和米托蒽醌。从表型的角度来说，多药耐药性的特征是细胞毒药物在细胞内积累的减少、细胞的生理性修饰和P-糖蛋白[也称之为P-gp蛋白或P-170蛋白(Van der Bliek等1988.《基因》(Gene)71(2)401-411，Thiebaut等1987《美国国家科学院进展》(Proc.Natl.Acad.Sci.)84(21)7735-7738，Endicott等1989《生物化学年鉴》(Annu.Rev.Biochem.)58137-171)]在细胞膜中的过表达。P-170蛋白负责药物向细胞外的主动流动(也称为主动流出)，这种现象依赖于ATP的消耗。P-170蛋白对大量具有不同结构和功能的化合物的识别，以及P-170蛋白介导的所述化合物向治疗细胞外的排泄，依然是该蛋白功能中最神秘的方面之一。交叉抗性的药物之间不表现出共同结构特征，这使得无法预见不会在P-170蛋白的作用下排泄的药物的研发。
肿瘤对化疗剂的多药耐药性构成了医学癌症学的中心问题。虽然支持治疗在不断进步，但是药物抗性问题仍然是获得更好治愈率的障碍。应当指出肿瘤细胞在治疗开始时可能不会对化疗作出反应。这种从无到有的多药耐药性不幸地常见于多种类型的实体肿瘤中。此外，已有可能观察到显身在肿瘤之中的获得性抗性的现象，所述肿瘤最初对化疗应答，然而随后在或长或短的期限内发展成对治疗的抗性。
为了更加有效，抗癌治疗已经联合多药耐药性调节剂，也称为逆转剂，其可阻断P-170蛋白介导的药物向细胞外的外流，从而防止多药耐药性。已有的逆转剂如戊脉安、奎宁和环孢菌素，在使用抑制P-170蛋白流出活性所需的剂量时，会产生患者不能接受的毒性。例如，当以治病剂量同样也是毒性限制剂量服用戊脉安时，由于患者出现功能紊乱，如低血压、心率失常和充血性心力衰竭，它迅速地表现出其在癌症复发治疗中的局限性(Miller等1991.《临床肿瘤学杂志》(J Clin Oncol)9(1)17-24)。
更多新的类似物，比如右维拉帕米，PSC 833(环孢菌素衍生物)以及最新的Servier实验室的S9788已用于临床试验，其目标是克服多药耐药性。然而，这些新的逆转剂也具有与前一代逆转剂相当的使用局限性。事实上，用S9788(6-[4-[2，2-二-(4-氟苯基)乙氨基]-1-哌啶基]-N，N’-二-2-丙烯基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺)，一种三嗪氨基哌啶衍生物，治疗多药耐药性的试验继出现心脏毒性、室律不齐和尖端扭转性室速(torsade de pointe)的现象(Stupp等1998.Ann Oncol 9(11)1233-1242)后，表现出了该产品特有的使用局限性。因此，用新的和传统的逆转剂难以阻止多药耐药性现象，这是由于对化疗难治愈的患者来说，治疗剂量相当于毒性剂量的开始。
免疫治疗，特别是单克隆抗体的使用，也已经被预见用于治疗患者出现的多药耐药性。最初的试验是使用单克隆抗体MRK16抑制卵巢癌中肿瘤的形成(Tsuruo.1989.《癌症治疗研究》(Cancer Treat Res)481811-1816)。最近，Mechetner和Roninson已经更加彻底地研究了多药耐药性治疗中的单克隆免疫治疗(1992.《美国国家科学院进展》(Proc NatlAcad Sci USA)vol.89pp.5824-5828)。事实上，得到了抗人P-糖蛋白胞外表位的单克隆抗体UIC2，并在体外对抗癌剂有抗性的细胞系上进行了试验。结果表明，单克隆抗体UIC2的体外抑制效果可与使用最大临床剂量(3μM)的戊脉安的效果相当。抗-P-170单克隆抗体通过抑制P-170蛋白的腺苷三磷酸酶活性以及抑制药品与P-170蛋白的结合而发挥作用。
合适的免疫治疗以向患者注射单克隆抗体为基础，在消除肿瘤的残存抗性细胞的限度内可能具有某些优点。然而，由于缺乏抗体特异性、毒性、功效以及作用机制的知识，限制了该方法在克服因为P-170蛋白过表达而造成的多药耐药性中的应用。特别地，在单克隆免疫治疗中，还没有征服与抗鼠抗体免疫反应或抗兔抗体免疫反应相关的副作用以及与缺少人源化单克隆抗体相关的困难。
发明概述因此，本发明的目的是为已有的癌症多药耐药性的治疗提供一种备选方法，其目的是至少部分地弥补已知的多药耐药性治疗的缺点。就此而言，本发明提出了以诱导特异于P-糖蛋白(P-170蛋白)的多克隆自身抗体为基础的免疫治疗。这种免疫治疗是利用包含衍生自至少一个P-170蛋白胞外环的肽的缀合物诱导患者抗体的抗原能力实现的，其中所述肽以允许或促进其抗原能力的表达的形式呈递和给予患者，特别是当它们与药学上可接受的载体联合时。特别地，所述抗体是针对人P-170诱导的自身抗体。
因此，本发明特别涉及免疫原性组合物，其包含载体和作为抗原结构的缀合物，所述缀合物包含至少一个衍生自P-170蛋白胞外环的肽的全部或部分氨基酸序列，其中每个肽结合至少两分子的含C12-C24之间的碳链的脂肪酸，从而在合适的给药条件下能诱导抗-P-170抗体。
本发明的发明人已经令人惊奇和预料不到地证明，观察到用本发明所述的免疫原性组合物免疫的小鼠在接种癌细胞后，随后在化疗治疗的平台期，存活时间有77％的增加。
由于在相同癌症模型的多药耐药性的治疗中，已得到的最好公开结果是用其他物质治疗的小鼠的存活有49％的增加(Pierré等1992.《新药投资》(Invest New Drug).10137-148)。此外，Yang等(1999.BBRC.266167-173)已发现使用同样的细胞系，用长春新碱和环孢菌素A治疗的小鼠的存活仅有35％的增加。
附图简述本发明通过下面的附图阐释，然而并非限制

图1显示了对应于小鼠P-170蛋白胞外环片段的合成肽，每分子肽偶联四分子的棕榈酸(C16)。
图2图示了用于在固相支持物上合成肽的叔丁氧羰基/苄基策略。
图3P388R细胞免疫和注射小鼠后的化疗方案。
图4显示了作为免疫时间(第一次、第二次和第三次注射)函数的Lp2免疫小鼠的血清中的抗体滴度。定量抗-mpp1、mpp2和mpp4抗体，并分别用Ig(M、G3、G2a、G2b、G1)特异性抗-小鼠二抗检测不同同种型。每个柱形图代表一次免疫12天后取血的5只小鼠血清获得的平均值。一个单位相当于0.2μgIg/ml。
图5显示了作为免疫时间(第一次、第二次和第三次注射)函数的Lp4免疫小鼠的血清中的抗体滴度。定量抗-mpp1、mpp2和mpp4抗体，并用Ig(M、G3、G2a、G2b、G1)特异性抗-小鼠二抗分别检测不同同种型。每个柱形图代表一次免疫12天后取血的5只小鼠血清获得的平均值。一个单位相当于0.2μgIg/ml。
