与炎性疾病的治疗功效相关的遗传多态性的用途的制作方法

专利名称：与炎性疾病的治疗功效相关的遗传多态性的用途的制作方法
技术领域：
本发明一般性地涉及对组织样品的体外分析试验，更具体地涉及用作为炎性疾病的治疗功效的生物标志物的遗传多态性的分析。
相关技术的说明特应性皮炎(AD)又称之为湿疹，是一种炎症性皮肤病，通常在婴幼儿和儿童期出现的搔痒性红肿皮肤为典型特征。这种病在西方国家是最常见的皮肤病，多达20％的五岁以下儿童都患过此病。Cookson WO等人，《自然遗传学》(Nature Genetics)27372-373(2001).
吡美莫司(Pimecrolimus)(商品名爱宁达Elidel)是一种子囊霉素的大环内酰胺衍生物，专门开发用于治疗炎性皮肤病。他克莫司(Tacrolimus)(FK506；商品名普特彼Protopic或普乐可复Prograf)为同类化合物的一员，也被用于治疗炎性皮肤病。吡美莫司与他克莫司均干扰炎性过程，这是通过与巨菲蛋白-12(macrophilin-12)高亲和力结合并抑制钙调磷酸酶实现的，这阻碍了T淋巴细胞中Th1和Th2类细胞因子的转录。尽管吡美莫司与他克莫司结构上相似且具有对等的作用机制，但吡美莫司对于皮肤的亲和力要比他克莫司更高。
人们长期以来就已认识到遗传过敏性疾病存在着的遗传基础。业已进行了若干连锁分析以查明促成特应性皮炎的易感区，正如Maclean JA &Eidelman FJ，《皮肤病学文献》(Arch Dermatol)1371474-1476(2001)中所综述的那样。据认为至少有5个染色体区域(3q21、5q31-33、11q13、13q12-14及14q11.2)含有特应性皮炎易感基因座。目前认为，遗传过敏性机制是特应性皮炎的主要发病机理，不过，与皮肤炎症有关的其他基因可能也促成了该病情。Cookson WO等人，《自然遗传学》(Nature Genetics)27372-373(2001)。
目前，在局部施用大环内酰胺类药物(吡美莫司或他克莫司)的患者中，反应率小于50％。尚不知为什么有些患者对这些药物不起反应。可见本领域仍然需要改善局部施用大环内酰胺类药物的功效，例如可以这样实现即通过将合适的药物制剂靶向在遗传上倾向于反应并得益于此治疗的炎性疾病患者。
发明概述本发明提供了治疗特应性皮炎的方法，此方法基于对患者TNF等位基因的测定。在一个实施方案中，测试患者(-1031)TNF多态性的存在以决定什么样的治疗最为适合。在该基因座上具有TT等位基因(SEQ IDNO1)的患者用吡美莫司乳膏或软膏治疗，而具有CC等位基因(SEQ IDNO2)或CT等位基因(SEQ ID NO1和2)的患者用更高剂量的吡美莫司乳膏，用吡美莫司乳膏加其他抗炎药，或者用抗炎药而不用吡美莫司乳膏治疗。
本发明也提供了常规的用于治疗银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或任何为吡美莫司(口服、局部施用或其他)适应症的紊乱的方法，此方法基于对患者TNF等位基因的测定。在一个实施方案中，测试患者(-1031)TNF多态性的存在以决定什么样的治疗最为适合。在该基因座上具有TT等位基因的患者用吡美莫司治疗，而具有CC等位基因及CT等位基因的患者被给予更高剂量的吡美莫司，吡美莫司加其他抗炎药，或者抗炎药而无吡美莫司。
本发明还提供了用于治疗银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或任何为吡美莫司(口服、局部施用或其他)适应症的紊乱的方法，此方法基于对患者LTA等位基因的测定。在一个实施方案中，测试患者ASN60THR LTA基因座多态性的存在以决定什么样的治疗最为适合。在该基因座上具有AA等位基因(SEQ ID NO3)或AC等位基因(SEQ IDNOS3和4)的患者用吡美莫司治疗，而具有CC等位基因(SEQ ID NO4)的患者被给予更高剂量的吡美莫司，吡美莫司加其他抗炎药，或者抗炎药而无吡美莫司。
本发明也提供了用于治疗银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或任何为他克莫司(口服、局部施用或其他)适应症的紊乱的方法，此方法基于对患者CCR2等位基因的测定。在一个实施方案中，测试患者VAL64ILE CCR2基因座多态性的存在以决定什么样的治疗最为适合。在该基因座上具有GG等位基因(SEQ ID NO5)的患者用他克莫司治疗，而具有AG等位基因(SEQ ID NO5和6)的患者被给予更高剂量的他克莫司，他克莫司加其他抗炎药，或者抗炎药而无他克莫司。
本发明提供了用于治疗特应性皮炎或任何为吡美莫司(口服、局部施用或其他)适应症的紊乱的方法，其中在决定什么样的治疗最为适合之前，测量患者中存在着的TNF-α蛋白或mRNA水平。在一个实施方案中，当患者体液或非炎症组织样品中的TNF-α蛋白或mRNA水平低或者正常时，则用吡美莫司治疗该患者。在另一个实施方案中，当TNF-α蛋白或mRNA水平升高时，则用吡美莫司联合其他抗炎药治疗该患者，或用备选的疗法治疗。
本发明还提供了确定个体病情治疗策略的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司适应症的病情，所述方法包括分析由该个体获得的样品中的TNF-αmRNA或TNF-α蛋白水平；并且其中的治疗策略包括当样品中的TNF-αmRNA或TNF-α蛋白水平低或者正常时，选择吡美莫司制剂用作治疗；或者，当样品中的TNF-αmRNA或TNF-α蛋白水平升高时，选择(A)与其他免疫抑制剂联合的吡美莫司制剂或(B)其他免疫抑制剂用作治疗。优选地，所述样品取自非炎症组织。
本发明提供了选择个体以纳入炎性皮肤病或任何其他为吡美莫司适应症的紊乱的临床试验的方法，其中在将候选个体纳入临床试验之前，询问其(-1031)TNF基因座、ASN60THR LTA基因座或VAL64ILE CCR2基因座上的遗传多态性。
本发明提供了用于确定患有炎性皮肤病或任何其他为吡美莫司适应症的紊乱的患者的治疗策略的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒含有用于测定由待治疗个体获取的样品中的TNF-α蛋白或mRNA水平的试剂；在另一个实施方案中，试剂盒含有用于确定个体TNF、LTA或CCR2基因的基因型的试剂。试剂盒中也含有说明生物标志物在确定病情治疗策略中的用途的书面制品。
本发明还提供了确定个体病情的治疗策略的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司适应症的病情，所述方法包括分析个体来自TNF基因簇的遗传座位上的基因型，所述遗传座位表明了选定的大环内酰胺制剂在治疗所述病情中的功效。优选地，基因型是通过分析由所述个体获取的样品确定的。在一个实施方案中，测试个体/患者(-1031)TNF多态性的存在以确定适合的治疗策略。对于在该基因座上具有TT等位基因(SEQ ID NO1)的患者，选择吡美莫司用作治疗，而对于具有CC等位基因(SEQ ID NO2)或CT等位基因(SEQ ID NO1和2)的患者，选择更高剂量的吡美莫司，吡美莫司加其他抗炎药，或抗炎药而无吡美莫司用作治疗。本发明的另一个实施方案确保所述治疗策略基于患者LTA等位基因的测定。在优选的实施方案中，测试患者ASN60THR LTA基因座多态性的存在以确定治疗策略。对于在该基因座上具有AA等位基因(SEQ ID NO3)或AC等位基因(SEQ ID NO3和4)的患者，选择吡美莫司用作治疗，而对于具有CC等位基因(SEQ ID NO4)的患者，选择更高剂量的吡美莫司，吡美莫司加其他抗炎药，或抗炎药而无吡美莫司用作治疗。所述抗炎药优选选自氢化可的松、环孢霉素、他克莫司和西罗莫司。
本发明提供了确定患有特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司适应症的病情的个体/患者的治疗策略的另一方法，该方法基于对患者CCR2等位基因的测定。在一个实施方案中，测试患者VAL64ILE CCR2基因座多态性的存在以确定适合的治疗策略。对于在该基因座上具有GG等位基因(SEQ ID NO5)的患者，选择他克莫司用作治疗，而对于具有AG等位基因(SEQ ID NO5和6)的患者，选择更高剂量的他克莫司，他克莫司加其他抗炎药，或抗炎药而无他克莫司用作治疗。所述抗炎药优选选自氢化可的松、环孢霉素、吡美莫司和西罗莫司。
本发明也提供了吡美莫司在制备治疗选定的患者群体的炎性疾病的药物中的用途，其中该患者群体是基于这些患者来自TNF基因簇的遗传座位上的基因型选定的，所述遗传座位表明了吡美莫司在炎性疾病治疗中的功效。在一个实施方案中，选定的患者群体的基因型包括(-1031)TNF多态性的存在。优选地，所选定的患者群体在该基因座含有TT等位基因。在另一个实施方案中，所选定的患者群体含有ASN60THR LTA基因座多态性。优选地，所选定的患者群体在该基因座含有AA或AC等位基因。
此外，本发明提供了他克莫司在制备治疗选定的患者群体的炎性疾病的药物中的用途，其中该患者群体是基于这些患者CCR2遗传座位上的基因型选定的，所述CCR2遗传座位表明了他克莫司在炎性疾病治疗中的功效。在一个实施方案中，所选定的患者群体含有VAL64ILE CCR2基因座多态性。优选地，所选定的患者群体在该基因座含有GG等位基因。
