专利名称：用于促进止血的血纤蛋白原靶向微粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗其自身血小板具有缺陷(例如遗传性或获得性血小板数目(血小板减少)或功能(血小板机能不全)缺陷)的患者的血小板替代物(也称作合成的或人造血小板)。
背景技术：
身体通过形成血凝块控制出血。为了可形成稳定的、不溶性的血凝块和止血，需要许多不同的组分，其中最重要的是凝血酶、血纤蛋白原和血小板，出现在伤口部位。在伤口部位的被破坏的组织释放出组织因子，其激活导致凝血酶产生的凝固级联反应。凝血酶将血纤蛋白原(可溶性血浆蛋白)转化成不溶性的多聚体，所述多聚体是血凝块的基本成分。出现在伤口部位的还有被活化的血小板。血小板是血液中最小的细胞成分，当被激活后，血小板也可形成血凝块的基本成分。在起始步骤中，血小板连接至暴露的伤口表面并开始被激活。血小板膜糖蛋白中的一种，GPIIb/IIIa，发生使其能够结合血纤蛋白原的形状改变。血纤蛋白原是双极性的，这意味着其可结合超过一个血小板，因而血小板聚集到一起。血小板聚集形成了血凝块的基本结构，其形成于血纤蛋白的网络结构中。
可以看出在缺少三种成分(凝血酶、血纤蛋白原或血小板)中的任何一种的情况下，就不能正确地形成血纤蛋白凝块，从而不能止血。遗传性或获得性血小板数目缺陷(血小板减少)可以是因为骨髓产生的血下板减少造成的，例如在恶性肿瘤例如白血病中，或因为细胞毒性治疗造成的，或因为循环的清除速率增加造成的，例如在对血小板抗原的免疫应答的情况下。遗传性或获得性血小板功能缺陷(血小板机能不全)，例如Glanzmann’s血小板机能不全(GPIIb-IIIa血纤蛋白原受体缺陷)、或Bernard Soulier综合症(冯维勒布兰德因子的GPIb受体缺陷)、或贮藏库缺陷例如Grey血小板综合症、Wiscott-Aldrich综合症或Hermanski-Pudlack综合症，可导致弱止血或临床上显著的出血。
对于急性出血和阻止患有血小板产生和/或功能病症的患者出血，血小板输血法是目前唯一有效的治疗方法。1997年关于血小板输血法的一致会议突出了对血小板不断增长的需求的关注。在大会的最后声明中总结出，尽管大量的临床证据表明血小板输血是有价值的，但该方法带有风险和成本问题，其产生用利益平均这些风险和成本的伦理上至关重要的问题。
目前标准的血小板浓缩物制备物是在通过离心全血(血沉棕黄层制备物)或通过血浆分离置换法制备的自体血浆中的血小板悬浮液。浓缩物的保存期限是保持血小板功能和完整性(为此其在22℃下贮藏最佳)和使细菌生长降低到最低程度(为此其在4℃下贮藏最佳)的竞争需要之间的平衡。通过将血小板浓缩物贮藏在22℃但将其保存期限限制在5天以使细菌污染降到最低来解决该矛盾。然而，即使是在这段时间，血小板也会稳定地被激活。短暂的贮存期限和为满足新治疗方案而不断增加的临床需求正日益导致世界范围内供应短缺。
尽管在严格的制备和贮藏条件下，但血小板输血法仍与急性细菌感染风险关联。非常低但可能的传播血液携带的病毒的风险也得到了公认，并且最近认识到vCJD传播的理论风险。该风险被认为与浓缩物中的白细胞相关，因此可通过清除白细胞得以降低或消除。然而，已观察到血小板也携带正常的朊病毒蛋白，其在贮藏期间被释放出来。尽管还没确立血小板是否也可携带变异的朊病毒蛋白，但这引起了人们的关注。
血小板制备物中白细胞的存在产生了另外的风险。其增加了对HLA抗原免疫的风险，可导致多次输血的患者成为顽固性难治血小板病症患者。此外，在贮存中，白细胞可释放致热性细胞因子，增加了不利反应的可能性。由于这些各种原因，现在常规地将白细胞从血小板浓缩物中清除，但这导致了血小板产量的伴随性降低从而增加了成本。此外，白细胞清除不能解决来源于血小板的细胞因子(例如TGF-β和RANTES)的问题，所述细胞因子也与针对血小板浓缩物的过敏性反应相关。
与血小板输血法相关的问题已刺激了对替代品的寻找，并且至今主要有三种不同的方法。
现已对稳定血小板或血小板断片以延长其保存期限和促进细菌和病毒失活方法的应用进行了尝试。用Psoralen(光化学活性剂)和紫外光处理血小板浓缩物已显示使血小板浓缩物中的细菌和病毒病原体失活。可选择的途径是冻干血小板膜片段制备物，已显示其在有限的患者中显示短暂和不稳定的效果。然而，这些途径实际上仍受限于血小板是高度可变的原材料供给物，可能证明其与可重复的生产和质量控制是不相容的。
第二种方法是使用刺激内源性血小板产生的活性剂例如重组生长因子，例如血小板生成素或白细胞介素II。尽管在刺激内源性血小板产生上有效，但该方法也受到限制，因为在治疗和血液中大量血小板数量的恢复之间存在延迟。因此这种治疗法不适合于治疗急性出血。此外，患者反应上的差异可导致血小板的产生不足或超量产生，其分别可给患者带来出血或血栓形成的风险。
第三种方法是发展非血小板来源的止血剂。该方法的有利方面是设计无菌的、冻干的产品的潜能，可通过使用非血小板来源的、生物可相容的、确定的原材料进行大规模地、节约成本地生产所述产品。目的是发展在血管内的受损部位具有与残余血小板相互作用的能力同时又不在无血管损伤的情况下诱导血栓形成反应的颗粒材料。为达到该目的，设计紧密模仿天然血小板行为的产物则非常重要。因此，理解正常血小板功能是发展所述产品的前提，因为为了有效，血小板替代物必须能够模仿止血性血小板栓形成的关键过程。此外，这样形成的血栓必须能够通过正常的纤维蛋白溶解作用溶解。
血小板通常以静息状态进行循环，但在脉管受伤后，其通过GPIbα血小板受体迅速地连接至受损内皮下细胞表面上的冯维勒布兰德因子(vWF)。这种相互作用在高剪切力的条件下发生，例如如在受损血管内流动中所经历程的，并且其重要性通过在患有Bernard-Soulier综合症(缺少GPIb受体)或严重的冯维勒布兰德疾病(缺少vWF)的患者中所见的出血素质得到证明。该连接过程和许多血小板激动剂(血管壁中的胶原蛋白、从受损细胞中释放的ADP、由暴露的组织因子和血浆凝结因子相互作用局部产生的凝血酶)的存在一起激活了血小板。这使GPIIb-IIIa受体复合物产生构象变化，使其能够结合血浆血纤蛋白原并招募更多血小板到正在生长的血栓中。血小板也可暴露凝血酶原酶复合物可结合的并产生凝血酶的带负电荷的表面，从而通过切割血纤蛋白原形成血纤蛋白加入至止血栓中。
血小板-血小板聚集关键依赖于血纤蛋白原与GPIIb-IIIa的相互作用—血小板活化的“最终共同途径”。Coller(1980)Blood 55，2证明用血纤蛋白原包被的惰性小珠可在ADP存在或不存在的情况下通过GPIIb-IIIa受体与血小板结合，因此模仿了血小板在产生聚集过程中的行为。
已经进行过几次利用该概念发展血小板替代物的尝试。RGD肽(即包含基元Arg-Gly-Asp的肽)，设计用于与GPIIb-IIIa血小板受体相互作用，已被共价地偶联至红细胞。尽管所述制备物可在低剪切力的条件下与活化的血小板相互作用，但其不能在血小板减少的灵长类动物(Alving等人，1997，Transfusion，37，866-876)中减少出血。在分开的研究中，通过甲醛与红细胞交联的血纤蛋白原增加了ADP-和凝血酶诱导的血小板聚集，并在血小板减少的大鼠(Agam & Livne，1992，Eu.J Clin.Invest.，22，105-112)中缩短了出血时间。在提供一些前景的同时，这两种方法都具有仍然要依赖于细胞材料的不利方面。
WO 98/17319公开了由包被在交联的人血清白蛋白形成的微囊的表面上的血纤蛋白原构成的产物。这些产物显示在高剪切力条件下与血小板相互作用，并且在血小板减少的兔子中显著地减少出血。包被血纤蛋白原的微囊显示与GPIIb-IIIa受体发生相互作用，因为其与血小板的结合被包含RGD的肽抑制。由蛭素造成的部分活性阻断表明凝血酶已切割被固定的血纤蛋白原。在激动剂存在的情况下血纤蛋白原包被的微囊聚集血小板，但也能在激动剂不存在的情况下诱导血小板聚集(即是血栓形成的)。该后面的效应是可变的并且依赖于批次和血小板供体。因此，尽管这些研究表明这些微囊可促进止血栓的形成，但其与非活化的血小板的相互作用是个问题并且在体内可导致不利的血栓形成事件。从这些数据可清楚地看到需要进一步发展所述产品。