图6显示了作为免疫时间(第一次、第二次和第三次注射)函数的Lp3免疫小鼠的血清中的抗体滴度。定量抗-mpp1、mpp2和mpp4抗体，并用Ig(M、G3、G2a、G2b、G1)特异性抗-小鼠二抗分别检测不同同种型。每个柱形图代表一次免疫12天后取血的5只小鼠血清获得的平均值。一个单位相当于0.2μgIg/ml。
图7显示了作为免疫时间(第一次、第二次和第三次注射)函数的Lp1免疫小鼠的血清中的抗体滴度。定量抗mpp1、mpp2和mpp4抗体，并用Ig(M、G3、G2a、G2b、G1)特异性抗-小鼠二抗分别检测不同同种型。每个柱形图代表一次免疫12天后取血的5只小鼠血清达到的平均值。一个单位相当于0.2μgIg/ml。
图8Lp1和Lp2免疫小鼠的存活时间。在0时间接种106化学抗性P388R细胞。在第1、10和22天注射5.5mg/kg阿霉素，并在第4和14天注射2.5mg/kg长春碱。
发明的实施方案P-糖蛋白或者P-170蛋白是由Juliano和Ling(1976.《生物化学生物物理学学报》(Biochem Biophys Acta)455(1)152-162)鉴定的170kDa细胞膜结合的磷糖蛋白。鼠P-170蛋白由形成两个等同部分的1276个氨基酸组成。该分子的疏水结构域编号为第1至12位，并参与化疗药物的外流。业已选用鼠P-170蛋白胞外环1、2和4，这是因为其突出的胞外拓扑结构表明它们在本质上可能具有抗原性。在等同的方式上，人P-170蛋白(Chen等1986《细胞》(Cell).47(3)381-389)是由两个同源结构域组成的1280个氨基酸的蛋白，其中每个结构域包含6个跨膜螺旋区和1个核苷结合位点。这些跨膜区域的疏水区形成的胞外环被认为是自细胞外侧识别P-170蛋白的片段。由于其特别明显的胞外定位，因此还选用了具有高抗原能力的人P-170蛋白的胞外环1、4和6。
本发明上下文所用的免疫治疗作为癌症化疗的补充，从而使得化疗药物的治疗效果得以显现。
按照本发明上下文所述的常规含义，“癌”由两种主要的特点定义不受外部信号调控的细胞生长和增殖，以及侵入组织的能力，连同在适当的情况下通过移殖远位点形成转移的能力。
这些特征是癌细胞内在特性所致，即它们的核型和基因组的不稳定性、无控制的增殖、伴随新表型获取的转移能力以及所述癌细胞中原癌基因的激活和抑制所致。因此，术语“癌”在本发明上下文中应理解为是指具有上述特征的细胞生长或者增殖的任何阶段，其特别地逐渐朝着原发肿瘤和/或转移肿瘤(继发肿瘤)的形成发展。
此外，对本发明来说，术语“多药耐药性治疗”是指所有的试图抵制多药耐药性的治疗，从而限制其后果，以避免死亡，并且优选重建对抗癌药品的敏感性。就此而言，多药耐药性治疗的目标是通过诱导化疗敏感细胞表型的完全逆转而理想地指向多药耐药性的治愈。然而，这种逆转可能是部分的，因此多药耐药性的治疗将证明是减轻性的，使患者有延长的好转期。多药耐药性治疗的特征还在于利用它的预防疾病的能力，使预防患者体内从无到有的或者获得性的多药耐药性的出现成为可能。
因此本发明特别涉及免疫原性组合物，其包含载体和作为抗原结构的缀合物，所述缀合物包含至少一个衍生自P-170蛋白胞外环的肽的全部或部分氨基酸序列，其中每个肽结合至少两分子的含C12-C24之间的碳链的脂肪酸，从而在合适条件下给药时，能诱导抗-P-170抗体。
在本发明上下文中，所述的免疫原性组合物还能诱导用于逆转癌症患者体内产生的多药耐药性的抗P170抗体。
在优选实施方案中，缀合物包含P-170蛋白的至少两个胞外环、优选至少三个胞外环的全部或部分氨基酸序列。
根据本发明，术语“缀合物”是指含有C12-C24之间的碳链的脂肪酸分子与本发明所述的氨基酸序列通过共价键合形成的试剂，从而形成脂-肽混合分子。特别是通过固相合成得到的肽序列共价偶联到组成所述分子脂质区的脂肪酸分子上。
对本发明来说，术语来自P-170蛋白的“衍生肽”是指组成每个P-170蛋白胞外环的全部或部分氨基酸序列，只要所述的“衍生肽”具有至少一个其所衍生自的胞外环的表位。衍生自胞外环的肽最好具有5-50个之间的氨基酸残基，优选5-40个之间，或者10-30之间，最好有10-25个之间的残基。下面属于本发明的内容(1)其氨基酸序列与其所衍生自的胞外环的相应序列一致的肽，或者(2)其氨基酸序列是由其所衍生自的胞外环的序列修饰得到的肽，所述修饰有可能包括插入、缺失或取代、特别是保守取代一个或多个残基的点突变，只要如此形成的肽仍带有P-170蛋白的表位。特别地，可接受的突变是不会干扰本发明所述组合物中包含的修饰肽的构象的突变。这可通过当修饰肽配制成根据本发明的组合物时诱导抗体的能力得以证实。
本发明的肽优选通过化学合成得到，特别优选使用下文所述的方法。
在本发明上下文中，术语P-糖蛋白(或P-170蛋白)的“胞外环”是指每一种具有胞外拓扑结构或者与胞外环境具有重要连接的P-170蛋白的氨基酸序列，因此可作为携带该蛋白表位的序列加以选择。
组成本发明上下文使用的合成肽的氨基酸序列可以本身是抗原性的，或者当它们以这样的构象从而保留与之相应的该肽所衍生自的胞外环中氨基酸序列的构象呈递时或者当其以足够相似的构象从而赋予所形成的肽在合适条件下给药时诱导抗体产生的能力呈递时，表现出抗原性。诱导抗体产生的能力可以，例如，在用本发明上下文制备的肽免疫的小鼠中或通过其它已知手段得到证实。因而，本发明的肽最好在免疫原性组合物中具有这样的三维构象，从而它们复制该肽所衍生自的环的胞外部分的构象，或者从而类似于所述构象，以便赋予形成的组合物其免疫原性能力。所述肽合适的呈递最好由其与免疫原性组合物中其它组分的结合实现。
诱导抗体产生的能力特别地是在本发明的肽为经合成和修饰从而成为缀合物形式、与合适载体特别是脂质体联合的肽时获得的。
根据本发明的缀合物相应于所述免疫原性组合物中载体携带的抗原结构。在本发明上下文中，术语“抗原结构”是指能与抗体发生反应以便形成抗原/抗体复合物的分子。所述的免疫原性组合物的“抗原结构”可有或者可没有诱导与特异于给定抗原的抗体的形成相应的免疫原性现象的能力。
举例来说，这些缀合物包含的肽衍生自鼠P-170蛋白胞外环1(mpp1)以及胞外环2(mpp2)或4(mpp4)中至少一个，其特征在于它们合成后的序列、分子量和纯度按照下面表I所述的实验方案。
表I

通过质谱分析获得衍生自鼠P-170蛋白胞外环1、2和4的肽的计算的和观测的分子量，即-[M+H+]表示计算的分子量，-MALDI-TOF和PDMS-TOF表示测量的分子量，即基质辅助激光解析电离飞行时间(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization-Time of Flight)等离子体解析飞行时间质谱(Plasma Desorption Mass Spectrometry-Time of Flight)。