从而本发明提供了改善局部施用的大环内酰胺类药物尤其是吡美莫司的功效的方法，该方法是这样实现的即通过鉴定待治疗个体的功效生物标志物，然后将合适的大环内酰胺制剂靶向能够最佳地起反应并得益于所述治疗的那些个体。
附图的简短说明

图1为6号染色体(ch)上主要组织相容性复合体(MHC)的示意图，显示了LTA(编码淋巴毒素α的基因)和TNF(编码肿瘤坏死因子α的基因；TNF-α)在MHC中的布局。其下更为详细显示的是包含TNF基因簇的6p21.3区域。*表示多态性，如文中所讨论的，其间隔约为2.5kb。该图选编自Field M，《医学季刊》(Q JMed)94237-246(2001)。
优选实施方案的说明1％吡美莫司乳膏治疗特应性皮炎的功效与6p21.3上TNF基因簇中的多态性标志物有关，而0.03％他克莫司软膏治疗的功效与此无关。该发现提供了利用与吡美莫司治疗功效相关的遗传多态性来确定最有效的治疗的方法。
所述遗传座位是在经设计为1％吡美莫司乳膏和0.03％他克莫司软膏碰头比较的IIIb期试验中鉴定到的。为期六周的关于患中度特应性皮炎的儿科个体的研究者盲法试验探究了由两种局部大环内酰胺药物诱发的局部用药部位反应的发生率、及其功效、安全性和美容可接受性。收集临床试验中知情同意参与者的血样进行药物遗传学分析，以查明对任一治疗有反应遗传基础。
选定进行药物基因组学分析的基因有编码淋巴毒素α(LTα)的LTA和编码肿瘤坏死因子α(TNF-α的TNF。LTA和TNF基因串联地位于6p21.3中富含基因的MHCIII区(见图1)。这两种基因都包含多种多态性，其中有些业已被充分地进行了表征，如Field M，《医学季刊》(Q JMed)94237-246(2001)所综述的那样。LTA和TNF的基因产物都是参与炎性过程的细胞因子。两种细胞因子都通过TNF-α受体进行信号传导，该TNF-α受体在许多不同的组织中表达，包括皮肤。Rulls SR & Sedgwick JD，《美国人类遗传学杂志》(Am J Hum Genet)65294-301(1999)。此外，LTA和TNF都牵涉到遗传过敏性疾病的发病机理。这些基因的多态性都与遗传过敏症尤其是哮喘相关。Trabetti E等人，《医学遗传学杂志》(JMed Genet)36323-5(1999)；Izakovicaova Holla L等人，《临床与试验过敏症学》(Clin Exp Allergy)91418-23(2001)；Castro J等人，《过敏症临床免疫学研究杂志》(JInvestig Allergol Clin Immunol)3149-5(2000)；Li Kam Wa TC等人，《临床试验过敏症》(Clin Exp Allergy)291204-8(1999)；以及Zhu S等人，《美国呼吸道与危重症监护医学杂志》(Am JRespir Crit Care Med)1611655-9(2000)。有关TNF-α在皮肤炎症中的作用已经有很深入的研究。皮肤的肥大细胞和角化细胞都产生TNF-α。尽管TNF-α在皮肤中的表达是组成型的，但其表达水平可受多种刺激物的进一步诱导。在银屑病的皮肤病变中，TNF-α的水平增高，并且有许多报道表明调节TNF-α功能的药物可有效地治疗银屑病，如LaDuca JR &Gaspari AA，《皮肤病临床》(Dermatol Clin)19617-635(2001)和MeasePJ，《风湿病年刊》(Ann Rheum Dis)61298-304(2002)所综述的那样。尽管银屑病与特应性皮炎有明显不同，但两种疾病的表达都受到调节皮肤炎症的基因的影响。Cookson WO等人，《自然遗传学》(Nature Genetics)27372-373(2001)。
在临床试验和随后的药物基因组学分析中，在用吡美莫司乳膏制剂局部治疗的患特应性皮炎的儿科个体(年龄2-17岁)中，发现了吡美莫司功效与(-1013)TNF多态性的相关性。与吡美莫司功效相关的多态性定位于该基因自转录起始位点计的-1031处，由野生型的T变成了C。此试验中仅有的见效的个体在(-1031)TNF处具有TT基因型(SEQ IN NO1)。在该基因座具有C等位基因(CC(SEQ IN NO2)或CT(SEQ IN NO1和2))的患者没有对吡美莫司起反应的。这种相关性对于他克莫司不成立。
对于在相同染色体区的第二个SNP，ASN60THR LTA，数据也表明了具有显著意义的所述趋势。
能够合理地预期这些相关性在所有年龄组和其他炎性皮肤病个体中也成立。而且，当吡美莫司配制为片剂或气雾剂时，其功效也能够合理地推断出来。该方法可用于脊椎动物个体，特别是哺乳动物个体，而且对于人类个体更尤为如此。
携带多态性目的等位基因(例如来自TNF基因簇的基因TNF和LTA)的个体可以使用多种本领域众所周知的技术在DNA、RNA或蛋白质水平上予以检测。例如，鉴定和检测的策略在EP 730,663、EP 717,113和PCTUS97/02102中有描述。本发明的方法可以包括以前表征过的多态性的检测，其中某位点上存在着的基因型分析的分布和多态型的性质早已被确定(见上文关于LTA和TNF基因的讨论)。利用这些信息使得设计成组的探针特异性地鉴定已知的多态型成为可能。含有单核苷酸多态性的等位基因的鉴定可以包括从目的样品中扩增DNA。例如，这可以通过PCR完成。一般参见《PCR技术DNA扩增的原理与应用》(PCR TechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification)(Erlich编，FreemanPress，NY，N.Y.，1992)；《PCR实验手册方法与应用指南》(PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications)(Innis等人编，Academic Press，SanDiego，Calif，1990)。可通过多种方法实现特定DNA序列多态性的检测，这包括但不限于基于等位基因特异的限制性内切酶切割的限制性片段长度多态性检测(RFLP)(Kan & Dozy，《柳叶刀》(Lancet)II910-912(1978))；与等位基因特异性的寡核苷酸探针杂交(Wallace等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res)63543-3557(1978))，包括固定化的寡核苷酸(Saiki等人，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)866230-6234(1969))或寡核苷酸阵列(Maskos & Southern，《核酸研究》(Nucl.Acids Res)212269-2270(1993))；等位基因特异性的PCR(Newton等人，《核酸研究》(Nucl.AcidsRes)172503-2516(1989))；错配修复检测(MRD)(Faham & Cox，《基因组研究》(Genome Res.)5474-482(1995))；MutS蛋白的结合(Wagner等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res)233944-3948(1995))；变性梯度胶电泳(DGGE)(Fisher & Lerman，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)801579-1583(1983))；单链构象多态性检测(Orita等人，《基因组学》(Genomics)5874-879(1983))；错配碱基对处的RNA酶切割(Myers等人，《科学》(Science)2301242(1985))；异源双链DNA的化学切割(Cotton等人，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)8Z4397-4401(1988))或酶促切割(Youil等人，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)9287-91(1995))，所述方法是基于等位基因特异性的引物延伸(Syvanen等人，《基因组学》(Genomics)8684-692(1990))；基因比特分析(GBA)(Nikiforov等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res)224167-4175(1994))；寡核苷酸连接实验(OLA)(Landegren等人，《科学》(Science)2411077(1988))；等位基因特异性的连接链式反应(LCR)(Barrany，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.)88189-193(1991))；缺口-LCR(Abravaya等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res)23675-682(1995))；使用本领域众所周知的标准操作进行放射和/或荧光DNA测序，以及肽核酸(PNA)测定法(Orum等人，核酸研究)(Nucl.Acids Res》215332-5356(1993)；Thiede等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res)24983-984(1996))。其他实验说明由Sambrook J等人，《分子克隆实验室手册》第三版(冷泉港出版社，冷泉港，2000)提供。