对WO 98/17319的产品的另外的分析描述于Davies等人(Platelets，2002，13，197)，其中WO 98/17319产品称为“SynthocytesTM”。在无活性和活化的血小板中，即分别在血小板活化激动剂ADP不存在或存在的情况下分析了SynthocytesTM诱导血小板聚集的能力。通过血小板计数技术测量，Davies等人的图2(A)报道了在全血(WB)中血小板聚集测定的结果。图2(A)显示对于无活性的血小板(即在ADP不存在的情况下)，在无SynthocytesTM的情况下，血小板聚集大约为20％，而在SynthocytesTM存在的情况下，大约为50％。换句话说，SynthocytesTM使无活性的血小板聚集增加。在特定的试验条件下，无活性的血小板的聚集增加大约2.5倍。图2(A)也显示SynthocytesTM对活化的血小板的效应。在SynthocytesTM不存在的情况下活化的血小板(即在ADP存在的情况下)的血小板聚集大约为40％，而在SynthocytesTM存在的情况下大约为70％。在血小板活化中这是低于2倍的增加。Davies等人的图2(A)表明在ADP不存在的情况下SynthocytesTM具有聚集血小板的活性，即其组成型地聚集无活性的血小板。此外，图2(A)显示SynthocytesTM使无活性的血小板聚集增加(大约2.5倍)超过使活化的血小板聚集增加(低于2倍)。这些数据显示SynthocytesTM并不优先于无活性的血小板与活化的血小板结合(即聚集)。相反，WO 98/17319的SynthocytesTM在血小板的聚集中具有组成型的活性，无论血小板是活化的还是无活性的。
因此发明的目的是提供改进的血小板替代物。特别是本发明的目的是在现有技术中解决对安全的非血栓形成的血小板替代物的需要。
发明内容
本发明提供了包含活性剂的可注射的药物产品，所述活性剂包含与肽结合的不溶性载体，所述肽能够结合血纤蛋白原，从而所述活性剂通过被结合的血纤蛋白原优先于无活性的血小板与活化的血小板结合，其中所述肽不是血纤蛋白原。
在一个实施方案中，所述肽结合至由血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa或由血纤蛋白天然结合的血纤蛋白原的区域。
在优选的实施方案中，所述肽结合至由GPIIb-IIIa天然结合的血纤蛋白原的区域。在Bennett，2001，Annals of NY Acad.Sci.，936，340-354中讨论了GPIIb-IIIa与血纤蛋白原的结合。
所述肽可与血纤蛋白原的α链的羧基或氨基端结构域中的一个结合或与两者都结合。更特别的是，所述肽可结合一个或两个所述结构域中的含有RGD的基元。含有RGD的基元可具有序列RGDX，其中X是任何氨基酸，例如丝氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸，因此在氨基酸95-98上可以是RGDF，或在氨基酸572-575上是RGDS。
所述肽可与血纤蛋白原的γ链的C端结构域结合。更特别的是，所述肽可结合血纤蛋白原γ链的C端结构域的最后15、12、10或4个氨基酸内的序列。最后12个氨基酸通常是HHLGGAKQAGDV。
在另一个优选的实施方案中，所述肽结合至由血纤蛋白天然结合的血纤蛋白原的区域。在Mosesson等人，2001，Ann.N.Y.Acad.sci.，936，11-30(其内容在此引用作为参考)中讨论了与血纤蛋白原结合的血纤蛋白。所述肽可结合γ链的D结构域，例如残基337-379之间的结构域。所述肽可结合D结构域的β链区段，例如C末端区域。
所述肽可结合血纤蛋白原，解离常数(Kd)大约为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400或更高nM。优选地Kd大约为100nM。
本发明的活性剂以这样的方式与血纤蛋白原结合，当结合时，血纤蛋白原优先于无活性的血小板与活化的血小板结合。活化的血小板是这样的血小板，通过激动剂刺激使其产生的变化引起GPIIb-IIIa的构象发生变化，而GPIIb-IIIa的构象变化允许血纤蛋白原与其结合，从而使血小板能够聚集，并且在一些情况下释放其细胞内颗粒的内含物，例如5HT或在其表面表达颗粒膜蛋白，例如α颗粒P选择蛋白。在激动剂之间，所述反应的精确本质会发生变化并且依赖于激动剂的剂量。激动剂的例子是凝血酶、ADP和胶原蛋白。未被活化的血小板具有进行这些变化的潜能，但仍未被激动剂刺激以产生这些变化。
为检验肽是否能够结合血纤蛋白原以使血纤蛋白原对活化的血小板具有结合优先权，如下面所描述的，将受试肽与本发明的载体结合并使血纤蛋白原与所述肽结合，由此产生受试活性剂。如在Davies等人，2002，Platelets，13，197中所描述的，在血小板活化的激动剂例如ADP存在或不存在的情况下，将受试活性剂加入到悬浮液例如全血、富含血小板的血浆中或合适的缓冲液中的血小板中(即将受试活性剂分别加入至活化的或无活性的血小板中)，并轻柔地混合。然后分析血小板悬浮液/受试活性剂混合物以确定血小板是否聚集，例如通过使用下面实施例中或Davies等人中描述的血小板计数技术进行分析。作为对照，如在下面实施例中或在Davies等人中所描述的，在不加受试活性剂的情况下，在ADP存在或不存在的情况下确定血小板聚集的水平。血小板聚集的水平与被结合的血纤蛋白原结合血小板的能力相关。本发明的活性剂显示在ADP存在的情况下对照和活性剂之间增加的聚集比在ADP不存在的情况下增加的要多，所述活性剂含有能够结合血纤蛋白原以使血纤蛋白原优先结合活化的血小板的肽。本领域技术人员理解除了ADP外还可使用血小板活化的激动剂进行相同的试验。
一般地，与无活性对照的水平相比，根据本发明的活性剂将导致无活性的血小板的聚集低于150％的增加，例如低于140％、130％、120％、110％、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或无活性的血小板聚集基本上没有增加，所述活性剂含有能够结合血纤蛋白原以使血纤蛋白原优先结合活化的血小板的肽。更低数目是优选的。在该上下文中，将无活性的血小板聚集的基础水平定为100％，因此按上述定义100％的增加就是聚集水平的加倍(即增加2倍)而150％的增加表示聚集水平增加2.5倍。
与活化的对照相比，本发明的活性剂在活化的血小板聚集上可导致至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(即2-倍)的增加或更多，所述活性剂含有能够结合血纤蛋白原以使血纤蛋白原优先结合活化的血小板的肽。更多的数目是优选的。由本发明的活性剂导致的活化的血小板聚集的增加水平可高达50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更多。
在一个实施方案中，优选地，本发明的活性剂能够使被活化的血小板相对于活化的对照(即，在本发明的活性剂不存在的情况下的活化的血小板)比无活性血小板相对于无活性的对照(即，在本发明活性剂不存在的情况下的无活性的血小板)在聚集上更大倍数的增加。
产品是可注射的药物产品，如果其是无菌的、基本上不含致热原和无医学上不能接受的效应。例如，当注射入人受试者时，所述产品应当不产生医学上不能接受的免疫反应。本领域技术人员可确定医学上不能接受的效应。
重要的是，在本发明的情况下，活性剂中的血纤蛋白原结合肽应当能够这样结合血纤蛋白原，当活性剂已通过血纤蛋白原结合肽加载了血纤蛋白原并通过静脉内途径给患者施用时，通过肽结合至活性剂的血纤蛋白原在医学上不能接受水平的非特异性血纤蛋白凝块的形成中不应是有活性的。“非特异性”，在本上下文中，包括在伤口部位不存在活化的血小板的情况下发生的血纤蛋白凝块的形成。
如上面所讨论的，WO 98/17319公开了血纤蛋白原包被的微囊，其诱导无活性的血小板的血小板聚集(即其是血栓形成的产物)。这是医学上不可接受的。不受理论束缚，我们相信，本发明的产品，通过以不会导致医学上不能接受的组成型血纤蛋白原的行为的构象结合血纤蛋白原，解决了现有技术所面临的不利方面。因此，直接与本发明的产品中所用的载体结合的血纤蛋白原结合肽不是WO 98/17319中所定义的血纤蛋白原。
在体内，血纤蛋白原通常与因激动剂例如ADP、凝血酶或胶原蛋白的存在而被活化的血小板结合。
在一个实施方案中，如果给患者静脉内施用，所述产品将在血小板已被活化的伤口部位优先参与血凝块的形成。在本上下文中，短语“优先参与”是指，尽管产品与无活性的血小板的低水平结合可能是可接受的，但该水平不会导致医学上不可接受的血纤蛋白凝块形成的水平。
如在产品中所用的血纤蛋白原结合肽可包含获自血小板膜糖蛋白GPIIb或GPIIIa(Bennett，2001，Annals of NY Acad.Sci.，936，340-354)的序列。
特别是，血纤蛋白原结合肽可从GPIIb或GPIIIa的血纤蛋白原结合区域获得。优选的血纤蛋白原结合区域包括结合血纤蛋白原的α链的氨基和/或羧基端结构域的区域和结合如上所述的血纤蛋白原的γ链C端结构域的区域。