此外，还通过在110℃ 6N HCL/苯酚水解等份分析了氨基酸序列，以证实预期的和得到的氨基酸数目(预期的/得到的)mpp1，A(2/1.5)，D(5/4.4)，E(5/6.6)，F(I/0.6)，G(4/3.4)，I(4/3.6)，K(4/4.0)，L(3/3.5)，M(1/0.7)，P(2/1.8)，T(4/3.0)，S(8/7.4)。
mpp2，A(2/2.3)，D(1/1.2)，E(2/2.4)，F(1/1.0)，G(2/2.1)，K(6/6.0)，L(2/2.1)，S(1/0.9)，V(1/1.0)，Y(1/1.0)。
mpp4，D(5/5.0)，E(3/3.1)，G(2/2.0)，K(4/3.7)，S(1/0.9)，R(2/1.9)。
根据本发明一个特别有利的实施方案，缀合物包含的肽衍生自人P-170蛋白胞外环1(hpp1)(hpp人棕榈酰肽)以及胞外环4(hpp4)或6(hpp6)中至少一个。因此，所述缀合物的肽包含衍生自胞外环1(hpp1)和4或者胞外环1(hpp1)和6(hpp6)的氨基酸序列。
优选地，免疫原性组合物的缀合物包含衍生自人P-170蛋白的三个环1(hpp1)、4(hpp4)和6(hpp6)的肽。
鉴于P-170蛋白的环1的长度是47个氨基酸，衍生自该环的肽可由所述环1通过在糖基化位点裂解成产生3个片段获得。所述的3个衍生肽导致可合成下面的3个缀合物hpp1a、hpp1b和hpp1c。其它的肽可以是这三个肽的片段，其中含有一个或多个表位。从而，根据本发明的缀合物因此包含衍生自人P-170蛋白胞外环1的全部或者部分肽，其相应于由所述环1在糖基化位点裂解得到的三个肽。
缀合物的肽序列可用于制备本发明的特别是联合脂质体的免疫原性组合物。所述缀合物的肽分别选自下面的氨基酸序列-环1(SEQ ID NO 4)GEMTDIFANAGNLEDLLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYS-环1a(SEQ ID NO 5)GEMTDIFANAGNLEDLLMS-环1b(SEQ ID NO 6)NITNRSDINDTGFF-环1c(SEQ ID NO 7)MNLEEDMTRYAYYYS-环4(SEQ ID NO 8)FSRIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFS
-环4a(SEQ ID NO 9)FTRIDDPETKRQNSNLFS-环6(SEQ ID NO 10)FRFGAYLVAHKLMSFED和/或它们的组合。
对于胞外环1，最好是在同一组合物中使用三个肽1a、1b和1c。或者，使用1a和1b、1a和1c、或者1b和1c。
表II概括了相应于人P-170蛋白胞外环1、4和6的缀合物的氨基酸序列。相应于衍生肽序列的氨基酸序列是大字母，相应于与脂肪酸分子偶联的添加的氨基酸是小字母。
表II中所述肽的序列、分子量和纯度可通过上述用于表I中的肽的技术来控制。
衍生自胞外环的肽在合成后用HPLC层析纯化，最好具有等于或大于90％的纯度，最好是91％-98％之间。
表II

在本发明上下文中，对应于胞外环序列的氨基酸序列(用大字母表示)，特别是在它们的末端，能够利用与脂肪酸偶联的氨基酸残基(下文中描述的肽用小的大写字母表示)得到延伸。偶联氨基酸序列和脂肪酸分子的本发明的各种缀合物序列如下面的表格中所示。
最好地，包含C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23或者C24碳链的脂肪酸分子优选C16棕榈酸分子。C12-C24之间的脂肪酸分子的碳链是线性的或者分支的。优选脂肪酸分子的碳链是线性的。在另一方面，在所述肽合成期间，特别是在强酸存在情况下去保护的最后一步时，由于反应的不相容性，脂肪酸分子可既不是单不饱和的又不是多不饱和的。
优选地，每个缀合物包含至少四分子的含C12-C24之间碳链的脂肪酸，脂肪酸分子还优选分布在所述肽的N-末端和C-末端。根据脂肪酸分子，可预见其它分布，包括处于氨基酸序列之内。这些肽还与所述脂肪酸分子共价偶联。
优选地，缀合物中的肽每个都与四分子的棕榈酸偶联；因此它们是四棕榈酰化的。
优选地，两分子的棕榈酸偶联于肽的N-末端，两分子的棕榈酸偶联于肽的C-末端。
优选地，如表II所示，缀合物肽的胞外环的氨基酸序列在N-末端和/或C-末端位置上延伸一个或多个氨基酸残基，以使其与含C12-C24之间的碳链的脂肪酸分子结合。
所述肽与所述脂肪酸分子的结合可专一地发生在N-末端位置上或者专一地在C-末端位置上。最好地，特别为了得到四棕榈酰化的序列，缀合物中肽与脂肪酸分子的结合发生在肽序列的N-末端和C-末端位置上。
备选地或累积地，可预见脂肪酸分子与肽序列的中间残基结合。
另外，本发明所定义的缀合物还可包含一个或多个PEG分子。
“PEG化”，即将PEG分子与肽共价偶联的方法，以便增加作为抗原的肽的免疫原性/免疫特性，是本领域技术人员熟知的技术(2002.AdvDrug Deliv Rev.54(4)459-476)。
该方法特别使增加所述肽序列的可接近性、从而使抗原呈递成为可能。
一般而言，肽序列越长，PEG的分子数目越大。
最好地，1-8000的PEG分子连接在位于本发明所述的缀合物的肽的胞外环的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端位点的赖氨酸(K)残基上。每个肽共价地连接在至少两分子的含C12-C24之间的碳链的脂肪酸或至少分别与一分子磷脂酰乙醇胺偶联的两条聚乙二醇链(1-8000)上，以便有可能在脂质体的脂质双层中重构这些抗原性复合物。在合适的给药条件下，这些抗原在佐剂-脂质体中重构，以诱导抗-P-170抗体。
本发明上下文中，术语免疫原性组合物的“载体”是指在免疫系统中可为抗原结构提供运输的任何试剂。特别地，根据本发明的载体可包括脂质体、细菌膜蛋白如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neissera meningitidis)的OMPCs或者大肠杆菌(Escherichia coli)的TraT、肠细菌的Omp蛋白、纳米粒、胶束、金颗粒、微珠和病毒体。
为了形成来自上述缀合物的本发明的免疫原性组合物，最好选择脂质体作为呈递本发明组合物中缀合物的载体。
最好地，所述缀合物呈递在脂质体表面。
就本发明而言，术语“脂质体”应理解为包括一层或多层磷脂的人造球形颗粒，以确保向免疫系统的细胞呈递带有表位且衍生自P-糖蛋白(P-170)胞外环的肽。