TNF-αmRNA或蛋白水平可通过本领域技术人员公知的方法测定。参见美国专利No.6,566,501、6,541,620和6,537,540。关于TNF相关紊乱中肿瘤坏死因子水平的讨论由美国专利No.6,537,540及其中所引用的参考文献(所有这些均作为参考并入本文)提供。
如本文所用，当样品中TNF-αmRNA与β-肌动蛋白表达(SEQ ID NO9；见Actor JK等人，《组合化学高通量筛选》(Comb Chem High ThroughputScreen)3(4)343-51(2000年8月))或GAPDH表达(见Anderson GD等人，《临床研究杂志》(J Clin Invest.)97(11)2672-9(June 1，1996))的比率与没有炎性皮肤病情的个体(或者优选为个体群)的样品相比，为其TNF-αmRNA与β-肌动蛋白比率的大约两倍之高或者更高时，则将样品中TNF-αmRNA(SEQ ID NO7)的水平确定为“高”。如本文所用，当样品中TNF-αmRNA与β-肌动蛋白表达的比率与没有炎性皮肤病情的个体(或者优选为个体群)的样品相比，大约等同于或低于其TNF-αmRNA与β-肌动蛋白比率时，则将样品中TNF-αmRNA的水平确定为“低或正常”。关于哪些组织中TNF-αmRNA及蛋白水平通常预期为“低”、“正常”或者“高”的说明，参见Van Deventer SJH，Gut 40443-8(1997)；McAlindon ME & Mahida YR，《消化药理学及治疗学》(AlimentPharmacol Ther)10(增刊2)72-4(1996)；Reimund J-M等人，《临床免疫学杂志》(J Clin Immunol)16144-50(1996)；Reinecker H-C等人，《临床试验免疫学》(Clin Exp Immunol)94174-81(1993)；Murch SH等人，Gut.341705-9(1993)and Grom AA等人，《关节炎及风湿症》(Arthritis Rheum)391703-1710(1996)。或者，本领域技术人员通过，例如，在十个或是更多个对照个体(例如通过实施例中所示的方法)中开展试验并获取平均或者标准偏差，能够定义群体中的平均或预期的TNF-αmRNA表达水平。
可通过医学领域技术人员公知的合适的方法从个体中收集用于测定遗传多态性、TNF mRNA水平(SEQ ID NO7)或TNF-α蛋白水平(SEQ IDNO8)的样品。样品可以是体液样品，例如来自血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液、精液或其他体液。或者，样品可以是组织样品，例如来自活组织检查样品，组织匀浆，由整个或其一部分组织、细胞或构成部分制备的溶解产物或提取物，或其级分或一部分。样品还可以是培养基，例如生物体在其中得以繁殖的营养肉汤或凝胶，其含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。
关于1％吡美莫司乳膏使用的说明由诺瓦提斯制药公司(NovartisPharmaceuticals Corp.)爱宁达Elidel处方信息T2003-01，89014902，492573/1 US(2003年4月综述)提供。关于吡美莫司使用的其他说明由Nghiem P等人，《美国科学院皮肤病学杂志》(J Am Acad Dermatol)46228-241(2002)和其中所引用的参考文献(所有这些均作为参考并入本文)以及美国专利No.5,912,238、6,352,998和6,423,722提供。
关于他克莫司软膏(0.03％或0.1％)使用的说明由藤泽保健有限公司(Fujisawa Healthcare Inc.)普特彼Protopic处方信息45670(2000年12月)提供。关于普乐可复Protopic(口服胶囊或注射液)使用的说明由藤泽保健有限公司普乐可复处方信息ZL40306和藤泽保健有限公司普乐可复产品专著提供。关于他克莫司使用的其他说明由Nghiem P等人，《美国科学院皮肤病学杂志》(J Am Acad Dermatol)46228-241(2002)和其中所引用的参考文献(所有这些均作为参考并入本文)提供。
如本文所用，“高剂量的吡美莫司”是比吡美莫司推荐剂量实质上更高的剂量。例如，对于成人和超过2岁的儿童，一天两次向患处涂抹一薄层1％吡美莫司乳膏，之后轻轻摩擦。比所述推荐剂量实质上更高的剂量可以是一天涂抹四次。或者，比所述推荐剂量实质上更高的剂量可以是一天两次涂抹具有2％或更高浓度的吡美莫司制剂，如果这样可行的话。同样的，“高剂量他克莫司”是比他克莫司推荐剂量实质上更高的剂量。
其他免疫抑制剂如氢化可的松、环孢霉素或西罗莫司(雷帕霉素)在一般的皮肤病学尤其是特应性皮炎中的用途，是医学领域技术人员众所周知的。参见Marsland AM & Griffiths CE，《欧洲皮肤病学杂志》(Eur JDermatol)2(6)618-22(November-December 2002)和Nghiem P等人，《美国科学院皮肤病学杂志》(J Am Acad Dermatol)46228-241(2002)。
特应性皮炎的诊断是医学领域技术人员众所周知的。参见CooksonWO等人，《自然遗传学》(Nature Genetics)27372-373(2001)；Nghiem P等人，《美国科学院皮肤病学杂志》(J Am Acad Dermatol)46228-241(2002)及其中所引用的参考文献(所有这些均作为参考并入本文)。
单核苷酸多态性。人类基因组的序列变异主要由单核苷酸多态性(“SNPs”)组成，其余的序列变异为短串联重复序列(包括微卫星体)、长串联重复序列(小卫星体)及其他插入和缺失。SNP是指人群中某位点上两个可选碱基以可察觉的频率出现(如＞1％)。SNP之所以被表述为“等位基因的”，即在于所述多态性的存在，某物种的有些成员可能具有未突变的序列(即原始“等位基因”)，而其他成员可能具有突变的序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一种突变的序列，而其多态性被表述为二对等位基因多态性。可选突变的存在可造成三等位基因多态性，等等。SNPs广泛分布在整个基因组中，而且改变基因功能的SNPs可能是表型变异的直接贡献者。由于其普遍性和广泛性等性质，SNPs有潜力成为定位涉及人类疾病状况的基因的重要工具。如参见Wang等人，《科学》(Science)2801077-1082(1998)，该文公开了在2.3兆碱基的DNA区域中绘制出2,227个SNPs图谱的初步研究。
单核苷酸多态性与特定表型之间的相关性并不能意味着或者要求该SNP就是造成该表型的原因。相反，这种相关性可能仅仅意味着SNP在基因组上的定位靠近于存在着表型决定因素的位点，因此更有可能发现其与这些决定因素从而与目的表型相关。因而，SNP可能与“真正的”功能变体之间存在着连锁不平衡(LD)。当基因组上两个不同位置上的等位基因比预期的更为高度相关时，则存在着LD，也称之为等位基因相关性。
因而SNP可用作为标志物，其因为临近于导致特定表型的突变而具有价值。
与疾病相关的SNPs可能也直接影响它们所定位在其中的基因的功能。序列变体可能导致氨基酸变化或改变外显子-内含子剪接，由此直接修饰相关蛋白质，或者他可能存在于调控区之中，改变mRNA的表达周期或稳定性，参见Nowotny P《神经生物学前沿》(Current Opinions inNeurobiology)11637-641(2001))。
人们渐渐清楚许多常见紊乱的形成风险以及用于治疗这些病情的药物的代谢都受到基因组变异的相当影响，尽管任一变体的影响可能很小。
因此，SNP与临床表型之间的相关性表明(1)该SNP在功能上决定该表型，或者(2)在基因组上该SNP位置的附近存在着其他导致所述表型的突变。第二种可能性是建立在遗传生物学基础上的。大片段的DNA被遗传，而彼此紧密临近的标志物可能在多世代无关的个体中没有发生重组，即所述标志物处于连锁性不平衡(LD)状态。
SNPs的鉴定和表征。许多不同的技术可用于鉴定和表征SNPs，包括单链构象多态性分析，通过变性高效液相色谱(DHPLC)进行的异源双链分析，直接的DNA测序和计算法(见Shi MM，《临床化学》(Clin Chem)47164-172(2001))。由于公共数据库中存在着的大量序列信息，可利用计算工具在硅片上(in silico)通过比对独立提交的序列来鉴定给定基因(cDNA序列或基因组序列)的SNPs。将通过实验获得的SNPs和通过硅片法获得的SNPs的进行比较，结果显示55％通过SNPFinder(http//Ipgws.nci.nih.gov82/perl/snp/snp_cgi.pl)找到的候选SNPs也都业已通过实验发现，参见Cox等人，《人类突变》(Hum Mutat)17141-150(2001)。然而，通过这些硅片法只能找到27％真正的SNPs。