因此，血纤蛋白原结合肽可包含AVTDVNGDRHDLLVGAPLYM序列或其血纤蛋白原结合片段，所述序列代表GPIIb的氨基酸294-314的序列。这些片段包括序列TDVNGDGRHDL(296-306)，序列GDGRHDLLVGAPL(300-312)和末端四肽GALP。这些序列被认为参与血纤蛋白原特别是血纤蛋白原γ链(Bennett，2001，op.cit.；D′Souza等人，1991，Nature，350，66-68；Taylor & Gartner，1992，J.Biol.Chem.，267，11729-33)的结合。片段296-306和300-312的相似效果暗示片段300-306也可提供血纤蛋白原结合活性。
Grunkemeier等人(1996，J.Molecular Recognition，9，247-257)报道了纯化的TDVNGDGRHDL(称作“B12”)肽抑制血小板聚集。Grunkemeier等人利用该信息提出B12肽包被的非血小板粘附性材料，并假设B12可在结合GPIIb/IIIa血小板受体的区域特异性地结合血纤蛋白原，从而阻止血小板聚集。因此，从Grunkemeier等人中理解到，当被固定化时，B12肽可用于阻止血纤蛋白原与血小板结合，从而抑制血小板聚集。按照该教导，B12肽适合用于血小板替代物以帮助血小板聚集和血凝块形成不是显而易见的。
血纤蛋白原结合肽可包含一种或多种肽APLHK、EHIPA和GAPL，其是Gartner，1991，Biochem.Biophy s.Res.Commun.，180(3)，1446-52中显示的GPIIb-IIIa的血纤蛋白原结合结构域的亲水性等同肽模拟物。
血纤蛋白原结合肽可包含GPIIIa的残基95-223的序列或其血纤蛋白原结合片段。例如残基211-222，其包含据认为是GPIIIa(Charo等人，1991J.Biol.Chem.，266，1415-1421)中重要的血纤蛋白原结合结构域的序列SVSRNRDAPEGG。
GPIIIa的其它合适区域包括残基109-171和164-202。
本领域技术人员理解，也可使用这些序列中的任何一个的片段或变体，只要其提供本发明的血纤蛋白原结合活性。
特别优选的血纤蛋白原结合肽包含从血小板膜糖蛋白GPIIb获得的序列，即TDVNGDGRHDL或该序列的变体。
TDVNGDGRHDL的变体包括—T(D，E)VNG(D，E)GRH(D，E)LTD(V，L)NGDGRHDLTDV(N，Q)GDGRHDLTDVNGDG(R，K)HDL这些变体具有与TDVNGDGRHDL基本上相同的血纤蛋白原结合活性，因为其具有对血纤蛋白原基本上相同的亲和力并且当结合后，血纤蛋白原具有与TDVNGDGRHDL结合后产生的基本上相同的构象和活性。“基本上相同的结合活性”包括以与TDVNGDGRHDL高达1、2、3、4、5、10、50、100或更高数量级不等(更高或更低)的亲和力结合血纤蛋白原的变体。优选地是更低的数目。
Kuyas等人，1990，Thrombosis and Haemostasis，63(3)，439，描述了通过C末端赖氨酸被固定在fractogel上的合成肽GPRPK从人血浆中分离血纤蛋白原的用途。Kuyas等人阐明，人血纤蛋白原对血纤蛋白具有很强的亲和力，并报道了作者使用含有通过凝血酶作用暴露的血纤蛋白α链的N末端序列的肽GPRP，该序列已经显示与血纤蛋白原结合(Laudano & Doolittle，1980，Biochemistry，19，1013；Laudano等人，1983，Ann.N.Y.Acad.Sci.，408，315)。Kuyas等人得出结论‘核心’序列GPR是血纤蛋白原结合所必需的。
因此，产品中所用的血纤蛋白原结合肽可包含血纤蛋白的血纤蛋白原结合区域的序列例如α链的N末端区域或β链的C末端区域。因此，所述肽在氨基端可具有Gly-(Pro/His/Val)-Arg-Xaa序列，其中Xaa是任意氨基酸。在该上下文中，“在氨基末端”是指在上面的四肽序列中的Gly残基，当从N端向C端阅读时应当代表该肽的第1个氨基酸。“Pro/His/Val”是指在该位点上包括脯氨酸、组氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，脯氨酸和组氨酸是优选的，脯氨酸是最优选的。
Kuyas等人没有公开根据本发明的可注射药物产品，因为所述肽结合在Fractogel上。Fractogel由聚甲基丙烯酸酯构成并且具有20mm的最小颗粒尺寸，因而不是药物可接受的。
所述肽在氨基末端可包含Gly-Pro-Arg-Pro序列。
可选择地，所述肽在氨基末端可包含Gly-Pro-Arg-Sar(Sar是肌氨酸的缩写，其是甲基甘氨酸)、Gly-Pro-Arg-Gly或Gly-Pro-Arg-Val的序列。
所述肽可包含，除了血纤蛋白原结合序列外，设计用于帮助将所述肽连接至载体的氨基酸或序列。例如，所述肽可包括用于连接于载体上的巯基反应性基团的末端半胱氨酸(参见下面)。
通常所述肽具有4至200个氨基酸。优选地，在长度上，所述肽不超过150、100、90、80、70、60、50、40、30或20个氨基酸。优选地，在长度上，所述肽至少是4、5、6、7、8、9、10、11或更多个氨基酸，尽管最小长度应当至少长到足以包含完全的血纤蛋白原结合序列。
所述肽也可包含间隔子序列。其可在血纤蛋白原结合序列和与载体的连接之间提供空间距离。这可以帮助保持所述肽的血纤蛋白原结合活性。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的间隔子序列可以是合适的。间隔子序列可包含氨基酸的混合物或可以是单一氨基酸的重复。例如，多聚(甘氨酸)序列可适合用作间隔子。
载体应当是不溶性的、惰性的和生物相容性的。当通过将载体加入至血浆并使用例如微粉化的高岭土(由Helena Laboratories Ltd.提供)活化再钙化血浆来证明对活化的部分织促凝血酶原激酶凝固时间(APPT)没有影响，或使用例如Manchester织促凝血酶原激酶活性剂(由Helena Laboratories提供)来证明对凝血酶原凝固时间(PT)没有影响来进行检验时，载体应当表现对血液凝固没有显著影响。类似地，当用如上描述的Davies等人，2002，Platelets，13，197的方法进行检验时，载体应当表现对血小板无影响。如上面所用的，短语“无影响”是指载体不具有上述的医学上不可接受的效应。
载体应当具有适合于确保活性剂通过肺毛细血管床运送的大小尺寸。使用Perkins等人，1997，The British Journal of Radiology，70，603的方法可确定活性剂通过肺毛细血管床被运送的能力。可选择地，可通过将活性剂注射入宿主例如被麻醉的狗或猕猴，并研究心血管和呼吸的安全性，包括分析参数例如血压、脉搏血氧定量法(pulseoximetry)、呼吸率和心率分析以及血气分析来确定活性剂通过肺毛细血管床被运送的能力。能够通过肺毛细血管床被运送的活性剂，当注射入宿主时，基本上对这些参数没有影响。
在该实施方案中，载体可以具有最大的尺寸，这样少量载体，例如数量上低于大约2％的群体，如通过颗粒计数器例如CoulterMultizerII所测量的，最大尺寸超过6μm。以2至4μm为最大尺寸的大小可以是合适的，与人血小板的尺寸类似。
在一个实施方案中，载体可以是微粒。术语“微粒”包括固体、中空和多孔的微粒。微粒可以是球形的(即是“微球”)，其包括所有基本上是球形的形状。
微粒可由任何合适的物质形成。其可以由交联的蛋白形成。用于该目的典型的蛋白是白蛋白，其可以是来源于血清的或重组的白蛋白，在序列上可以是人或非人的。蛋白微粒可由喷干的蛋白形成。例如，适合用作本发明的载体的微粒可由通过使用已知的喷干技术例如WO92/18164中的技术喷干人血清白蛋白形成。因此，载体可以是白蛋白微粒。
用作载体的微粒的替代物包括脂质体、合成的多聚体颗粒(例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚(乳/乙醇)酸)、细胞膜片段等。
所述肽可以任何合适的方法与载体结合。肽与载体之间的键可以是共价或非共价键。一般是共价键。当肽包含半胱氨酸并且载体包含巯基反应性基团时可形成适合的共价键。其允许肽通过将半胱氨酸的-SH基与载体上的巯基反应性基团连接而将其与载体连接。如上所述，可将末端半胱氨酸残基掺入血纤蛋白原结合肽中以使述肽与载体上的巯基反应性基团交联。例如可使用白蛋白载体上的游离巯基，在白蛋白载体上可将离去基团(例如5，5′-二硫-二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)或Ellman活性剂)替换成游离的suphydryl基，和用肽上的半胱氨酸替代离去基团。合适的巯基反应性基团也包括如Green等人，1982，Cell，28，477中公开的马来酰亚胺，尽管本领域技术人员理解可使用任何合适的方法。