根据本发明的组合物包含的缀合物和脂质体的摩尔比最好是1/10-1/1000之间，优选1/50-1/500之间，最好摩尔比是1/250。
最好地，通过混合摩尔比分别为0.9∶0.1∶0.7的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DPMC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DPMG)和胆固醇制备脂质体。上述使用的产品优选人工合成来源以避免被内毒素、朊病毒或病毒污染的可能性。例如，DMPC和DMPG磷脂由人工合成(Avanti Polar Lipids USA)，而98％纯的胆固醇是动物来源。也有人工合成的单磷脂A(MPLA)，已知能加强免疫应答(Fries等1992.《美国国家科学院进展》(Proc Natl AcadSci)89(1)358-362)，被加到脂质体中，并在40μg/μmol磷脂的浓度中作测试。
根据本发明的组合物还包括至少一种佐剂。本发明上下文中使用术语“佐剂”是指对免疫应答有非特异性刺激且增加抗原结构的抗原性的产品。所述佐剂通过动员吞噬细胞到抗原结构的沉积位点并确保减缓抗原的释放，以延长对免疫系统的刺激而发挥作用。
特别地，本发明免疫原性组合物使用的佐剂选自明矾、磷酸钙、白细胞介素1、单磷脂A(MPLA)和/或蛋白微囊及多糖微囊。最好地，本发明上下文使用的佐剂是明矾。
这些免疫原性组合物制成可注射液体溶液或者悬液的形式，或者适合在注射前溶解的固体形式，例如，在下文所述的使用本发明组合物的试剂盒的情况下。
本发明还涉及衍生自至少一个P-170蛋白胞外环且在所述的免疫原性组合物中使用时，能诱导抗-P-170抗体的肽。这些肽分别选自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17。
本发明还包括核酸，即编码如上所述的肽的DNA或者RNA序列。
本发明不仅涉及如上所述的免疫原性组合物本身，而且涉及制备该组和物的方法。
下面的实验结果表明特异性肽仅与两分子的棕榈酸的结合不会导致免疫应答的表达。这些说明了需要选择脂肪酸分子以使缀合物形成诱导免疫应答所需的构象。
还要特别注意的是本发明所述缀合物，特别是它们肽部分的合成。事实上，Tosi等(1995)先前的研究表明有43个氨基酸的mpp1肽序列的最长缀合物不可能获得免疫应答。在没有对上述结果的解释或行得通的假说的情况下，本发明人在本发明上下文中揭示了十分精确的肽合成的基本作用。因此，本发明人已经研究和证明了改良的合成法，其通过避免某些氨基酸参与早期终止反应而更加有效地生产它们，这样特别使得到具有免疫反应性的mpp1肽序列成为可能。因而，利用按照叔丁氧羰基/苄基策略的固相合成方法，能够得到合适形式的用于生产本发明免疫原性组合物的本发明的缀合物。
在实施例部分描述了相关的例子，因而通过利用Applied Biosystems430A肽合成仪使用叔丁氧羰基/苄基即Boc/Benzyl策略合成相应于鼠P-170胞外环l、2和4的序列的肽，然后用(N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵鎓六氟磷酸盐N-氧化物(N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethan-aminium hexafluorophosphate N-oxide原位活化。
所述肽的合成可使用(13，14)一叔丁氧羰基/苄基在肽合成仪例如Applied Biosystems 430A肽合成仪上完成，并用(N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵鎓六氟磷酸盐N-氧化物原位活化(Schlzer M.等《科学》(Science)1992，256(5054)221-225)。
按照该方法，所述缀合物合成基于按照叔丁氧羰基/苄基策略在固相支持物上合成缀合物肽的胞外环的氨基酸序列，然后从N-末端和/或C-末端位置上延伸一个或多个氨基酸残基，以便使其与含有C12-C24之间碳链的脂肪酸分子结合，随后去N-末端和C-末端赖氨酸的胺官能团保护基，以使它们与含有C12-C24之间碳链的脂肪酸分子偶联。最后的步骤是，用强酸如无水氢氟酸裂解固相支持物如树脂上合成的缀合物。
这种改良的合成方法通过避免某些氨基酸参与早期终止反应而使得更加有效地生产它们。
所述肽与脂肪酸分子的结合可在N-末端位置或备在C-末端位置上进行。
最好地，特别是为了得到四棕榈酰化的序列，缀合物中肽与脂肪酸分子的结合发生在肽序列的N末端和C末端位点。
可选地或累积地，脂肪酸分子与肽序列的内部残基结合。
免疫原性组合物的每条肽能够通过一个或多个PEG分子与几个脂肪酸分子结合。
然后将得到的缀合物呈递在脂质体的表面上。
任选地，一旦完成合成，就通过例如RP-HPLC即反向高效液相色谱纯化缀合物。由于脂链的存在使得纯化步骤变得棘手，其导致了色谱峰变宽和可溶性问题。在肽的延长期间，从形成的杂质中分离预期的产物可能是困难的而且导致低产。此外，当脂肪酸位于C-末端位置时，纯化可能是困难的。事实上，在该情况中，期望产品和杂质都带有亲脂部分造成了色谱层析的困难。此外，由于这种策略涉及在合成结束时，在强介质中裂解和去保护的步骤，因此这种处理限制了亲脂部分的选择性(Deprez等1996.《疫苗》(Vaccine)14(5)375-382；Stber等(1997)Bioorg.Med.Chem.5(1)75-83)。
获得的缀合物在脂质体表面上的呈递是机械完成的。事实上，与脂质体混合的缀合物利用它们的脂双链刚好插入脂质体的磷脂膜中。
本发明还涉及所述组合物在按照本发明的免疫方法中的用途。
因此，本发明涉及的免疫方法包括特别是通过注射首次给药本发明所述的免疫原性组合物以及加强给药所述的组合物(加强剂)，例如两次连续的注射。几次接触同一抗原的加强注射，诱导强烈的二次免疫应答。使免疫系统重复接触衍生自P-170蛋白胞外环的肽，诱导免疫记忆以及后来的有高抗体滴度的快速的二次应答。
更特别地，在本发明的免疫方法中，间隔1个月进行人的注射。
根据一个实施方案，根据本发明的组合物的免疫可在患者接受抗癌治疗的同时或者之前进行。
优选地，为了预防和预期患者出现多药耐药性的表型，免疫在化疗治疗之前。当癌症的诊断和发展使得疗效性治疗(化疗)推迟到诊断日后至少三十天时，治疗方案优选免疫与化疗治疗同时进行。癌症的后期治疗不会阻止本发明组合物免疫方法的使用。不过，事实上，同一时间联合使用抗癌治疗和所述免疫原性组合物免疫诱导了针对抗-P-170自身抗体的产生的免疫应答，其对多药耐药性表型的出现具有疗效性或减轻性的效果。多药耐药性表型的逆转表明了使用本发明组合物进行免疫的疗效性的效果。在本发明上下文中，术语多药耐药性表型的“逆转”是指从多药耐药性表型向“化疗治疗敏感性”表型的转变。