目前，最常见的SNP分类法包括杂交、引物延伸和切割法。这些方法每一种都与合适的检测系统相连。检测技术包括荧光偏振(见Chan X等人《基因组研究》(Genome Res)9492-499(1999))、焦磷酸释放的光度计检测(焦磷酸测序法)(见Ahmadiian A等人，《生物化学年报》(AnalBiochem)280103-10(2000))、基于荧光共振能转移(FRET)的切割测定法、DHPLC及质谱法(见Shi MM，《临床化学》(Clin Chem)47164-172(2001)和美国专利No.6,300,076B1)。其他的检测和表征SNPs的方法在美国专利No.6,297,018B1和6,300,063B1中公开。特此将上述参考文献公开的内容全文作为参考并入本文。
在一个特别优选的实施方案中，多态性的检测可利用所谓的“入侵者”(INVADERTM)技术(得自Third Wave Technologies Inc.Madison，Wis.)。在此试验中，特异性的上游“入侵者”寡核苷酸和与之部分重叠的下游探针结合于互补的DNA模板后，共同形成特殊的结构。此结构可被裂解酶识别并在特定的位点进行切割，而这导致探针的5’侧翼被释放出来。相对于反应混和物中含有的合成的次级靶标和次级荧光标记的信号探针而言，该片段起着“入侵者”寡核苷酸的作用。这导致裂解酶对次级信号探针的特异性裂解。当这种由能够进行荧光共振能转移的染料分子标记的次级信号探针被裂解时，就产生了荧光信号。裂解酶对于由重叠的DNA序列或侧翼所形成的结构要求非常严格，所以能够被用来特异性地检测紧邻下游DNA链上裂解位点上游的单碱基对错配。见Ryan D等人《分子诊断学》(Molecular Diagnosis)4(2)135-144(1999)和Lyamichev V等人《自然生物工艺学》(Nature Biotechnology)17292-296(1999)，还参见美国专利5,846,717和6,001,567(特此将其公开内容全文并入作为参考)。
在有些实施方案中，组合物含有两个或多个被不同标记的基因型分析寡核苷酸，以在两个或多个多态性位点同时探测核苷酸的身份。也考虑引物组合物可以含有两组或多组等位基因特异性的引物对，以便能够同时靶向并扩增含有多态性位点的两个或多个区域。
本发明的基因型分析寡核苷酸也可固定在固体表面上或在其上合成，如芯片、珠子或玻璃载片(如参见WO 98/20020和WO 98/20019)。这种固定化的基因型分析寡核苷酸可用于多种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定化基因型分析寡核苷酸可包含有序的寡核苷酸阵列，其被设计用于同时在多个基因中对DNA样品进行多态性的快速筛选。
本发明的等位基因特异性寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸，或优选地为3’次末端核苷酸，其只能与特定SNP中的一个核苷酸互补，由此只有在含有该核苷酸的等位基因存在的情况下，才能作为引物进行聚合酶介导的延伸。与编码或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物均涵盖在本发明之中。可使用本领域技术人员公知的技术开发用于检测基因多态性的ASO引物。
本发明的其他基因型分析寡核苷酸与位于文中鉴定的新型多态性位点之一下游一到数个核苷酸处的靶标区域杂交。这类寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸法之中，以检测文中所述的新型多态性位点之一，因此这样的基因型分析寡核苷酸在文中被称之为“引物延伸核苷酸”。在一个优选的实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’端是与紧邻于多态性位点的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了这样的试剂盒，其含有至少两种独立包装的基因型分析寡核苷酸。试剂盒中也可以含有其他成分，例如独立包装的杂交缓冲液(当寡核苷酸将作为探针使用时)。或者，当寡核苷酸将用于扩增靶标区域时，试剂盒中可以含有独立包装的聚合酶和经优化的用于进行聚合酶催化的引物延伸如PCR的反应缓冲液。
上述的寡核苷酸组合物和试剂盒可用于对个体基因进行基因型分析和/或单倍体分型的方法之中。如本文所用，术语“基因型”和“单倍型”分别是指这样的基因型或单倍型，其含有文中所述的一个或多个新型多态性位点上存在着的核苷酸对或核苷酸，并且任选地也可以包括所述基因中一个或多个其他多态性位点上存在着的核苷酸对或核苷酸。其他多态性位点可以是目前已知的多态性位点或者是随后发现的位点。
基因型分析法的一个实施方案包括从个体中分离核酸混和物，该核酸混和物含有两个拷贝的存在于该个体之中的基因或其片段，并确定这两个拷贝中一个或多个多态性位点上核苷酸对的身份，从而确定该个体的基因型。熟练技术人员将会容易地理解，个体中两“拷贝”的基因有可能是相同的等位基因，也可能是不同的等位基因。在特别优选的实施方案中，基因型分析法包括确定每一个多态性位点的核苷酸对的身份。
典型地，核酸混合物是从取自于个体的生物样品中分离的，例如血液样品和组织样品。合适的组织样品包括全血、精液、唾液、泪、尿、排泄物、汗、口腔涂片、皮肤和毛发。核酸混合物可以包含基因组DNA、mRNA或cDNA，在后两种情况下，生物样品必须从基因在其中表达的器官获取。此外，熟练技术人员将会明白mRNA或cDNA制品将不会用于检测位于内含子或5’及3’非转录区之中的多态性。如果分离的是基因片段，则其必须含有待进行基因型分析的多态性位点。
单倍型分析法的一个实施方案包括从个体当中分离核酸分子，该核酸分子仅含存在于个体之中的两拷贝的基因中的一个或其片段，并确定该拷贝中一个或多个多态性位点上的核苷酸的身份，从而对该个体的单倍型进行分配。核酸可以利用任何能够将两拷贝的基因或片段分离的方法予以分离，包括但不限于上述的制备同基因的方法之一，其中靶向体内克隆是优选的方法。正如本领域技术人所容易理解的那样，任一单个克隆都将只提供存在于个体之中的两基因拷贝中的一个的单倍型信息。如果期望得到该个体另一个拷贝的单倍型信息，就需要检测其他克隆。典型地，为使得对个体两拷贝的基因都进行单倍体分型的概率超过90％，至少要检测五个克隆。在特别优选的实施方案中，鉴定每个多态性位点上的核苷酸。
在优选的实施方案中，通过鉴定存在于个体之中的每个拷贝基因的一个或多个多态性位点上的核苷酸的分型序列确定个体的单倍型对。在特别优选的实施方案中，单倍型分析法包括鉴定每个拷贝基因的每一个多态性位点上的核苷酸的分型序列。当对两拷贝的基因进行单倍型分析时，鉴定步骤优选通过将每个拷贝的基因置于不同容器之中进行。不过，如果两个拷贝标记有不同的标签，或以其他方式能够区分性地可辨别或可确认时，在有些情况下也可以在同一容器中进行。例如，如果基因的第一和第二拷贝分别用两种不同的第一和第二荧光染料标记，并且使用由不同的第三荧光染料标记的等位基因特异性的寡核苷酸来分析多态性位点，则检测第一和第三染料的组合就可以鉴定第一基因拷贝的多态性，而检测第二和第三染料的组合就可以鉴定第二基因拷贝的多态性。
在基因型分析和单倍型分析法中，多态性位点上核苷酸(或核苷酸对)的鉴定都可以这样进行，即通过直接由一个或两个拷贝的基因或片段扩增含有多态性位点靶标区域，并通过常规方法对扩增的区域进行测序。熟练技术人员将会容易地理解，对于多态性位点为纯合型的个体将在该位点仅检测到一个核苷酸，而对于多态性位点为杂合型的个体将在该位点检测到两个不同的核苷酸。多态性可以直接(称之为肯定型鉴定)或者通过推理(否定型鉴定)鉴定。例如，当已知SNP在参照群中为鸟嘌呤和胞嘧啶时，对于在该位点为纯合型的所有个体可以肯定性地确定为鸟嘌呤或胞嘧啶，或者如果个体在该位点为杂合型，则该位点为鸟嘌呤和胞嘧啶。或者，可以否定性地确定该位点不是鸟嘌呤(因而是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(因而是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
另外，可以通过对在此并未提及的但与目的多态性位点间存在连锁不平衡的多态性位点进行基因型分析，间接地确定文中所述的新型多态性位点的身份。如果一个位点的上特定变体的存在增大了第二位点上另一变体的可预测性，那么这两个位点间就存在连锁不平衡(见Stevens JC，《分子诊断学》(Mol Diag)4309-317(1999))。与在此公开的多态性位点间存在连锁不平衡的多态性位点可能定位于所述的基因区域内，或者定位于此处未检测的其他基因组区域。与文中所述的新型多态性位点具有连锁不平衡的多态性位点的基因型分析可以通过但不限于上述用于鉴定多态性位点等位基因身份的任何方法。
靶标区域的扩增可以使用任何寡核苷酸引导的扩增方法，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利No4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(Barany等人，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA)88189-193(1991)、PCT专利申请WO 90/01069)以及寡核苷酸连接试验(OLA)(Landegren等人，《科学》(Science)2411077-1080(1988))。在这些方法中可用作为引物或探针的寡核苷酸应当特异性地与包含或邻近于该多态性位点的核酸区域杂交。典型地，寡核苷酸长度为10到35个核苷酸之间，优选为15到30个核苷酸之间。最为优选地，寡核苷酸为20到25个核苷酸长。寡核苷酸确切的长度将取决于熟练技术人员常规地考虑和执行的许多因素。