例如通过使用例如马来酰亚氨苯甲酰-N-羟琥珀酰亚胺酯(MBS)或琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯)(SMCC)交联剂将载体中的赖氨酸残基转化成巯基反应性马来酰亚胺基团，也可在载体上产生巯基反应性基团。
将肽连接至载体上的可选择方法是使用两步碳二亚胺方法(Grabarek，1990，Analytical Biochemistry，185)，其中用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和肽一起温育，导致活化酯的形成。可分离肽酯然后与载体混合，所述酯允许与载体上的胺反应。
任何数目的血纤蛋白原结合肽可结合至载体上。血小板一般具有50,000-100,000个GPIIb-IIIa表面蛋白。载体上相似数目的血纤蛋白原结合肽可以是适当的。例如，载体可具有至少1,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000或更多血纤蛋白原结合肽结合在其上，例如高达50,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000，150,000、200,000、400,000或更多的血纤蛋白原结合肽。在一个实施方案中，血纤蛋白原结合肽的数目可以是大约5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000个或更多。
血纤蛋白原或其变体或片段，可结合至由此形成的产物上，从而提供固定形式的血纤蛋白原给个体施用。
这可以通过方法实现，所述方法包括提供如上所述的产品并将其与血纤蛋白原或其片段的变体混合的步骤。在一个实施方案中，因为肽对血纤蛋白原(或变体或片段)具有亲和力，所以血纤蛋白原(或变体或片段)与多肽结合。因此，通过非共价键可将血纤蛋白原(或变体或片段)结合至肽上。随后非共价键可通过血纤蛋白原(或变体或片段)与肽之间或血纤蛋白原(或变体或片段)和载体之间形成另外的共价键来稳定。可选择地，血纤蛋白原(或变体或片段)连接的唯一方法可通过共价键结合至肽。
一种用于非共价连接血纤蛋白原(或变体或片段)的合适方法包括用血、或血浆或来源于血浆的或重组的血纤蛋白原浓缩物温育如上定义的产品，其在20℃和37℃之间进行适当的时间长度后就适合用于静脉内使用了。我们已经发现在20℃下温育长达3小时就足够了。在下面的实施例中讨论其它的非共价连接血纤蛋白原的方法。
可改变结合所述产品的血纤蛋白原的量以获得期望的产品特性。一般地，在适合于获得其中至少有10％，优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的颗粒与血纤蛋白原非共价结合的产品的血纤蛋白原浓度和条件下，用血纤蛋白原溶液温育产品。在一个实施方案中，选择的血纤蛋白原温育条件产生具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更大的中值荧光强度(MFI)(如通过下面实施例公开的方法所确定的)的产品。更优选地，MFI低于31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、18、19、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5。
为实现共价连接，可以通过例如使用零长度异双功能交联剂例如上述的EDC和磺基-NHS将血纤蛋白原与肽交联。
生产可注射的药物组合物的随后步骤可包括—(a)除去未结合的血纤蛋白原；(b)用药物可接受载体或稀释剂配制产品；(c)稀释产品以提供药物可接受的单位剂量；和(d)对产品进行灭菌。
具体地，可如下进行生产中的步骤—(a)可通过在2000xg下在20℃离心15分钟除去未结合的血纤蛋白原，随后在等渗缓冲液(例如，含有0.15M氯化钠、pH 7.0-7.4的50mM磷酸钠缓冲液，或含有0.15M氯化钠、pH 7.0-7.4的0.02MTris)中再悬浮来洗涤产品。可选择地，可使用切向超滤，用上述缓冲液中的一种洗涤产品，此时产品将保持在膜上。
(b)通过在生理pH下在等渗缓冲液(例如，使用上述缓冲液中的一种)中再悬浮来配制产品。例如，可使用包含甘露醇或葡萄糖的缓冲液。在一个实施方案中，可将产品冻干以产生冰冻干燥的剂量形式，可在使用前将其迅速复水。合适的剂量形式大概在0.5克和5克产品之间。
要理解步骤(b)和(c)可以相同或不同。
也要理解步骤(d)可以不是必需的。一般在无菌条件下生产产品，在优选的实施方案中，额外地使产品接受末期加热处理。合适的液体悬浮物的末期加热处理的例子是在合适的温度例如60℃下加热10小时。可选择地，首先可将产品冻干，然后加热至例如80℃达72小时。该方法普遍用于破坏血液蛋白中的病毒并预期可破坏细菌。可选择地，可用γ辐射例如通过使用钴60源，在25-35Kgy下暴露来替代加热处理步骤。
连接的形式可以变化，只要被结合的血纤蛋白原(或变体或片段)优先于无活性的血小板与被活化的血小板结合，优选地，在静脉内施用后，只在血小板已被激活的伤口部位开始参与血凝块的形成。
因此，所述产品可额外地包含具有可诱导的血小板聚集活性、与所述肽结合的血纤蛋白原或其变体或片段。
“可诱导的血小板聚集活性”是指血纤蛋白原优先于无活性的血小板与被活化的血小板结合。优选地，如果给患者静脉内施用，产品的血纤蛋白原部分将优先地在血小板已被激活的伤口部位开始参与血凝块的形成。上面描述了用于确定血纤蛋白原的血小板聚集活性是否是“可诱导的”的方法。
血纤蛋白原的来源可以是例如来源于血浆或血液或来源于重组来源的经纯化的蛋白。血纤蛋白原在序列上可以是人的或非人的。
可使用任何血纤蛋白原的变体或片段，只要其具有有用水平的可诱导的血小板聚集活性。在该上下文中，有用水平的可诱导的血小板聚集活性是指变体或片段可与本发明的产品一起使用以使活化的血小板优先于无活性的血小板聚集，如上所述。优选地，任何这种变体或片段包含血纤蛋白原的γ链的残基398-411。在优选的实施方案中，变体或片段可包含或甚至由HHLGGAKQADV构成。
因此，本发明也提供具有可诱导的血小板聚集活性的可注射药物产品，其包含以使血纤蛋白原(或变体或片段)优先于无活性的血小板与活化的血小板结合的构象与血纤蛋白原或其变体或片段结合的不溶性载体。
一般地，当静脉内导入后，产品只在血小板已被激活的伤口部位开始参与血凝块的形成。血纤蛋白原或其变体或片段，一般通过上面定义的血纤蛋白原结合肽间接地与载体结合。
在可选择的实施方案中，上面定义的产品可在不含血纤蛋白原的情况下进行施用。在该情况下，所述产品能够与施用了所述产品的个体的内源血纤蛋白原结合。
因此，本发明也提供了促进止血、即提高个体产生血纤蛋白凝块的能力的方法，其包括施用如上定义的药物有效剂量的产品。因此所述产品可用于提高个体在伤口部位形成血纤蛋白凝块、同时避免在远离伤口的部位医学上不能接受水平的血纤蛋白凝块的非特异性形成的能力。一般地，所述方法是治疗患有血小板减少的患者的方法。
血小板减少可由导致使血小板破坏增加的疾病产生。这些疾病包括免疫性血小板减少性紫癜、弥漫性血管内凝血、肝素诱导的血小板减少、其它药物诱导的血小板减少、系统性红斑狼疮、HIV-1相关性血小板减少、血栓形成血小板减少性紫癜/溶血-尿毒性综合症、普通可变免疫缺陷、输血后引起的紫癜和2B型冯维勒布兰德氏疾病。
血小板减少可由导致使血小板产生减少的疾病产生。这些疾病包括无辐射血小板减少(TAR)综合症、amegakaryocytic血小板减少、巨血小板综合症(例如Bernard-Soulier综合症、May-hegglin异常、Fechtner综合症、Sebastian综合症、Epstein综合症、Montreal血小板综合症)和Wiskott-Aldrich综合症。
血小板减少可由导致螯合(例如，脾功能亢进或Nasabach-Merritt综合症)或使血小板破坏增加和血稀释(例如体外输血)的疾病产生。
本发明的方法也可用于治疗患有上述疾病中任一种的患者。
然而，所述方法也可用于治疗患有血小板机能不全(即遗传性或获得性)的患者。获得性血小板功能缺陷可由尿毒症、骨髓增殖性病症(例如特发性血小板增多、真性红细胞增多、慢性骨髓性白血病、和特发性骨髓外化出)、急性白血病和脊髓发育不良综合症、蛋白异常血症、体外输血、获得性冯维勒布兰德氏疾病、获得性贮藏库缺陷、抗血小板抗体、肝病、药物或其它活性剂产生。遗传性血小板功能缺陷可由血小板粘附疾病(例如Bernard Soulier综合症和冯维勒布兰德氏疾病)、激动剂受体疾病(例如整联蛋白α2β1(胶原蛋白受体)缺陷、P2Y12(ADP受体)缺陷或血栓烷A2受体缺陷)、信号传导途径疾病(例如Gαq缺陷、磷酸脂酶C-β2缺陷、环氧酶缺陷、血栓烷合成酶缺陷、脂氧化酶缺陷或钙动员上的缺陷)、分泌疾病(例如贮藏库疾病、Hermansky-Pudlak综合症、Chediak-Higashi综合症、Gray血小板综合症、Quebec综合症和Wiskott-Aldrich综合症)、聚集疾病(例如Glanzmann血小板机能不全或先天性纤维蛋白原缺乏血症)和血小板凝固蛋白相互作用疾病(例如Scott综合症)。