就本发明而言，术语“化疗”、“抗癌”或“化疗药物”是指建立在细胞毒性剂基础之上原发肿瘤或继发肿瘤的任何有疗效的或减轻性的治疗。化疗通常需要几个治疗周期。
在化疗治疗之前的免疫方法中，实施本发明组合物的首次注射是在化疗治疗开始前至少60天，优选63和67天。
根据本发明的组合物可通过局部给药、系统给药(口服、鼻以及经其它粘膜途径)和/或肠胃外给药(静脉内、皮下、肌内或腹膜内)或联合其它途径给药，其有效地诱导了抗多药耐药性的保护性免疫应答。如此配制所述组合物，以使其通过上述各种途径方便地服用。特别地，辅助化合物的选用(润湿剂、乳化剂或缓冲剂)取决于给药方式的选择。
最好地，人和小鼠的免疫分别使用肌内和腹膜内给药。
本发明的主题之一还涉及提供抗体，特别是抗人或鼠的P-170的自身抗体，其特异性结合本发明所述的缀合物的肽。
所述的抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体，其从由IgG1、IgG2、IgG3同种型和IgG M组成的组中选择。特别地，所述IgG2抗体可以是2a或者2b亚型。
本发明还涉及免疫原性组合物，其包含载体和包含至少一个衍生自P-170蛋白胞外环1的能诱导抗mpp1抗体的肽的缀合物，其中每个肽结合几分子的含C12-C24之间的碳链的脂肪酸，所述缀合物表现出P-170蛋白胞外环1的全部或部分构象，用于逆转癌症患者出现的多药耐药性。
所述的组合物特别适合用于表达编码人P-170蛋白的MDR1基因的实体瘤的治疗。
本发明还涉及本发明所述的免疫原性组合物的用途，其用于生产旨在治疗和/或预防癌症患者出现的多药耐药性的疫苗。可预测的癌症是肾癌、肝癌、结肠癌、肠癌、前列腺癌、乳癌、膀胱癌、脑癌、血癌(白血病)和/或骨髓组织癌(骨髓瘤)。也可是表达编码人P-170蛋白的MDR1基因的实体瘤。所述免疫原性组合物的使用还可联合抗癌治疗进行。
特别地，预测在临床I/II期，对携带实体瘤的患者使用本发明的疫苗，特别是患有表达编码人P-170蛋白的MDR1基因的癌，例如肾癌、肝癌、结肠癌、肠癌、前列腺癌、乳癌、膀胱癌、脑癌、血癌(白血病)和/或骨髓组织癌(骨髓瘤)实体瘤。临床研究选用的患者按照对标准治疗的无免疫抑制和耐受标准来选择。与这些试验并行，将对相同患者进行药效学和耐受研究。
最后，为了临床评估人的多药耐药性表型的逆转率，本发明所述组合物将直接用于自发表现出多药耐药性的患者。
本发明还包括治疗和/或预防癌症患者出现的多药耐药性的方法，特别是肾脏、肝脏、结肠、肠、前列腺、乳房、膀胱、大脑、血液(白血病)和/或骨髓组织(骨髓瘤)，包括给药所述的免疫原性组合物。
所述的治疗特别靶向的癌症是表达编码人P-170蛋白的MDR1基因的实体瘤。
最后，还考虑了利用所述免疫原性组合物的试剂盒，其包含本发明的免疫原性组合物，以及任选地，试剂和/或使用说明书。
实施例I-1肽部分和含C12-C24之间的碳链的脂肪酸分子通过共价键合形成的缀合物的制备。
所述肽的合成可使用(13，14)-叔丁氧羰基/苄基在肽合成仪如AppliedBiosystems 430A肽合成仪完成，并用(N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基甲铵鎓六氟磷酸盐N-氧化物原位活化(Schlzer M.等《科学》(Science)1992，256(5054)221-225)，然后可使每分子肽共价偶联四分子的棕榈酸(图1)。
已研制出一种通过避免某些氨基酸参与早期终止反应而使得其生产更加有效的改良合成方法。由于mpp1的长度(43个氨基酸)，这种方法对它特别有利。特别合成了鼠肽mpp1、mpp2和mpp4，上述表1中记录了合成的结果(肽序列、分子量和纯度分析)，其中每条肽用总酸解后的氨基酸分析控制其序列，用质谱分析控制其分子量，并用HPLC控制其纯度。
按照该方法，缀合物的合成是基于在树脂上产生期望肽序列，然后为了使它们与含C12-C24之间碳链的脂肪酸偶联，随后脱去N-末端和C-末端赖氨酸的胺官能团的保护基。最后的步骤是用无水氢氟酸裂解。使用叔丁氧羰基/苄基策略得到缀合物。最佳的方法在于在固相上合成肽序列，然后将活化的脂肪酸与选择性去保护的胺(或者硫醇)官能团偶联。如果脂肪酸引入在N末端，则肽不需要任何特殊的官能团排列。另一方面，脂肪酸引入在C末端位置，通常需要在赖氨酸侧链的ε-氨基官能团上进行。在叔丁氧羰基/苄基策略中，肽合成期间必须引入Boc-L-Lys(Fmoc)-OH氨基酸。在产生全部序列后，去保护氨基官能团，并用含C12-C24之间碳链的脂肪酸酰化。最后缀合物去保护，并用无水氢氟酸这样的强酸从树脂上裂解下来(图2)。
I-2与2或4分子含C12-C24之间碳链的脂肪酸偶联的肽的免疫原性程度的评价。
为了进一步理解根据本发明的缀合物的免疫原性程度，生产和测试了两类缀合物。第一类缀合物相应于衍生自鼠P-170蛋白胞外环的肽的合成序列，其中每分子肽与四分子含C12-C24之间碳链的脂肪酸分子共价偶联。第二类缀合物由仅与两分子脂肪酸偶联的肽制成。用二棕榈酰化缀合物以及四棕榈酰化缀合物的特殊实施例来解释本研究。
表III描述了二棕榈酰化和四棕榈酰化的相应于鼠P-170蛋白胞外环1、2和4的缀合物的序列，以及通过利用斑点杂交技术检测抗体所测量的免疫原性能力，以及以荧光单位标识的抗体滴度。观察到除了相应于鼠P-170蛋白的环4的mpp’4之外，注射了含有具有两个棕榈酰残基的缀合物的脂质体的小鼠并不表现出免疫应答。然而，这个缀合物(mpp’4)诱导的抗体滴度比mpp4，即与四个棕榈酰残基偶联的相同序列所诱导的抗体滴度要低四倍。mpp4和mpp2缀合物引起了具有400荧光单位区的抗体滴度的免疫应答。在第一肽的合成中，注射由肽合成得到的相应于最长的氨基酸序列mpp1缀合物后，没有检测到抗体。事实上，由于存在很多可能的化学终止反应或者重新桥接，该环的合成非常困难和耗时，这可能解释了第一批肽缺乏发免疫应答的原因。为进行动物免疫试验，因此进一步合成了肽，特别是环1肽。
这些结果表明，每分子肽与四分子含C12-C24之间碳链的脂肪酸偶联的模型增强了本发明所述免疫原性组合物中脂质体膜内掺入的所述缀合物的免疫原性能力(图1)。因此，由N末端和C末端的疏水相互作用产生的三级结构在诱导实质的和特异性的体液免疫应答中起重要作用。这些疏水型相互作用足够强大以致于形成了与P-170蛋白胞外环的天然结构等同的三级环状构象。在每分子肽与四分子含C12-C24之间碳链的脂肪酸残基偶联的情况中，这种“天然”结构稳定地暴露在载体的表面上，优选脂质体表面上。疏水相互作用下降至1/2可能不足以获得“天然”结构，导致几乎完全抑制根据本发明的缀合物的抗原潜能。