其他已知的可用于扩增靶标区域的核酸扩增操作包括基于转录的扩增系统(见美国专利No.5,130,238；EP 329,822；美国专利No.5,169,766，WO 89/06700)和等温法(Walker等人，《美国科学院院报》(Proc NatlAcad Sci USA)89392-396(1992))。
靶标区域的多态性也可以在扩增前后使用本领域公知的基于杂交的方法进行测定。典型地，利用等位基因特异性的寡核苷酸实施这些方法。等位基因特异性的寡核苷酸可作为不同标记的探针对使用，其中所述探针对中的一个成员显示出与靶标序列一个变体的完美匹配，而另一个成员显示出与不同变体的完美匹配。在有些实施方案中，使用成组的等位基因特异性的寡核苷酸或寡核苷酸对可以一次检测不止一个多态性位点。优选地，当该组中的成员与被检测多态性位点杂交时，其彼此之间的解链温度差异应在5℃以内，更优选在2℃以内。
等位基因特异性的寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交可以令两种实体在溶液中进行，或者这种杂交可以在将寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价地连附在固相支持物上的情况下进行杂交。连附可以通过这样方法介导，例如，抗原-抗体相互作用、多聚L赖氨酸、链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-生物素、盐桥、疏水作用、化学链键、紫外交联烘烤等等。等位基因特异性的寡核苷酸可以直接在固相支持物上合成，或者在合成后连附到固相支持物上。适用于本发明的检测方法的固相支持物包括由硅、玻璃、塑料和纸等做成的基质，例如，可将其制备成孔(如96孔板)、载片、片层、膜、纤维、芯片、皿和珠。固相支持物可经处理、包被或衍生化，以易化等位基因特异性的寡核苷酸或靶核酸的固定。
个体基因的基因型或单倍型也可以通过使含有一个或两个拷贝的基因的核酸样品与核酸阵列和子阵进行杂交来测定，如WO 95/11995中所述。所述阵列将含有一批代表了待纳入基因型或单倍型的每个多态性位点的等位基因特异性的寡核苷酸。
多态性的身份也可以使用错配检测技术确定，包括但不限于用RNA探针(riboprobe)(Winter等人《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci USA)827575(1985)；Meyers等人，《科学》(Science)2301242(1985))和识别核苷酸错配的蛋白质如大肠杆菌的mutS蛋白(Modrich P.《遗传学年度综述》(Ann Rev Genet)25229-253(1991))的RNA酶保护法。或者，变体等位基因可以通过单链构象多态性分析(SSCP)(Orita等人，《基因组学》(Genomics)5874-879(1989)；Humphries等人，《遗传病的分子诊断》(inMolecular Diagnosis of Genetic Diseases)R.Elles编，第321-340页(1996))或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell等人，《核酸研究》(Nucl Acids Res)182699-2706(1990)；Sheffield等人，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad SciUSA)86232-236(1989))来鉴定。
聚合酶介导的引物延伸法也可用于鉴定多态性。若干这样的方法在专利和科技文献中业已有描述，并且包括“基因比特分析法(Genetic BitAnalysis)”(WO 92/15712)和连接酶/聚合酶介导的基因比特分析法(美国专利No.5,679,524)。相关方法描述在WO 91/02087、WO 90/09455、WO95/17676、美国专利No.5,302,509和5,945,283之中。包含多态性的延伸引物可如美国专利No.5,605,798中所述通过质谱测定法予以检测。另一种引物延伸法是等位基因特异性的PCR(Ruafio等人，《核酸研究》(NuclAcids Res)178392(1989)；Ruafio等人，《核酸研究》(Nucl Acids Res)196877-6882(1991)；WO 93/22456；Turki等人，《临床研究杂志》(J ClinInvest)951635-1641(1995))。另外，多个多态性位点可以如WO 89/10414中所述使用成组的等位基因特异性的引物通过同时扩增多个核酸区域进行研究。
在优选的实施方案中，研究了每个种族地理学群体的单倍型频率数据，以确定其是否符合Hardy-Weinberg平衡相符。Hardy-Weinberg平衡(D.L.Hartl等人，《群体基因组学原理》(Principles of PopulationGenomics)第三版，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997)假定，如果H1≠H2，则发现单倍型对H1/H2的频率等于PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)，而如果H1＝H2，则等于PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)。所观察到的与所预期的单倍型频率之间在统计学意义上差异可归因于如下的一种或多种因素包括群体中相当数量的近亲繁殖、对基因的强选择压力、抽样偏差和/或基因型分析过程中的误差。如果在种族地理学群体中观察到与Hardy-Weinberg平衡巨大的偏差，则可以增加该群体中个体的数目，以确定所述偏差是否是由抽样偏差所致。如果更大的样品数目并不能减小所观察到的与所预期的单倍型对频率之间的差异，则人们可能希望考虑使用直接的单倍型分析法对个体进行单倍型分析，例如，CLASPER SystemTM技术(美国专利NO.5,866,404)、SMD或等位基因特异性的远程PCR(allele-specific long-range PCR)(Michalotos-Beloin等人，《核酸研究》(Nucl Acids Res)244841-4843(1996))。
在用于预测单倍型对的该方法的一个实施方案中，分配步骤包括实施如下的分析。首先，将每一个可能的单倍型对与参照群体的单倍型对进行比较。通常，在参照群体的单倍型对中只有一对与可能的单倍型对相匹配，则将该单倍型对分配给所述个体。偶尔地，参照单倍型对所示的单倍型中只有一个单倍型与个体可能的单倍型对相符，在这种情况下，则向该个体分配这样的单倍型对，其包含这个已知的单倍型和通过从可能的单倍型对中扣除该已知单倍型后所获得的新单倍型。极少数情况下，要么参照群中没有单倍型与可能的单倍型对相符，要么多个参照单倍型对与可能的单倍型对相符。在这样的情况下，优选使用直接的分子单倍型分析法对该个体进行单倍型分析，如CLASPER SystemTM技术(美国专利No.5,866,404)、SMD或等位基因特异性的远程PCR(Michalotos-Beloin等人，《核酸研究》(Nucl Acids Res)244841-4843(1996))。
本发明也提供了测定群体基因型或单倍型频率的方法。该方法包括测定群体每个成员中存在着的基因型或单倍型对(其中基因型或单倍型包括在所述基因的一个或多个多态性位点上检测到的核苷酸对或核苷酸)，并计算在所述群体中发现特定基因型或单倍型的频率。群体可以是参照群体、家族群体、同性别群体、群组、或特征群体(如表现出目的特征如医学病情或对治疗性治疗起反应的个体群)。
在本方明的另一个方面，将在参照群体中发现的基因型和/或单倍型频率数据用于鉴定特征与基因型或单倍型之间的相关性的方法之中。所述特征可以是任何可检测的表型，包括但不限于对疾病的易感性或对治疗的反应。所述方法包括获得参照群体以及表现出所述特征的群体的目的基因型或单倍型的频率数据。参照和特征群体之一或两者的频率数据可以使用上文所述的方法通过对群体中的每一个个体进行基因型分析或单倍型分析获得。特征群体的单倍型可以直接地或者是通过上文所述的预测基因型或单倍型方法测定。
在另一个实施方案中，参照和/或特征群体的频率数据是通过存取先前测得的书面或电子形式的频率数据获得的。例如，频率数据可以存在于可由电脑存取的数据库中。一旦获得频率数据，就可以比较参照和特征群体中目的基因型或是单倍型的频率。在优选的实施方案中，比较群体中所观察到的所有基因型或单倍型的频率。如果特征群体基因的特定基因型或单倍型频率高于参照群体统计学意义的量，则可预测该特征与所述基因型或单倍型相关。