所述方法也可用于治病他/她的血小板已遭受机械损伤例如在冠状旁通手术和/或血液透析中在体外循环期间发生损伤的患者。
Michelson，2002，Platelets，第36章The Clinical Approachto Disorders of Platelet Number and Function，Elsevier Science(USA)，541-545，提供了各种血小板数目和功能病症的综述，其内容在此引用作为参考。
因此本发明提供了如上定义的用于药中的产品。本发明也在用于促进止血的药物的生产中提供了如上定义的产品。
例如，本发明也在用于治疗患有血小板减少疾病例如上面描述的疾病的患者的药物的生产中提供了如上定义的产品。
通过对血细胞的计数来诊断血小板减少。正常的血小板计数是150-400×109/l。低于该范围，主要的止血法会受到削弱，出血时间就会延长。然而通常只在血小板计数低于10×109/l时才会发生自发性的威胁生命的出血。
因此，当其中患者的血小板计数低于400×109/l，优选地低于150×109/l和更优选地低于10×109/l时，可应用上面定义的方法或用途。
血小板减少的最普遍原因是不能从骨髓产生血小板，例如在血癌中或在毒害细胞的化疗或放疗之后。
因此，当患者不能从骨髓产生血小板时，例如因为血癌或毒害细胞的化疗或放疗引起，可应用上面定义的方法或用途。
当患者具有遗传性或药物诱导的血小板功能病症例如上述病症时，可应用上面定义的方法或用途。
当患者的血小板已受到机械损伤时，例如在冠状旁通手术或血液透析中在体外循环期间发生的损伤，可使用上面定义的方法或用途。
上面所用的“治疗”包括在预防中使用上面的产品。因此，例如，可将本发明的产品在进行毒害细胞的化疗或放疗之前、药物诱导血小板功能病症之前、冠状旁通手术或血液透析的体外循环之前给患者施用。
具体实施例方式
在下面的非限定性实施例中进一步描述本发明。
实施例1血纤蛋白原连接的颗粒(FLPs)的生产和被结合的血纤蛋白原的测量1.使用具有由0、3或6个甘氨酸残基构成的间隔子的肽GPRP生产血纤蛋白原连接的微球的一般方法。
(i)在pH7.4的等渗缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐溶液)中制备10mg白蛋白/ml的经洗涤的人白蛋白微球悬浮液。所使用的白蛋白微球的直径适合于静脉内施用，因此小于6μm。合适的白蛋白微球在本领域是公知的。例如，WO 03/015756公开了具有2-3μm直径，pH7.4的白蛋白微球。
(ii)向10mg微球中加入30μl 10mM的5，5-二硫二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)并在室温下混合2小时。然后将微球从上清液中分离并在缓冲液(我们使用磷酸盐缓冲盐溶液)，在3000xg下离心至少5分钟，洗涤至少2次。
(iii)在1ml合适的缓冲液例如磷酸盐缓冲盐溶液中再悬浮沉淀。将由Merck Bioscience s提供的肽(GPRPC、GPRPGGGC或GPRPGGGGGGC)溶解在磷酸盐缓冲盐溶液中，并以终浓度0.23mM加入到微球中。将其在室温下混合24小时。通过用0.23mM L半胱氨酸(半胱氨酸对照)处理制备物来提供合适的负对照。通过在3000xg下离心5分钟并在磷酸盐缓冲盐溶液中再悬浮进行洗涤。重复两次洗涤步骤，然后在1ml体积中进行最后的再悬浮。
(iv)将小瓶的冰冻干燥的血纤蛋白原(例如由苏格兰国家输血机构(Scottish National Blood Transfusion Service)提供的材料)复水并将3mg血纤蛋白原加入至1ml从步骤(iii)获得的白蛋白微球中，在室温下混合1小时。然后将混合物在3000xg下离心5分钟并除去上清液。如前面所述用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤微球3次。将最终的沉淀再悬浮于1ml磷酸盐缓冲盐溶液中。
2.血纤蛋白原的结合测定下面描述证明血纤蛋白原结合至肽连接的微球上的方法，其中使用抗人血纤蛋白原FITC标记的抗体检测与微球结合的血纤蛋白原。
(i)将5μl从上述方法1的步骤(iv)中获得的人造血小板的悬浮液加入至50μl含有1μl针对人血纤蛋白原(DakoCytomation；F0111)的FITC标记的兔抗体的HEPES缓冲盐溶液中。在20℃下温育混合物20分钟。使用空白微球(未用DTNB处理或肽处理)或半胱氨酸对照样品作为这些测定的负对照。
(ii)20分钟后，加入0.5ml盐溶液终止反应。再过10分钟后，在盐溶液中将样品稀释10倍并用流式细胞仪(例如Coulter XL-MCL流式细胞仪)进行分析。
(iii)记录血纤蛋白原阳性的微球的百分比和颗粒的中值荧光强度数据。后者是与微球结合的血纤蛋白原的量的量度并可采用任意的单位(对数等级)。
使用方法2检验用上述方法1制备的产物。具体地，接受检验的产物，作为被结合的肽，具有“肽Glyn＝0”(即GPRPC)、“肽Glyn＝3”(即GPRPGGGC)或“肽Glyn＝6”(即GPRPGGGGGGC)。也包括半胱氨酸对照品。结果记录于下面的表1中。
表1结合至肽连接的微球的血纤蛋白原
结果显示通过在肽和微球之间加入间隔子可修饰含有GPRP N末端序列的肽结合血纤蛋白原的能力。在没有间隔子的情况下，只有6％的微球载有血纤蛋白原，而在具有由3或6个甘氨酸残基构成的间隔子的情况下，超过90％的微球结合血纤蛋白原。
实施例2血纤蛋白原连接的颗粒的进一步分析生产下列产物—产物1使用具有被结合的血纤蛋白原的肽GPRPGGGGGGC(即Glyn＝6)，使用如上所述的实施例1中方法1的步骤(i)至(iv)(除了步骤(iv)使用0.1mg/ml而不是3mg/ml的血纤蛋白原外)生产人造血小板。
产物2使用如上所述的方法1的步骤(i)至(iii)，使用不具有血纤蛋白原的肽GPRPGGGGGGC(即Glyn＝6)生产人造血小板。
参照批次使用WO 98/17319中描述的方法制备微球参照批次。
具体的步骤(i)洗涤1gm微球体并悬浮于50ml 0.01M的磷酸钠缓冲液中，pH6.0。
(ii)将小瓶的冰冻干燥的血纤蛋白原(例如由ScottishNational Blood Transfusion Service提供的材料)复水。
(iii)在pH6.0的0.01M磷酸钠缓冲液中将血纤蛋白原稀释至10mg/ml。
(iv)每克微球加入15ml稀释的血纤蛋白原溶液，并在室温(例如，20℃)下混合4小时。
(v)然后将混合物在20℃、2000xg下离心15分钟以沉淀微球。除去上清液并在0.01M磷酸钠，pH6.0中洗涤沉淀。
(vi)然后离心混合物并再悬浮于0.01M磷酸钠缓冲液中，至少两次，直至在E280下的吸光率确定上清液中蛋白含量较低。
(vii)然后最后一次洗涤微球并再悬浮于10mg/ml磷酸盐缓冲盐溶液中，pH7.4。
(viii)然后将血纤蛋白原包被的微球装入500μl等分试样中并在负70℃下贮藏。
简而言之，产物1是具有通过肽GPRPGGGGGGC结合的血纤蛋白原的本发明的FLP(血纤蛋白原连接的颗粒)，所述肽与微球结合。产物2与产物1相同，除了其没有与肽GPRPGGGGGGC结合的血纤蛋白原。参照产物具有直接结合至微球表面的血纤蛋白原，其以现有技术中已知的方式，例如WO 98/17319和Davies等人(同上)中描述的方式结合。
使用上面实施例1的方法2就血纤蛋白原的结合检验这些产物。结果记录于下面的表2中。
表2与产物1、产物2和微球的参照批次结合的血纤蛋白原
这些结果显示血纤蛋白原包被的微球的相对荧光强度比没有与血纤蛋白原一起温育的微球的要强。产物1显示具有比表1中描述的Glyn＝6产物更低的阳性百分比和MFI值。不受理论的束缚，我们认为差异是由产物1生产中所使用的较低的血纤蛋白原浓度造成的。
为确定血纤蛋白原浓度对本发明的产物的活性的影响，按照上面描述的方法使用DNTB连接GPRPGGGGGGC来制备微球。
向1ml从实施例1的方法1的步骤(iii)获得的微球中以1mg/ml、0.1mg/ml或0.01mg/ml的浓度加入1ml血纤蛋白原并在室温下混合1小时。包括0浓度对照。
在分析中也包括具有与微球表面共价连接的血纤蛋白原的参考批次对照(以上述方式制备的)。
如上所述，通过测量吸光率百分比和中值荧光强度来比较与微球结合的血纤蛋白原。结果显示于下面的表3中。