表III


I-3疫苗制备物制备的免疫原性组合物包括Lp1缀合物、脂质体(DPMC、DPMG、胆固醇)Lp2脂质体(DPMC、DPMG、胆固醇)Lp3脂质体(DPMC、DPMG、胆固醇)、MPLA、缀合物Lp4缀合物脂质体在它们的表面上呈递与磷脂按1∶250摩尔比添加的三个缀合物mpp1、mpp2和mpp4。蒸发掉用于混合均质化的有机溶剂，然后用pH＝7.4的无菌PBS水合所得的膜，将磷脂的终浓度调到4mM。最后，悬液中的脂质体在免疫时与无菌明矾(Pasteur Mérieux)按体积比混合。因此，给动物注射相应于免疫原性组合物Lp1、Lp2、Lp3和Lp4的疫苗制备物，其制剂中包含明矾作为免疫佐剂，所述明矾还能够延长疫苗的吸收时间。
I-4动物实验本研究使用由C57B1/6雌鼠和DBA/2雄鼠(Charles RiverLaboratories)交配得到6-10周龄的雌性B6D2F1小鼠。实验中使用的小鼠的体重在19-22g之间。动物免疫7-12天后，从眶后窦采集血样。
I-5免疫方案小鼠免疫三次，间隔两周，用200μl疫苗组合物腹膜内注射。对四种制备物实施该实验方案，每组9只B6D2F1小鼠(Iffa Credo，L’Arbresle，France)。
为了用斑点杂交定量免疫诱导的各类免疫球蛋白，在加强免疫的前1天和末次注射后15天，从每只小鼠的眶后窦采集100μl血。然后离心每个血样，分离血清，用于定量分析。
I-6抗癌剂阿霉素(Dox)(Sigma)和长春碱(VLB)作为抗癌剂用于诱导实体瘤和免疫后化疗的体内模型的方案。
阿霉素是蒽环类家族最主要的抑制细胞的抗肿瘤剂，因此它广泛地单独用于或者联合用于多种肿瘤的治疗。阿霉素的主要作用模式看起来是抑制DNA拓扑异构酶II。然而，和其它所有抗癌药品一样，阿霉素有副作用，特别是血液、消化和炎症类型的副作用，尤其是心脏毒性，这限制了它在化疗治疗中的使用。本实验中阿霉素溶液的使用浓度是10-3mol/l。
长春碱是长春花的生物碱，在治疗中常用作阻断中期细胞有丝分裂的试剂，从而以有丝分裂纺锤体毒药而闻名。因而长春碱优选治疗快速分裂的细胞，它特别适合治疗睾丸癌和Kaposi氏肉瘤。然而，长春碱表现出多种不同的毒性，其中主要的一种是血液毒性。最后，本发明的实验中长春碱溶液的使用浓度是10-2mol/l。
I-7体内实体瘤的诱导模式B16R细胞系源自鼠黑色素瘤，因其具有阿霉素抗性，在本发明中选用于形成实体瘤。体外培养B16R细胞，收集指数生长期的细胞，用磷酸缓冲液(PBS)清洗，之后通过皮下注射小鼠后背侧翼给药。注射体积是50μl溶于0.85％NaCl中的1.106B16R细胞悬液(Candido KA等《癌症研究》(Cancer Res)2001，61(1)228-236)。接种癌细胞后22-24天之间，小鼠形成了平均大小为2.0g±1.2g的黑色素瘤。
肿瘤形成后，证实了B16R细胞对阿霉素的化疗治疗有抗性。因此，前面的实验条件作为用于诱导对阿霉素也有抗性的来自鼠P388细胞(鼠淋巴瘤细胞，以其MDR特性为特征，并因此用作为对照细胞-Kohls WD.等《癌症研究》(Cancer Res)1986Sep，46(9)4352-6)的实体瘤的模式。
可以使用其它肿瘤细胞，只要它们对所测化疗表现出抗性即可。
I-8免疫后的化疗方案如图3所述建立了使用两种抗癌剂长春碱和阿霉素的化疗方案。疫苗制备物Lp1和Lp2预免疫小鼠的化疗治疗始于皮下注射106P388R细胞(0天)后一天，每周注射5.5mg/kg剂量的阿霉素(第1、10和22天)，然后交替注射2.5mg/kg剂量的长春碱(第4和14天)。在此期间，记录小鼠的食物摄取、水摄取、体重以及存活。为了定量抗-P-170抗体并监测它们的活性，在注射P388R细胞前，采集免疫后15-45天期间的小鼠血清样品。
I-9通过斑点杂交分析免疫应答用PBS稀释作为抗原分子的本发明缀合物，首先在室温下置于硝化纤维膜上。30分钟后，用3ml含有PBS-5％脱脂奶的溶液封闭这些抗原分子。不用洗涤，膜在室温下与24μl用等体积PBS预稀释的鼠血清在2ml含有1％脱脂奶和0.1％吐温20的PBS中孵育2小时。采集第三次免疫后15-45天期间的小鼠血清样品。用PBS-1％脱脂奶-0.1％吐温20洗涤三次后，顺次将膜室温下在3ml含有稀释至1/3000过氧化物酶抗-小鼠二抗的PBS-1％脱脂奶-0.1％吐温20中孵育1小时，然后在洗涤两次后，再用3mlPBS-1％脱脂奶-0.1％吐温20孵育。然后单独用PBS清洗一次10分钟，于500μl PBS中放在4℃冰箱过夜。在上述膜表面(0.125ml/cm2)放置化学发光过氧化物酶底物(ECLTM试剂盒，AMERSHAM PharmacieBiotech)，留置1分钟，然后排干水，置于2层Saran膜之间的“冷冻”盒中。膜用放射自显影立即曝光，在KODAK X-OMAT胶片上随时间的改变从几分钟至1小时收集由过氧化物酶发光化氧化反应产生的发射光，其取决于信号的强度。用适合上述系统的显像密度计估计抗体滴度。在上述实验条件下，化学发光反应检测诱导抗体的灵敏度阈值是0.2ng/ml。
所述用于评价免疫了上述疫苗制备物的小鼠体内的免疫应答的实验方案使用了抗-mpp1、mpp2和mpp4抗体以及Ig(M、G3、G2a、G2b、G1)特异性抗-鼠二抗。
I-10免疫了疫苗制备物的B6D2F1小鼠体内的免疫应答用对照疫苗Lp2免疫的B6D2F1小鼠的免疫应答表现出占优势地位的IgM抗体。在三次免疫过程中IgM抗体的浓度保持恒定，这反映了由于MPLA的存在的多克隆非特异性类型的免疫应答。从Lp1疫苗免疫的小鼠血清的检测值中减去IgM抗体值(图4)。
在第一次免疫后，用疫苗制备物Lp4免疫的小鼠表现出抗-mpp1、抗-mpp2和抗-mpp3IgM抗体。IgM抗体的量减少直到第三次免疫后才消失，从而出现IgG1抗体占优势的免疫应答(图5)。
用疫苗Lp3免疫的小鼠在第一次注射后诱导了IgM抗体的表达。第二次免疫后IgM的抗体滴度减少，在此期间免疫应答变成了IgG2b抗体占优势的应答。第三次注射后，IgG1抗体滴度达到最大值；此外，三个缀合物的这种免疫应答都是阳性的，其中mpp2缀合物表现出最强的免疫原性(图6)。