在优选的实施方案中，统计学分析可以通过伴有Bonferoni修正和/或引导法的标准ANOVA试验来进行，其多次模拟基因型表型相关性并计算显著性值。当分析很多的多态性时，可进行因子校正以校正可能是偶然发现的显著相关性。关于本发明使用的统计学方法，参见《生物统计学方法》第三版(Statistical Methods in Biology)，Bailey NTJ，(Cambridge Univ.Press，1997)；《计算生物学简介》，(Introduction to ComputationalBiology)Waterman MS(CRC Press，2000)和《生物信息学》(Bioinformatics)，Baxevanis AD & Ouellette BFF editors(John Wiley &Sons，Inc.，2001)。
在该方法优选的实施方案中，目的特征是患者对某些治疗性治疗表现出的临床反应，例如，对药物靶向的反应或对医学病情的治疗性治疗的反应。
在本发明的另一个实施方案中，与目的基因型或单倍型存在连锁不平衡的可检测的基因型或单倍型可用作为替代标记物。与基因型处于连锁不平衡的基因型可以这样发现，即测定也表现出潜在的替代标记基因型的群体中基因的特定基因型或单倍型频率是否高出参照群体统计学意义的量，然后可预测该标记基因型与所述基因型或单倍型相关，从而可用作为替代标记物以代替所述基因型。
定义。如本文所用，术语“医学病情”包括但不限于表征为任何期望治疗的身体和/或心理症状的病情或疾病，并且包括之前和新近鉴定的疾病和其他紊乱。
如本文所用，术语“临床反应”指的是以下任何或所有的情况反应、无反应或不利反应(即副作用)的定量测量。
为了推断出对治疗的临床反应和基因型或单倍型之间的相关性，获得了接受治疗的个体群(下文记做“临床群体”)所表现出的临床反应数据。这些临床数据可以通过分析业已进行的临床试验的结果来获得，和/或所述临床数据可以通过设计和开展一种或多种新的临床试验来获得。
如本文所用，术语“临床试验”指的是任何设计用以收集有关特定治疗的反应的临床数据的研究，包括但不限于I期、II期和III期临床试验。使用标准方法定义患者群体和登记受试者。
优选纳入临床群体的个体业已就目的医学病情的存在进行了分级。潜在患者的这种分级可以采用标准体检或一种或多种实验室测试进行。或者，在单倍型对和疾病的易感性或严重性之间存在强相关性的情况下，患者的分级可以使用单倍型进行。
向试验群体中的每一个体给予目的治疗性治疗，并使用一个或多个预设的标准衡量每一个体对治疗的反应。预期在多数情况下，试验群体将表现出在一定范围内变动的反应，并且调查者将选择由不同反应构成的应答群成员(例如，低、中、高)。另外，还对试验群体中的每一个体进行基因型分析和/或单倍型分析，这可以在给予治疗之前或之后进行。
在获得临床和多态性两种数据之后，就建立起个体反应与基因型或单倍型之间的相关性。相关性可以以多种方式产生。在一种方法中，按照其基因型或单倍型(或单倍型对)来对个体进行分组(也称之为多态性群)，然后计算每个多态性群的成员所表现出的临床反应的平均和标准偏差。
然后分析这些结果以确定多态性群之间临床反应上的变化是否具有统计学意义。可以使用的统计学分析法描述在L.D.Fisher & G.vanBelle，《生物统计学健康科学方法论》(BiostatisticsA Methodology for theHealth Sciences)(Wiley-lnterscience，New York，1993)之中。这种分析也包括关于基因中哪个多态性位点为表型差异作出了最为重大的贡献的回归计算。
用于寻找单倍型含量与临床反应之间的相关性的第二种方法使用了基于误差最小化优化算法的来预测模型。许多可能的优化算法之一是遗传算法(R.Judson，“遗传算法及其化学应用”，《计算化学综述》(“GeneticAlgorithms and Their Uses in Chemistry”in Reviews in ComputationalChemistry)，第10卷，第1-73页，K.B.Lipkowitz & D.B.Boyd编(VCHPublishers，纽约，1997)。也可以使用模拟退火(Press等人，“NumericalRecipes in CThe Art of Scientific Computing”，Cambridge UniversityPress(Cambridge)1992，第10章)、神经网络(E.Rich和K.Knight，《人工智能》“Artificial Intelligence”，第2版，(McGraw-Hill，New York，1991，第18章)、标准梯度下降法(Press等人，同前，第18章)、或其他全局或局部的优化方法(参见Judson中的讨论，同前)。
相关性也可以使用变化分析(ANOVA)技术通过测定多少临床数据的变化可由基因上不同亚型的多态性位点予以解释而进行分析。使用ANOVA来检验有关反应变量是否由一个或多个可测量的特征或变量所致或与之相关的假说(Fisher & vanBelle，同前，第10章)。
从上述分析可以看出，熟练技术人员可以很容易地构建这样的数学模型，所述模型预能够预测作为基因型或单倍型含量的函数的临床反应。
临床反应与基因的基因型或单倍型(或单倍型对)之间相关性的鉴定可以是设计诊断方法的基础，以确定那些个体中谁将对治疗有反应或者谁不会有反应，或者谁将以较低的水平起反应因而可能需要更多治疗，即更大剂量的药物。诊断方法可采取若干形式，例如直接DNA测试(即对基因中的一个或多个多态性位点进行基因型分析或单倍型分析)、血清学测试或体检测量。唯一的要求是诊断测试结果与潜在的基因型或单倍型之间具有良好的相关性，而所述基因型或单倍型依次又与临床反应相关。在优选的实施方案中，这种诊断方法使用上文所述的预测性单倍型分析方法。
计算机可以执行实施本发明方法所涉及的任何或所有的分析和数学操作。另外，计算机可以通过执行程序在显示装置上产生视图(或影像)，用户能够与之互动，以观察和分析与基因及其基因组变化相关的大量信息，包括染色体定位、基因结构、和基因家族、基因表达数据、多态性数据、基因序列数据、以及临床数据群体数据(如有关一个或多个群体的种族地理学起源、临床反应、基因型和单倍型的数据)。本文所述的多态性数据可以作为关系数据库的一部分进行储存(如，Oracle数据库的例子，或成组的ASCII台面文档)。这些多态性数据可储存在计算机的硬盘上，或者可以例如储存在CD-ROM或一种或多种其他计算机可读的存储装置中。例如，数据可以储存在介由网络联机的一个或多个数据库中。
在其他实施方案中，本发明提供了对个体中的基因进行单倍型分析和/或基因型分析的方法、组合物和试剂盒。组合物包含被设计用来与一个或多个包含或邻近于多态性位点的靶标区域杂交的寡核苷酸探针和引物。本文所述的用于确立个体新型多态性位点上的基因型和单倍型的方法和组合物，可用于研究多态性在受蛋白表达和功能影响的疾病病因学中的作用、研究药物靶向的功效、预测对受蛋白表达和功能影响的疾病的个体易感性以及预测对靶向所述基因产物的药物的个体反应。
又在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定基因型或单倍型与特征之间的相关性的方法。在优选的实施方案中，所述特征为对疾病易感性、疾病的严重性、疾病所处的阶段或者对药物的反应。这些方法适用于发展所有药物遗传学应用的诊断测试和治疗性治疗，其中在基因型和治疗结果之间存在着相关的可能，所述治疗结果包括功效测量、PK测量和副作用测量。
本发明也提供了计算机系统来储存和显示测得的基因的多态性数据。计算机系统包括计算机处理单元、显示器和包含多态性数据的数据库。多态性数据包括所鉴定的参照群体的基因的多态性、基因型和单倍型。在优选的实施方案中，计算机系统能够显示根据其进化关系而组织起来的单倍型。
另一方面，本发明提供了SNP探针，其可用根据其遗传变异类型来对人们进行分类。根据本发明的SNP探针为寡核苷酸，它们能够在常规的等位基因辨别试验中区分SNP核酸的等位基因。
如本文所用，术语“SNP核酸”是核酸序列，它在个体或个体群间否则将会是完全相同的核苷酸序列内含有可变的核苷酸，因而作为等位基因存在。这样的SNP核酸长度优选从大约15到大约500个核苷酸。SNP核酸可以是染色体的一部分，或者它们可以是部分染色体的精确拷贝，例如通过PCR或通过克隆扩增这样的一部分染色体。SNP核酸在下文将简单地称之为“SNPs”。根据本发明的SNP探针是与SNP核酸互补的寡核苷酸。
如本文所述，术语“互补”是指就Watson和Crick(配对)而言，在寡核苷酸整个长度上的精确互补。
在某些优选的实施方案中，根据本发明这方面的寡核苷酸只与SNP核酸的一个等位基因互补，但不与该SNP核酸的任何其他等位基因互补。根据本发明这个实施方案的寡核苷酸能够以多种方式区分SNP核酸的等位基因。例如，在严谨杂交条件下，合适长度的寡核苷酸将只与SNP核酸的一个等位基因杂交而不与SNP核酸的任何其他等位基因杂交。寡核苷酸可以用放射性标记或荧光标记来标记。或者，合适长度的寡核苷酸可以用作PCR的引物，其中3’末端核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，但不与任何其他等位基因互补。在这个实施方案中，PCR扩增的存在或不存在决定着SNP核酸的单倍型。
本发明的基因组和cDNA片段包含至少一个文中鉴定到的新型多态性位点，至少具有10个核苷酸的长度，并且可以延展到基因的全长。优选地，根据本发明的片段长度在100和3000个核苷酸之间，并且更优选长度在200和2000个核苷酸之间，并且最优选长度在500和1000个核苷酸之间。