表3与在不同的血纤蛋白原浓度中温育的本发明的产物、或参照批次微球体结合的血纤蛋白原
这些结果显示依赖于与微球混合的血纤蛋白原的浓度，可将不同量的血纤蛋白原与产物结合。这是基于考虑到结合抗血纤蛋白原抗体的微球百分比和微球的荧光，所述荧光是结合至各微球的血纤蛋白原的量的量度。如可看到的，参照批次中95％的微球对血纤蛋白原是阳性的，中值荧光强度(MFI)为22.4。相比之下，结合在人造血小板上的血纤蛋白原的MFI是12.5(以1mg/ml进行温育时)、4.6(0.1mg/ml)和1.24(0.01mg/ml)。
通过参照校准的标准荧光小珠，例如由Biocytex(例如，用于测量血小板糖蛋白表达水平和任何其它人血小板表面分子的校准活性剂盒，产品号7011，Biocytex，140 Ch.Armeed′Afrique，13010Marseille，France)提供的，可确定分子的绝对数目。
可选择地，使用经修饰的ELISA测定法，利用适合于结合载体组分的抗体作为固相捕获抗体(例如，当载体包含人白蛋白时，那么可使用抗人HAS抗体)，和使用HRP缀合的兔抗人血纤蛋白原抗体检测血纤蛋白原来测量活性剂的血纤蛋白原含量。可使用可溶性的结合至平板的血纤蛋白原作为标准。
实施例3产物活性的估价为确定与本发明的活性剂上的肽结合的血纤蛋白原是否仍能被凝血酶切割从而形成血纤蛋白，可用人凝血酶处理本发明的活性剂。可在经改进的聚集测定法例如基于Levi等人，1999，NatureMedicine，51，107-111的方案中检验通过血纤蛋白-血纤蛋白桥接的本发明的活性剂的交联。下面报道我们所用的方法。
1.用于估价产物对不含血小板的血浆中的凝血酶的反应的方法使用光透射聚集测量仪(我们使用PAP4聚集测量仪(BioDataCorporation))进行测定。将凝血酶加入血浆(不含血小板的)和产物的混合物中。凝血酶切割血浆中和微球上的血纤蛋白原，使相邻的微球之间能够形成血纤蛋白桥。微球的聚集导致光透射增加，可将其作为相对于单独的血浆的“聚集”百分比记录下来。
(i)产物的计数，将参照批次或对照调整至100×103/ml。可使用颗粒计数器例如流式细胞仪(例如Beckman Coulter MCL-XL)或Coulter Z2对微球计数。
(ii)将血液在1500xg下离心30分钟并收集上清液制备不含血小板的血浆。
(iii)将350μl无血小板血浆放入聚集测量仪小杯中并加入50μl空白微球。向在PAP4聚集测量仪中的各等分试样中以3.2u/m加入10、20或40μl凝血酶以达到0.08、0.04或0.02u/ml凝血酶的终浓度。在10分钟时间段内测量光透射的改变。选择单独地产生亚适光透射(即血浆凝固最少的)的凝血酶浓度。一般发现其为20μl。
(iv)将50μl各受试制备物或产物、参照批次或对照微球加入至350μl无血小板的血浆中。测量在最适度以下的凝血酶(如上描述所确定的)存在和不存在的情况下20分钟内的光透射增加。结果记录于表4中。
表4产物1、产物2和参照批次微球在无血小板的血浆中的聚集(4个实验的平均值±sd)
这些结果显示产物1通过凝血酶对结合在表面上的血纤蛋白原的作用被聚集。参照批次通过凝血酶的聚集效率较低，表明存在不能形成有效的血纤蛋白-血纤蛋白交联的较不利的血纤蛋白原构型。
产物1在凝血酶加入后5分钟内显示聚集，而在表面无血纤蛋白原的白蛋白微球(产物2)显示较低的聚集(表4)。不受理论束缚，和产物1相比认为产物2显示降低的聚集是因为认为测定条件使得其在加入凝血酶之前与来自血浆的血纤蛋白原结合的时间不充分。
按照上面描述的相同方法，我们也估价了上面表3中报道的产物(即通过与不同浓度血纤蛋白酶温育产生的)对凝血酶的反应。结果记录于下面的表5中(n＝4)。
表5在不含血小板的血浆中，在不同血纤蛋白原浓度中温育的本发明的产物和参照批次微球的聚集(4个实验的平均值±sd)
这些结果显示对参照批次的最适度以下的凝血酶的反应与使用在分析前未与血纤蛋白原结合的肽时看到的相当。在具有被连接至肽上的血纤蛋白原的产物中，在使用0.1mg/ml血纤蛋白原(其表现4.6的MFI)制备的样品中反应最大。
除了作为凝血酶对结合的血纤蛋白原的作用的量度外，使用商业可购得的由American Diagnostica提供的ELISA方法可就血纤肽A对释放的材料进行分析。
可证明血小板替代物的组成在药物活性方面是有效的。可证明被固定的血纤蛋白原在与血小板相互作用方面表现出与可溶性血纤蛋白原相同或相似的特征。下面描述了证明产物优先与活化的血小板(即只在激动剂例如ADP或凝血酶存在的情况下)相互作用的方法。
2.在特定的体外测定中对本发明的候选活性剂制备物的活性的估价可使用许多良好定义的体外测定法评估本发明的活性剂与血小板和止血系统相互作用的不同方面，即血小板聚集、血小板活化、在流动条件下血小板依赖性血栓的形成和粘附、凝血酶的产生和纤维蛋白溶解作用。
使用新鲜的局部地从正常的志愿者获得的血小板。通过21号蝴蝶针头进行洁静的静脉穿刺将血液收集入抗凝剂(通常是柠檬酸三钠)或抗凝柠檬酸葡萄糖(ACD)中，尽可能快地使用，优选地在15分钟内，更优选地在10分钟内进行收集以避免在检验之前在体外发生血小板的激活。为研究本发明的活性剂在具有低血小板计数的血液中的效应，如下所述，通过离心消耗血小板并在自体血浆中重构血液。
为人工地消耗正常血液中的血小板，可将血液在室温下在150xg下离心20分钟。取出富含血小板的血浆，并用从在1800xg下离心30分钟的分开的试管中的血液制备的自体血浆进行稀释。然后将血小板贫化的血浆加回至富含血小板的血浆中并小心地混合。也可将该血小板被消耗的血浆加回至自体红细胞中以制备血小板减少的全血。通过这种方法使原始血小板计数减少大约65至95％。使用血细胞计数器例如ACTDiff；(Beckman-Coulter)测量所有样品中的血小板计数。
下面描述我们使用的方法。
3.在实验室中制备“血小板减少的血液”的方法3.1血小板被消耗的全血的制备(i)通过21号蝴蝶针头进行洁静的静脉穿刺将两试管的血液收集入柠檬酸三钠抗凝剂中。在10分钟内收集血液以使体外血小板的活化降到最低。
(ii)将一个试管的血液在150xg、20℃下离心20分钟以制备富含血小板的血浆(PRP)。
(iii)将第二个试管的血液在1500xg、20℃下离心30分钟以制备血小板贫化的血浆(PPP)。
(iv)将PRP从血细胞部分除去并用PPP取代。通过该方法将血小板计数减少大约75％以获得大约50×106个血小板/ml的计数。
(V)使用几个血液试管可制备更大体积的血小板被消耗的血液。
3.2 血小板被消耗的血浆的制备(i)通过21号蝴蝶针头进行洁静的静脉穿刺将两试管的血液收集入柠檬酸三钠抗凝剂中。在10分钟内收集血液以使体外血小板的活化降到最低。
(ii)将一个试管的血液在150xg、20℃下离心20分钟以制备富含血小板的血浆(PRP)。
(iii)将第二个试管的血液在1500xg、20℃下离心30分钟以制备血小板贫化的血浆(PPP)。
(iv)从血细胞部分取出PRP与PPP混合以获得10至50×106个血小板/ml的血小板计数。
(v)使用几个血液试管可制备更大体积的血小板被消耗的血浆。
可按照例如本领域已知的方法，例如Janes等人，Thrombosis &Haemostasis，1993，70，659-666中描述的方法通过测量血浆血纤蛋白原与活化的GPIIb-IIIa的结合来检验通过这两个方法获得的血液或血浆中剩余的血小板以确保血小板在制备过程中没有被激活。
4.本发明的活性剂对血小板聚集的估价该方法可用于显示本发明的活性剂只在激动剂存在的情况下才增加血小板聚集。可利用Beckman Coulter MCL-XL流式细胞仪和ACTDiff细胞计数器以及PAP4 Bio/Data Corporation血小板聚集检测仪测量全血中、富含血小板的血浆(PRP)中、血小板被消耗的全血或血小板被消耗的血浆中血小板的聚集。可确定自发性聚集(在激动剂不存在的情况下)或在激动剂例如ADP(腺苷二磷酸)、TRAP(凝血酶受体激活肽)和CRP(胶原蛋白相关性肽)存在的情况下的聚集，并且可将其与用和不用受试微球的情况下，例如在搅拌系统中获得的结果进行比较。
例如，可将本发明的活性剂加入至富含血小板的血浆或加入至血小板被消耗的血浆中，并在37℃下搅拌温育。通过在聚集测量仪例如PAP4中测量光透射的增加可测量聚集速率和百分比。
下面描述用于研究在激动剂存在和不存在的情况下人造血小板与血小板相互作用的示例性方法。