用Lp1疫苗制备物免疫的小鼠诱导出现了占优势的抗P-170蛋白胞外环1、2和4的IgM抗体。在第二次和第三次免疫过程中IgM抗体的量减少，从而出现占优势的IgG抗-mpp2抗体应答。IgG3、IgG2a和IgG2b的抗体滴度约比基本值大2-3倍，其中IgG1的抗体滴度要大5倍(图7)。
通过比较IgG1抗体的量，观察到mpp2缀合物的免疫原性分别是mpp1缀合物和mpp4缀合物的2.6倍和2倍。此外，应当指出Lp1疫苗制备物诱导了最强的总体免疫应答，即相应于每个胞外环一起的同种型(IgM、G3、G2a、G2b、G1)。
与Tosi等(1995.《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochemical andbiophysical research communications)212(2)494-500)的观测结果不同，由所述mpp1缀合物诱导的抗体滴度十分可观，并与检测的mpp2缀合物和mpp4缀合物的抗体滴度相当。
在已经确定Lp1疫苗制备物具有最好的免疫原性能力后，在末次免疫后的18个月内检测了它的无毒性。免疫小鼠与免疫Lp2对照疫苗的小鼠相比，体重上没有显著差异。此外，没有观察到免疫了Lp1疫苗制备物的小鼠，在例如警惕性和食欲的行为上有变化。最后，天然表达P-170蛋白的器官(脾、肝、肾、肾上腺体、胰腺、卵巢、心脏和肺)的组织病理学检测表明免疫了Lp1疫苗制备物的小鼠体内没有诱导毒性和/或自身免疫。事实上，在腹膜位置或器官(肝、胰腺、脾和卵巢)周围可观察到的仅有的病变专一地归因于免疫原性组合物中明矾的使用。研究此试剂的补充分析诱导了所观察到的病变，证实了这个结果。
I-11与Lp1疫苗制备物的免疫相关的抗化学抗性的活性的体内评价在根据诱导实体瘤的方案进行免疫Lp1和Lp2(对照)疫苗制备物的小鼠的多药耐药性表型的发展的体内研究后，接着开始进行免疫化疗治疗方案。接种癌细胞后一天开始抗癌治疗。
在免疫小鼠注射P 388R细胞之前，测定了免疫Lp1疫苗制备物的小鼠血清中抗体的滴度分别有100％、40％和80％的血清表现出平均值为0.3、0.21和0.33μg/ml(1U相当于0.2μg/ml)抗-mpp1、2和4的IgG1型抗体。
提供了作为时间函数的疫苗Lp1和Lp2免疫的小鼠的存活时间(图8)。
图表提供的结果表明Lp1免疫的小鼠组的平均存活时间是39天，而Lp2制备物免疫组的平均存活时间是22天。因此，与对照相比，Lp1疫苗制备物以预防性形式免疫的小鼠的平均存活时间表现出77％的增加。
在Lp2组，观察到一只小鼠的存活时间是70天。
发现即使从注射抗性癌细胞起22天仅给予这样的化疗治疗，存活时间也有77％的增加。然而，观察到在抗癌剂给药末期，存活率开始下降；因此，由于知道与本发明组合物免疫患者获得的自身抗体不同，只有化疗治疗有治疗作用，从而可以推导出如果继续化疗治疗，将发现完全的逆转。
既然在相同癌症模型的多药耐药性的治疗中，已得到的最好的公开结果是用100mg/kg/天剂量的S9788治疗小鼠的存活率有49％的增加(Pierré等1992.《新药投资》(Invest New Drug).10137-148)，因此上述结果是非常有前景的。此外，Yang等(1999.BBRC.266167-173)发现使用同样的细胞系，用长春新碱和环孢菌素A治疗的小鼠的存活率有35％的增加。其他人还已证明某些逆转剂比如反式三氟噻吨(trans-flupenthixol)由于增加了癌细胞的侵入潜能而可能加速死亡率。
对治疗效果的实验鼠癌模型的要求是非常严格的，因为刚一接种，癌细胞的抗性程度就比临床观察的更大，因此存活时间的增加是非常显著的。观察结果表明逆转剂在注射癌细胞后即刻呈现活性；然而，应当指出这些试剂通常在治疗期间逐渐达到细胞毒性浓度时呈现活性。
免疫Lp1疫苗制备物诱导了小鼠活性自身抗体的形成，它们能够快速且持久地在体内抑制对化疗的抗性。因此，免疫Lp1疫苗使得有可能快速抑制化学抗性，并重建化疗难治愈的患者的体内抗癌剂活性。在补充实验过程中，免疫Lp1制备物的小鼠体内循环的自身抗体没有诱导细胞毒性，没有发生自身免疫病变，而且癌细胞入侵的潜力也没有任何增加。
上述说明具体使用了鼠P-170蛋白的肽。然而，所述的方案自然可以相似的方式用于其它肽的合成，特别是上文已经描述过的人P-170蛋白。
序列表<110>AC免疫有限公司兰斯大学<120>在癌症治疗中用于抑制多药耐药性的靶向P-糖蛋白170的治疗性疫苗<130>ACI PCT 001<150>FR 03 091 88 000<151>2003-07-25<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>43<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Lys Gly Gly Asn Met Thr Asp Ser Phe Thr Lys Ala Glu Ala Ser Ile1 5 10 15Leu Pro Ser Ile Thr Asn Gln Ser Gly Pro Asn Ser Thr Leu Ile Ile20 25 30Ser Asn Ser Ser Leu Glu Glu Glu Gly Lys Lys35 40<210>2<211>20<212>PRT<213>智人<400>2
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权利要求
1.免疫原性组合物，其包含载体和作为抗原结构的缀合物，所述缀合物包含至少一个衍生自P-170蛋白胞外环的肽的全部或部分氨基酸序列，其中每个肽结合至少两分子的含C12-C24之间碳链的脂肪酸，从而在合适的给药条件下能诱导抗-P-170抗体。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其能诱导抗-P-170抗体，以逆转癌症患者出现的多药耐药性。
3.如权利要求1和2所述的免疫原性组合物，其中缀合物包含至少两个P-170蛋白胞外环的全部或部分氨基酸序列。
4.如权利要求1和2所述的免疫原性组合物，其中缀合物包含至少三个P-170蛋白胞外环的全部或部分氨基酸序列。
5.如权利要求1-4所述的免疫原性组合物，其中缀合物包含选自衍生自人P-170蛋白胞外环1、4和6的肽的全部或部分氨基酸序列，所述缀合物能诱导抗-人P-170(抗-hpp)抗体。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中缀合物包含衍生自人P-170蛋白环1对应于由所述胞外环1在糖基化位点处裂解得到的三个肽1a、1b和1c的肽的全部或部分氨基酸序列。