在说明此处所鉴定的多态性位点时，为方便计参照的是基因的有义链。不过，正如熟练技术人员所认可的那样，含有所述基因的核酸分子可能是互补的双链分子，因而提及的有义链上的特定位点也指互补反义链上的相应位点。因而，可以参照任一条链上的同一多态性位点，并且可以设计寡核苷酸使之与含多态性位点的靶标区域中的任一条链特异性杂交。因而，本发明也包括与本文所述的基因组变体的有义链互补的单链多核苷酸。
在优选的实施方案中，试剂盒可以还包括DNA样品收集部件。
特别地，基因型分析引物组合物可以包括至少2组等位基因特异性的引物对。优选地，所述两组基因型分析寡核苷酸包装在不同的容器中。
应当理解，此处所述的本发明的方法可能还包括使用根据本发明的试剂盒。通常，本方明的方法可以离体进行，并且本发明特别考虑这样的离体方法。同样，当本发明的方法可能包括可能在人或动物体上实施的步骤时，本发明特别考虑不在人或动物体上实施的步骤。
本文鉴定的多态性对于表达的影响可以通过制备包含基因多态性变体的重组细胞和/或生物体进行研究，优选重组动物。如文中所述，“表达”包括但不限于如下一种或多种基因转录为前体mRNA；前体mRNA经剪接或其他加工产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译为蛋白质(包括密码子使用和tRNA的有效性)；以及翻译产物的糖基化和/或其他修饰(如果这是蛋白正确表达和功能所必需的话)。
为了制备本发明的重组细胞，可将期望的同基因用载体导入细胞之中，从而所述同基因维持在染色体外。在这种情况下，基因将由细胞自染色体外位置上表达。在优选的实施方案中，同基因将以这种方式导入细胞之中，从而其与细胞中存在着的内源基因重组。这样的重组需要双重组事件的发生，由此产生期望的基因多态性。用于导入基因进行重组或染色体外维持的载体是本领域公知的，并且任何合适的载体或载体构建体都可以用于本发明。用于将DNA导入细胞之中的诸如电穿孔、微粒轰击、磷酸钙共沉淀以及病毒转染等方法都是本领域公知的；所以，对于方法的选择可能有赖于技术操作者的能力和喜好。
表达变体基因的重组生物体即转基因动物是使用本领域公知的标准操作制备的。优选地，在胚胎期即一细胞期，或通常不晚于八细胞期，将含有变体基因的构建体导入非人动物或所述动物的祖先之中。携带本发明构建体的转基因动物可由本领域技术人员熟知的多种方法制备。一种方法包括将逆转录病毒转染到胚胎之中，所述逆转录病毒含有一个或多个隔离元件，一个或多个目的基因以及本领域技术人员熟知的其他元件，以提供持有隔离基因的完整穿梭载体作为转基因，如，参见美国专利No.5,610,053。另一种方法包括直接将转基因注射到胚胎之中。第三种方法包括使用胚胎干细胞。
能够向其中导入同基因的动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、其他啮齿类动物以及非人灵长类动物(见《重组DNA》(Recombinant DNA)之“小鼠中外源基因的导入”(The Introduction of Foreign Genes intoMice)以及其中所引用的参考文献，J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski，& M.Zoller编；W.H.Freeman and Company，纽约，第254-272页)。稳定表达人类同基因并产生人类蛋白质的转基因动物可以用作为生物模型，以研究与异常表达和/或活性相关的疾病，并筛选和测定各种候选药物、化合物和治疗方案以减轻这些疾病的症状和影响。
为实施本发明，使用许多传统的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术是众所周知的，并且分别在例如《最新分子生物学实验方法汇编》(Current Protocols in Molecular Biology)，第I-III卷，Ausubel编(1997)；Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)(1989)；《DNA克隆实验手册》(″DNA CloningAPractial Approach″)，第I和II卷，Glover编(1985)；《寡核苷酸合成》(″Oligonucleotide Synthesis″)Gait编(1984)；《核酸杂交》(″Nucleic AcidHybridization″)Hames & Higgins编(1985)；《转录与翻译》(″Transcriptionand Translation″)Hames & Higgins编(1984)；《动物细胞培养》(″AnimalCell Culture″)Freshney编(1986)；《固定化细胞和酶》(″Immobilized Cellsand Enzymes″)IRL Press(1986)；Perbal，《分子克隆试验指南》(″APractical Guide to Molecular Cloning″)；《酶学方法丛书》(the series，Methods in Enzymol.)，Academic Press，Inc.(1984)；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(″Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells″)Miller和Calos编，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1987)以及《酶学方法》(Methods in Enzymology)第154和155卷，Wu & Grossman和Wu编，中有解释。
随之将在不同的对照组中如此测得的基因表达产物的标准对照水平，与给定患者中基因表达产物的测量水平进行比较。该基因表达产物可能是与特定基因型群相关的特征性mRNA，或者是该基因型群的多肽基因表达产物。然后基于测量水平与给定组的对照水平相比的相似度将患者分类或分配至特定的基因型组。
正如本领域技术人员将会理解的那样，与进行这种测定相关，存在着一定程度的不确定性。因此，可利用对照组水平的标准偏差作出概率性的鉴定，并且本发明的方法将适用于广泛的基于概率的基因型群测定。因而，作为举例而非限制，在一个实施方案中，如果基因表达产物的测量水平落在任一对照组均值的2.5个标准偏差之内，则该个体可以归属为该基因型群。在另一个实施方案中，如果基因表达产物的测量水平落在任一对照组均值的2.0个标准偏差之内，则该个体可以归属为该基因型群。又在另一个实施方案中，如果基因表达产物的测量水平落在任一对照组均值的1.5个标准偏差之内，则该个体可以归属为该基因型群。而在另一个实施方案，如果基因表达产物的测量水平落在任一对照组均值的1.0或更少个标准偏差之内，则该个体可以归属为该基因型群。
因而该方法将允许以多种不同程度的概率确定特定患者应该置于哪个群组中，并且这种基因型群的分配将会确定所述个体应该置入的风险等级。
检测和测量mRNA水平及多肽基因表达产物水平的方法是本领域众所周知的，并且包括使用多核苷酸微阵列以及包括质谱和/或抗体检测的多肽检测法和定量技术。参见《人类分子遗传学》(Human Molecular Genetics)第二版Tom Strachan & Andrew，Read(John Wiley and Sons，Inc.Publication，NY，1999)。
此外，检测体液或组织中基因的多肽(蛋白质)表达产物的浓度可用于确定多态性的存在或不存在，并且多肽表达产物的相对水平可用于确定多态性是否以纯合或是杂合状态存在，从而可以确定所述个体的风险等级。
如本文所用，“医学病情”包括但不限于表征为任何期望治疗的身体和/或心理症状的病情或疾病，并且包括之前和新近鉴定的疾病和其他紊乱。
如本文所用，术语“多态性”应当指群体中以＞1％的频率存在的任何序列变体。序列变体可以以显著高于1％如5％或10％或更高的频率存在。同样，该术语也可用于指在个体多态性位点上所观察到的序列变异。多态性包括核苷酸取代、插入、缺失和微卫星体，并且可以但并非必须导致基因表达或蛋白功能方面的可检测的变化。
如本文所用，术语“临床反应”指的是以下任何或所有的情况反应、无反应或不利反应即副作用的定量测量。
如本文所用，术语“等位基因”应当指特定染色体位置(基因座)上特殊形式的基因或DNA序列。
如本文所用，术语“基因型”应当指在个体的一对同源染色体的基因座上的一个或多个多态性位点中发现的未分型的5’到3’核苷酸对序列。如本文所用，基因型包括全基因型和/或亚基因型。
如本文所用，术语“多核苷酸”应当指任何RNA或DNA，它们可以是未修饰或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括，并非限制性地，单链和双链DNA，单链区和双链区混合的DNA；单链和双链RNA，单链区和双链区混合的RNA，单链的、更多情况下是双链的、或单双链区混合的含DNA和RNA的杂交分子。另外，多核苷酸也指含有RNA或DNA或RNA和DNA的三链区域。术语多核苷酸也包括含有一个或多个修饰碱基的DNAs或RNAs以及出于稳定性或其他原因主链经修饰的DNAs或RNAs。
如本文所用，术语“基因”应当指含有调控RNA产物的生物合成的所有信息的DNA片段，包括启动子、外显子、内含子以及控制表达的其他非翻译区。