4.1通过在流式细胞仪中计数测量聚集的方法可用流式细胞仪对剩余的单个血小板进行计数，从而可计算已与人造血小板结合的血小板的百分比。通过前向和侧向散射分析样品并将电子门控设置在单个血小板群体周围。为此，使用含有EDTA的富含血小板的血浆的样品以防止血小板-血小板聚集发生。用荧光缀合的抗体例如结合所有血小板上的GPIb受体的CD42b单克隆抗体标记血小板。通过该方法，在血小板门中CD42b阳性事件的数目给出了血小板数目的精确测量，特别是当样品含有人造血小板时(所述人造血小板不结合CD42b抗体)。
当聚集发生时，门内的血小板数目下降。人造血小板不应当诱导非活化(“静息”)血小板聚集。然而，如果血小板被活化，例如被ADP活化，其应当在与人造血小板聚集。在该测定法中，使用亚适浓度的ADP区分血小板缺乏的血浆中的人造血小板的效应。
(i)为设置血小板门，使用被收集到EDTA中的全血。将5μl用EDTA抗凝固的血加入至50μl Hepes缓冲盐溶液中并在流式细胞仪中(例如，Beckman Coulter MCL-XL)通过前向和侧向散射进行分析。将门设置在血小板群体周围以使＞98％的单个血小板包含在血小板门内。
(ii)将400μl具有10-60×106/ml血小板计数的血小板被消耗的血浆与20μl 10mg白蛋白/ml的对照微球(如实施例1，方法1(i)中公开的空白胶囊)混合，并以1和4×10-5M之间的终浓度加入ADP。在聚集测量仪小杯中在900rpm、37℃下搅拌样品达10分钟，并以光透射的变化(如在下面的4.2部分中描述的)测量聚集。随后使用产生＞0％和＜20％聚集的ADP浓度分析产物与血小板被消耗的血浆的相互作用。我们发现ADP浓度为2×10-5M是合适的。
(iii)为检验产物，将400μl具有血小板计数为10-60×106/ml的400μl血小板被消耗的血浆与20μl 10mg白蛋白/ml的受试微球和如上所述确定浓度的ADP混合。将样品在900rpm下搅拌达10分钟。在合适的时间点上取出5μl等分试样如下进行流式细胞计量分析。
(iv)为进行分析，将5μl受试样品加入至50μl Hepes-缓冲盐溶液中，所述缓冲液含有合适浓度的荧光缀合的抗存在于所有血小板上的抗原的抗体。我们使用1μl RPE缀合的CD42b单克隆抗体(我们使用由BD Pharmingen提供的抗体555473)。将样品在室温下(通常20℃)下温育20分钟，然后用0.5ml甲酰盐溶液(0.9％ NaCl中的0.2％福尔马林)稀释。
(v)然后通过使用设置在对照样品中的血小板群体周围的门(参见4.1.i)，使固定体积的样品(例如20μl)通过细胞仪，利用流式细胞仪(例如Beckman Coulter MCL-XL)中的前向和侧向散射分析稀释的样品。对关闭在血小板门中的颗粒进行荧光分析以确定门内单个血小板的数目。使用缀合至相同荧光染料(来自BD Pharmingen的RPE-mouse IgG1κ)的抗血小板抗体的同型对照来设置用于荧光分析的负对照。
(vi)记录来自血小板门的单个血小板(即CD42b阳性颗粒)的损失百分比数据。结果显示于下面的表6中。
表6在血小板被消耗的血浆中产物1、产物2和微球的参照批次的聚集(3个实验的平均值±sd)
这些结果显示产物1在血小板被消耗的血浆中提供比在只有血小板的情况下看到的显著更高程度的被活化的血小板的聚集，但在缺少ADP的情况下，其不会使无活性的血小板的聚集增加。相反地，参照批次，基本上按WO 98/17319中的教导制备的，在静息(无活性的)和活化的血小板中都产生相似和显著水平的聚集。
可使用相同的方法举例说明肽偶联的微球也可使用存在于血浆中的血纤蛋白原聚集血小板。在该例子中，肽偶联的微球在ADP不存在的情况下只产生17.8±3.5％的聚集，而当血小板已被ADP激活时，产生57.3±9.3％的聚集。
按照上述相同的方法，我们也估价了在ADP存在和不存在的情况下，上面表3中报道的产物(即通过与不同浓度血纤蛋白原温育产生的)对血小板被消耗的血浆的聚集的影响。结果显示于下面的表7中(n＝3)。
表7在血小板被消耗的血浆(PDP)中，与不同浓度血纤蛋白原温育的本发明的产物和微球的参照批次的聚集
这些结果显示用表现4.6的MFI的样品获得最高的结果，65.6％的聚集。相反地，参照批次在活化的血小板中只诱导了50％的聚集，该结果也在ADP不存在(即，也在无活性的血小板中)的情况下观察到。
从这些数据我们得出结论在与微球连接的血纤蛋白原的量与微球的活性之间可能不存在简单的线性关系。此外，尽管事实上参照批次产物表现高血纤蛋白原含量，但其没有本发明的人造血小板的活性高。
如果将本发明的活性剂加入至全血，也可通过计数剩余的血小板(例如在流式细胞仪中)来测量聚集的速率或％。
4.2使用PAP-4血小板聚集测量仪通过光透射测量聚集的方法在该系统中，将产物与血小板被消耗的血浆在搅拌系统中在9000rpm下混合，通过光透射的变化测量聚集。
(i)将400μl血小板被消耗的血浆与20μl 10mg白蛋白/ml的空白微球混合。
(ii)以1和4×10-5M之间的浓度加入ADP。
(iii)通过将自体血浆的聚集值设置为100％，在20分钟内测量聚集并记录为最大的百分比。
通过使用上述方法，如聚集测量仪所测量的，在血小板被消耗的血浆中，产物1、产物2和微球的参照批次聚集的检验结果显示参照批次在ADP不存在的情况下产生高度聚集，而产物1和2在ADP不存在时只显示低水平的聚集。此外，当加入ADP后，产物1显示显著更高水平的聚集。
一般地，本发明的活性剂，当通过这些方法检验时，显示使活化的血小板的聚集增加比使如上定义的未被活化的血小板的聚集增加更大。对于产物1，这一点在表6和表7中得以说明。
5.本发明的活性剂和血小板相互作用的流式细胞计量分析。
可使用Coulter Epics XL MCL流式细胞仪检查血小板和本发明的活性剂之间相互作用的化学计量关系，并测定本发明的活性剂是否导致血小板活化，如在外源刺激不存在的情况下通过表面抗原(例如P选择蛋白)的变化所证明的。P选择蛋白是血小板脱粒的标记，从而是血小板活化的标记。
将本发明的活性剂加入至全血中，并在具有和不具有外源激动剂例如ADP、TRAP和CRP的情况下，以受控制的方式混合。在含有荧光缀合的单克隆抗体的HEPES缓冲盐溶液中稀释这些混合物的等分试样并进行温育以使其与抗体结合。例如，可利用从BD Biosciences，Oxford，UK商购的R-藻红蛋白(RPE)缀合的抗人GPIb小鼠单克隆抗体(Cy5RPE)和FITC标记的抗人血清白蛋白多克隆抗体(AutogenBioclear Ltd)分别鉴定血小板和本发明的活性剂以及在激动剂刺激存在和不存在的情况下测量血小板和本发明的活性剂之间的相互作用。此外可使用FITC缀合的、针对血小板活化标记物的单克隆抗体显示血小板(游离的或与本发明的活性剂结合的)是否被激活。可使用单克隆抗体PAC-1测量GPIIb-IIIa复合物的活化(血小板聚集的前提)，所述单克隆抗体PAC-1识别在血小板血纤蛋白原受体(BectonDickenson Immunocytometry Systems)处或附近的被活化的血小板的GPIIb/IIIa复合物上的表位。可选择地，特异性针对血小板P选择蛋白的单克隆抗体可用作血小板脱粒的标记物(Serotec)。
在与相关抗体一起温育后，在流式细胞仪上测量荧光。一般地，如上所述，如通过PAC-1单克隆抗体或P选择蛋白结合所测量的，本发明的活性剂产生相对较少的血小板活化。在一个实施方案中，术语“相对较少的”是指本发明的活性剂导致比如上定义的现有技术的血小板替代物低的血小板活化。
6.在高剪切速率流动的条件下本发明的活性剂与血小板的相互作用的研究可使用平行板输血室(Parellel Plate Perfusion Chamber)研究在流动条件下，使用可变的剪切速率，本发明的活性剂与血小板的相互作用。
作为对照，当正常血液样品以不同的剪切速率灌流过内皮下基质或胶原蛋白基质(Levi等人，1999，Nature Medicine，51，107-111)时观察到表面覆盖。然后使用相同的方案但使用如上所述制备的血小板被消耗的样品观察表面覆盖。和正常血液样品相比，表面覆盖在血小板被消耗的样品中应当减少。当被加入至血小板被消耗的样品中时，本发明的活性剂优选地能够增加表面覆盖。
当以足以在化学计量上替代被消耗的血小板的数目向血小板被消耗的样品中加入本发明的活性剂时(即如上所述制备的血小板被消耗的样品被减少至血小板计数大约为未消耗的样品的25％为进行该检验，以足以使剩余的血小板和本发明的活性剂的总数目基本上回复至未消耗的样品中原始血小板计数的100％的数目加入本发明的活性剂)，那么如果本发明的活性剂能够在缺少血小板的样品中将表面覆盖增加至基本上与在相同流动条件下观察到的正常血液的表面覆盖水平相当(例如50、60、70、80、90或100％)或甚至更高的水平则是特别优选的。
可通过显微镜确定由血小板沉积或血小板和本发明的活性剂的组合产生的表面覆盖程度。