7.如权利要求1-4所述的免疫原性组合物，其中缀合物包含选自衍生自鼠P-170蛋白胞外环1、2和4的肽的全部或部分氨基酸序列，所述缀合物能诱导抗-鼠P-170(抗-mpp)抗体。
8.如权利要求1-6所述的免疫原性组合物，其中缀合物肽的全部或部分氨基酸序列分别选自如下的氨基酸序列环1肽1SEQ ID NO 4GEMTDIFANAGNLEDLLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYS或者肽1a SEQ ID NO 5GEMTDIFANAGNLEDLLMS或者肽1b SEQ ID NO 6NITNRSDINDTGFF或者肽1c SEQ ID NO 7MNLEEDMTRYAYYYS环4SEQ ID NO 8FSRIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFS环6SEQ ID NO 10FRFGAYLVAHKLMSFED和/或它们的组合。
9.如权利要求1-8任一项所述的免疫原性组合物，其中每个缀合物包含四分子的含C12-C24之间碳链的脂肪酸。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中脂肪酸分子不是单不饱和的和/或多不饱和的形式。
11.如权利要求1-10任一项所述的免疫原性组合物，其中缀合物是四棕榈酰化的。
12.如权利要求1-11任一项所述的免疫原性组合物，其中缀合物还包含一个或多个PEG分子。
13.如权利要求1-12所述的免疫原性组合物，其中选取的呈递缀合物的载体选自脂质体、细菌膜蛋白、肠细菌Omp蛋白、纳米粒、胶束、金颗粒、微珠和病毒体。
14.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其中选取的载体包括脂质体。
15.如权利要求14所述的免疫原性组合物，其中缀合物和脂质体的摩尔比是1/10-1/1000之间，优选1/250。
16.如权利要求14和15所述的免疫原性组合物，其中脂质体优选通过混合磷脂二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DPMC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DPMG)和胆固醇得到。
17.如权利要求16所述的免疫原性组合物，其中混合物中DPMC、DPMG和胆固醇的比例是0.9∶0.1∶0.7。
18.如权利要求1-17任一项所述的免疫原性组合物，还包括至少一种佐剂。
19.如权利要求18所述的免疫原性组合物，其中佐剂选自明矾、磷酸钙、白细胞介素1、单磷脂A(MPLA)和/或蛋白微囊及多糖微囊。
20.如权利要求19所述的免疫原性组合物，其中佐剂优选明矾。
21.衍生自至少一个P-170蛋白胞外环且能诱导抗-P-170抗体的肽，所述肽分别选自如下的氨基酸序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17。
22.制备如权利要求1-20所述的免疫原性组合物的方法，包括步骤a)按照叔丁氧羰基/苄基策略，在固相支持物上合成缀合物肽胞外环的氨基酸序列，b)用一个或以上的氨基酸残基从N-末端和/或C-末端位置延伸缀合物肽，从而使其能结合脂肪酸分子，c)为了使其与脂肪酸偶联，对N-末端和C-末端赖氨酸的胺官能团去保护，d)用强酸裂解在固相支持物上合成的缀合物，e)和任选地，纯化缀合物。
23.如权利要求22所述的制备免疫原性组合物的方法，其中，作为在N-末端和/或C-末端位置处结合的备选，肽与脂肪酸分子的结合包括与肽序列的内部氨基酸残基结合。
24.如权利要求22和23所述的制备免疫原性组合物的方法，其中所述固相支持物是树脂。
25.如权利要求22-24所述的制备免疫原性组合物的方法，其中每个肽还通过一或多分子的PEG结合几分子的脂肪酸。
26.如权利要求22-25所述的制备免疫原性组合物的方法，其中将所得到的缀合物随后呈递在脂质体表面。
27.免疫的方法，包括首次给药如权利要求1-20所述的免疫原性组合物以及加强给药所述的免疫原性组合物。
28.如权利要求27所述的免疫方法，其中给药的方法用在抗癌治疗的同时或者之前。
29.诱导的抗人或鼠P-170的抗体，其特异性地结合权利要求21的缀合物肽。
30.如权利要求29所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
31.如权利要求29所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
32.如权利要求29-31所述的抗体，其从包括同种型IgG1、IgG2和IgG3以及IgG M的组中选择。
33.如权利要求32所述的抗体，其中所述IgG2抗体是2a或者2b亚型。
34.如权利要求1-20任一项所述的免疫原性组合物的用途，其用于生产旨在治疗和/或预防癌症患者出现的多药耐药性的疫苗。
35.如权利要求34所述的免疫原性组合物的用途，其中癌症侵袭肾脏、肝脏、结肠、肠、前列腺、乳房、膀胱、大脑、血液(白血病)和/或骨髓组织(骨髓瘤)。
36.如权利要求34所述的免疫原性组合物的用途，其中癌症是表达编码人P-170蛋白的MDR1基因的实体瘤。
37.如权利要求1-20任一项所述的免疫原性组合物的用途，联合抗癌治疗。
38.治疗和/或预防癌症患者出现多药耐药性的方法，包括给药如权利要求1-20任一项所述的免疫原性组合物。
39.如权利要求38所述的治疗和/或预防方法，其中癌症侵袭肾脏、肝脏、结肠、肠、前列腺、乳房、膀胱、大脑、血液(白血病)和/或骨髓组织(骨髓瘤)。
40.如权利要求38所述的治疗和/或预防方法，其中癌症是表达编码人P-170蛋白的MDR1基因的实体瘤。
41.使用免疫原性组合物的试剂盒，包含如权利要求1-20所述的免疫原性组合物，以及任选地，试剂和/或使用说明。
全文摘要
本发明涉及免疫原性组合物，其包含载体和作为抗原结构的含有至少一个衍生自P－170蛋白的胞外环的肽的全部或部分氨基酸序列的缀合物，其中每个肽结合几个含有C12－C24碳链的脂肪酸分子，以便使其在合适的条件下服用时，诱导抗－P－170抗体。本发明还涉及用于治疗多药耐药性的方法中使用的所述组合物。
文档编号A61P35/00GK1856323SQ200480027424
公开日2006年11月1日 申请日期2004年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者P·F·托西, C·马杜莱特, C·尼古劳, D·T·希客曼 申请人:Ac免疫有限公司