实施例4体内模型中FLPs的评估1.血小板减少的兔模型中的剂量相关性止血活性从著名的供应商购得2.5-3.0kg(大约4个月大小)的雄性新西兰白兔。分别在研究前的12天和9天使用两剂二甲磺酸丁酯使成组的6只兔子产生血小板减少症。根据所需要的血小板减少的严重度改变二甲磺酸丁酯的剂量，例如两剂20mg/kg一般可将血小板计数减少至10-20×109/l，而两剂25mg/kg可将血小板计数减少至少于10×109/l。除了减少血小板计数以外，二甲磺酸丁酯剂量还与白细胞的消耗相关，但只引起血细胞比容少量减少并且无明显毒性。该过程不需要使用麻醉剂。
人血小板浓缩物用作这些研究的正对照。这要求每组动物只用一种血小板浓缩物。前面已显示由于被网状内皮系统吸收，人血小板在兔子中只能循环大约5分钟。因此在这些实验中，在研究开始之前24小时给兔子服用棕榈酸乙基酯以抑制巨噬细胞功能。为了保持一致，对所有组的动物使用棕榈酸乙基酯处理。
在研究开始的当天，将受试活性剂经静脉内注入耳静脉内。通过测量出血时间评估功效，其可使用耳部的标准(Simplate)切割来进行。
通过确保动物安静和温暖和处于恒温(Roskam，1993，ComptesRendus des Séances de la Societé de Biologie，114，166-169)，尽可能控制出血时间的变化性和使血液样品的数量减少到最少。Blajchman & Lee，1997，Transfusion Medical Reviews，11，99-105。在即将施用受试药剂之前和在服药后24小时内的4个时间点上测量出血时间。通过对伤口施压止住超过20分钟的出血时间。在研究完成后处死动物。
将通过出血时间的减少所定义的血小板替代物的剂量相关性活性与人血小板的活性(以剂量/kg为基础)进行比较。相同大小但不具有偶联肽的HAS微粒用作负对照。也进行在24小时研究周期内的作用持续时间的比较。
在血小板减少的兔子中，大约20分钟的出血时间是典型的。本发明的血小板替代物通常能够在成组的6只受试兔子中的最少3只、优选地全部6只中将出血时间减少至少于10分钟。
2.在兔子Wessler模型中，本发明的活性剂的血栓形成性的估价基本上如Wessler等人，1959，Journal of Applied Physiology，14，943-946中所描述的(但包括适合于血小板替代物的对照)，在Wessler模型中估价候选FLP制备物的潜在血栓形成性。通过考虑从体外方法获得的数据来定义对照。
从被认可的供应商购得体重为2.5-3.0kg(大约4个月大小)的雄性新西兰白兔并麻醉成组的6只兔子。暴露左和右颈静脉段并从周围组织中分离出来。通过耳静脉施用受试制备物并在3分钟循环期后，将颈静脉段结扎并在原位再放置10分钟。小心地切开节段，暴露出内腔。检查血管中是否存在产生的血栓，通过目视对其打分。
本发明的血小板替代物不应当在高于与最优的出血时间减少关联的剂量5倍、优选地10倍的剂量下产生血栓。
合适的剂量可以是每kg患者体重1×108至2×1010产物颗粒。例如，剂量(当表示为每kg体重的产物颗粒数目时)可以是大约2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010或2×1010。
合适的剂量也可以表示为每kg患者体重总蛋白的毫克数。在这个基础上，合适的剂量可以是5-200mg/kg之间。例如，剂量可以是大约5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、150或200mg/kg。
理想的剂量具有至少两倍、优选地大约10倍的安全界限。换句话说，理想的剂量是有效的但即使增加2倍或大约10倍仍保持安全的剂量。使用如上所述的Wessler检验，安全剂量不会形成凝块。
权利要求
1.包含活性剂的可注射的药物产品，所述活性剂包含与肽结合的不溶性载体，所述肽能够结合血纤蛋白原，这样所述活性剂通过被结合的血纤蛋白原优先于无活性的血小板与被活化的血小板结合，其中所述肽不是血纤蛋白原。
2.权利要求1的产品，其中如果经静脉内导入所述产品，那么所述肽结合血纤蛋白原，这样被结合的血纤蛋白原优选地在血小板已被激活的伤口部位开始参与血凝块的形成。
3.权利要求1或2的产品，其中所述肽包含从血小板膜糖蛋白GPIIb或GPIIIa获得的血纤蛋白原结合序列，例如序列TDVNGDGRHDL或该序列的变体。
4.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述肽包含TDVNGDGRHDL。
5.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述肽在氨基末端包含Gly-(Pro/His)-Arg-Xaa序列，其中Xaa是任意氨基酸。
6.权利要求5的产品，其中Xaa是Pro、Sar、Gly或Val。
7.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述肽具有4至200个氨基酸。
8.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述载体具有适合于确保通过肺毛细血管床运送所述活性剂的大小。
9.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述载体是微粒。
10.权利要求11的产品，其中所述微球是蛋白微粒，例如白蛋白微粒。
11.权利要求8至10中任一项的产品，其中所述产品包含载体群体，在该群体中少于2％载体的最大尺寸超过6μm。
12.权利要求8至11中任一项的产品，其中大多数载体的最大尺寸为2至4μm。
13.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述肽通过共价键与所述载体结合。
14.权利要求13的产品，其中所述肽包含半胱氨酸并通过将半胱氨酸的-SH基与所述载体上的巯基反应基连接与所述载体结合。
15.前面的权利要求中任一项的产品，其中所述产品额外地包含具有可诱导的血小板聚集活性、被结合至所述肽的血纤蛋白原或其变体或片段。
16.权利要求15的产品，其中所述血纤蛋白原(或变体或片段)通过非共价键与所述肽结合。
17.权利要求15或16的产品，其中所述血纤蛋白原(或变体或片段)通过共价键与所述肽结合。
18.一种可注射的具有可诱导的血小板聚集活性的药物产品，其包含不溶性载体，所述血纤蛋白原或其变体或片段以使所述血纤蛋白原优先于无活性的血小板与被活化的血小板结合的构型与所述载体结合。
19.权利要求18的产品，当其通过静脉内导入后，将只在血小板已经被激活的伤口部位明显地参与血凝块的形成。
20.用于制备如权利要求15至19中任一项所定义的产品的方法，其包括提供权利要求1至14中任一项的产品并与血纤蛋白原或其变体或片段混合，和任选地进一步包括一步或多步下列步骤一(a)除去未结合的血纤蛋白原；(b)用药物可接受载体或稀释剂配制所述产品；(c)稀释所述产品以提供药物可接受的单位剂量；和(d)给所述产品灭菌，或在从步骤(a)至(c)中确保产品无菌。
21.在个体中促进止血的方法，其包括给所述个体施用药物有效剂量的如权利要求1至19中任一项所定义的产品。
22.治疗患有血小板减少症的个体的方法，其包括施用药物有效剂量的如权利要求1至19中任一项所定义的产品。
23.权利要求1至19中任一项所定义的用于药物的产品。
24.权利要求1至19中任一项所定义的产品在生产用于促进止血的药物中的用途。
25.权利要求1至19中任一项所定义的产品在生产用于治疗患有血小板减少症的患者的药物中的用途。
26.权利要求21至25中任一项的方法或用途，其中所述患者具有低于400×109/l，优选地低于150×109/l的血小板计数。
27.权利要求26的方法或用途，其中所述血小板计数低于10×109/l。
28.权利要求21至27中任一项的方法或用途，其中所述患者不能从骨髓产生血小板。
29.权利要求28的方法或用途，其中所述不能从骨髓产生血小板是由血癌或具有细胞毒性的化疗或放疗导致的。
30.权利要求21、23或24中任一项的方法或用途，其中所述患者具有遗传性或药物诱导的血小板数目或功能上的病症。
31.权利要求21、23或24中任一项的方法或用途，其中所述患者的血小板已被机械损伤。
全文摘要
本发明提供可注射的包含活性剂的药物产品，所述活性剂包含与肽结合的不溶性载体，所述肽能够结合血纤蛋白原，从而所述活性剂通过被结合的血纤蛋白原优先于无活性的血小板与被活化的血小板结合，其中所述肽不是血纤蛋白原。
文档编号A61P7/04GK1863560SQ200480029425
公开日2006年11月15日 申请日期2004年10月7日 优先权日2003年10月7日
发明者A·H·古道尔, S·M·泰勒 申请人:哈莫斯塔蒂斯有限公司