如本文所用，术语“多肽”应当指任何含有通过肽键或修饰肽键彼此相连的两个或多个氨基酸的多肽，即肽等排物(isostere)。多肽既指短链多肽，通常称之为肽、糖肽或寡肽；又指长链多肽，通常称之为蛋白质。多肽可以含有除了20个基因编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括由自然过程如翻译后加工或者本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这样的修饰在基础教材中有充分的描述，并且在专著以及长篇的研究论文中有更为详尽的描述。
如本文所用，术语“多态性位点”应当指群体基因座内发现至少有两种备选序列的位置，其最大频率不超过99％。
如本文所用，术语“核苷酸对”应当指在来自个体的两个拷贝的染色体的多态性位点上发现的核苷酸。
如本文所用，术语“分型的(phased)”含义是，当用于基因座中两个或以上的多态性位点的核苷酸对序列时，存在于单拷贝基因座中那些多态性位点上的核苷酸组合是已知的。
为了推断出对治疗的临床反应和基因型或单倍型之间的相关性，有必要获得接受治疗的个体群(下文记做“临床群体”)所表现出的临床反应数据。这些临床数据可以通过分析业已进行的临床试验的结果来获得，和/或所述临床数据可以通过设计和开展一种或多种新的临床试验来获得。
如本文所用，术语“临床试验”指的是任何设计用以收集有关特定治疗的反应的临床数据的研究，包括但不限于I期、II期和III期临床试验。使用标准方法定义患者群体和登记受试者。
如本文所用，术语“基因座”应当指染色体或DNA分子上对应于基因或者物体或表型特征的位置。
向试验群体中的每一个体给予目的治疗性治疗，并使用一个或多个预设的标准衡量每一个体对治疗的反应。预期在多数情况下，试验群体将表现出在一定范围内变动的反应，并且调查者将选择由不同反应构成的应答群成员(例如，低、中、高)。另外，还对试验群体中的每一个体进行基因型分析和/或单倍型分析，这可以在给予治疗之前或之后进行。
作为标记物的核酸和蛋白的检测。在特别的实施方案中，相当于标记物的mRNA水平可以利用本领域公知的方法通过原位或体外的方式在生物样品中进行测定。术语“生物样品”旨在包括自测试者中分离出来的组织、细胞、生物体液及其分离物，还包括存在于个体之中的组织、细胞和体液。许多表达检测法使用分离的RNA。对于体外方法，任何并非选取破坏mRNA分离的RNA分离技术都可以用来从细胞中纯化RNA。例如参见Ausubel等人编，《最新分子生物学实验方法汇编》(Curr.Prot.Mol.Biol.)，John Wiley & Sons，NY(1987-1999)。另外，大量的组织样品可以利用本领域技术人员众所周知的技术容易地处理，例如，美国专利No.4,843,155的单步RNA分离方法。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增试验，这包括但不限于Southern或Northern分析、PCR分析及探针阵列。一种优选的用于检测mRNA水平的诊断方法包括使分离的mRNA与能够与由被检测的基因所编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是，例如，全长的cDNA或其部分，比如长度至少是7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且足以在严谨条件下与编码本发明标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。文中描述了可用于本发明的诊断试验的其他合适的探针。mRNA与探针的杂交表明所研究的标记物被表达。
一种形式为将mRNA固定在固体表面并与探针接触，例如，将分离的mRNA跑琼脂糖凝胶电泳，并将mRNA从凝胶中转移到膜如硝化纤维上。可选的形式为将探针固定在固体表面，并使mRNA与所述探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列上。熟练技术人员能够容易地改造已知的mRNA检测法，以用于检测由本发明的标记物所编码的mRNA的水平。
备选的用于测定样品中与本发明的标记物相对应的mRNA水平的方法包括核酸扩增的步骤，例如通过RT-PCR(实验实施方案在Mullis，美国专利No.4,683,202(1987)中阐明)；连接酶链式反应，(Barany(1991)，同前；自持性序列复制，Guatelli等人，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第87卷，第1874-1878页(1990)；转录扩增系统，Kwoh等人，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第86卷，第1173-1177页(1989)；Q-Beta复制酶，Lizardi等人，《生物技术》(Biol.Technology)，第6卷，第1197页(1988)；滚环复制，美国专利No.5,854,033(1988)或者任何其他核酸扩增的法实现，之后，使用本领域技术人员众所周知的技术来检测扩增的分子。如果核酸分子以极低的数目存在，则这些核酸检测策略尤其可用于检测这样的分子。如本文所用，扩增引物被定义为一对核酸分子，其能够与基因的5’区或3’区(分别为正链和负链，或者反之亦然)退火，从而在两者之间含有短的区域。一般而言，扩增引物长度为大约10-30个核苷酸，并侧接长度为大约50-200个核苷酸的区域。在合适的条件下，使用合适的试剂，这样的引物能扩增出含有为所述引物所侧接的核苷酸序列的核酸分子。
对于原位法，无需在检测之前将mRNA从细胞中分离出来。在这样的方法中，细胞或组织样品使用已知的组织学方法制备/处理。然后，将样品固定在支持物上，典型地为载片，然后与探针接触，所述探针能够与编码标记物的mRNA杂交。
作为基于标记物的绝对表达水平作出判断的可选方案，判断可以建立在标记物标准化表达水平的基础上。表达水平是通过将其表达与非标记物基因如组成型表达的持家基因的表达相比较来校正标记物的绝对表达水平而进行标准化的。用于标准化的合适的基因包括持家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性的基因。这种标准化能够比较一个样品(如患者样品)与另一个样品或者不同来源的样品中的表达水平。
或者，表达水平可以作为相对表达水平提供。为测定标记物的相对表达水平，在测定研究样品的表达水平之前，对10个或以上的正常样品相对于疾病生物学样品的标记物表达水平进行测定，优选50个或以上的样品。确定在较大数目的样品中所分析的每个基因的平均表达水平，并利用它作为标记物的基线表达水平。然后用所测得的测试样品的标记物表达水平(绝对表达水平)除以所获得的该标记物的平均表达值。这样提供相对表达水平。
优选地，基线测定中所使用的样品将来自于没有多态性的患者。细胞来源的选择将取决于相对表达水平的用途。用在正常组织中发现的表达作为平均表达得分有助于确认所分析的标记物是否为特异性的(与正常细胞相比)。另外，随着更多数据的积累，平均表达值可以进行修正，从而基于积累的数据提供改进的相对表达值。
多肽的检测。在本发明的另一个实施方案中，检测与标记物相应的多肽。优选的用于检测本发明多肽的试剂是能够结合相应于本发明标记物的多肽的抗体，优选是具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或更优选地为单克隆抗体。可以使用完整抗体或其片断，如Fab或F(ab’)2。就探针或抗体而言，术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测的物质偶联即物理连接于探针或抗体对探针或抗体进行的直接标记，以及通过与其它直接标记的试剂反应对探针或抗体进行的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记二抗检测一抗，以及用生物素末端标记DNA探针，从而可用荧光标记的链霉抗生物素蛋白来检测。
可利用本领域技术人员众所周知的技术从个体中分离蛋白质。所采用的蛋白质分离方法可以例如是Harlow & Lane(1988)，同前中所述的那些方法。
可以采用多种形式确定样品中是否含有与给定抗体结合的蛋白质。这些形式的实例包括但不限于EIA，放射免疫分析(RIA)，Western印迹分析及ELISA。熟练技术人员能够容易地改造已知的蛋白质/抗体检测法以用于确定细胞是否表达本发明的标记物以及血液或其他机体组织中该特定多肽表达产物的相对浓度。
一种方式为使用抗体或抗体片段在诸如Western印迹或免疫荧光技术方法中检测所表达的蛋白质。在这些用途中，一般优选将抗体或蛋白质固定在固相支持物上。合适的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然和改良的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。
本领域技术人员将会知晓许多其他结合抗原或抗体的合适载体，并能改造这些支持物以用于本发明中。例如，可以将从患者细胞中分离的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中跑样，并固定在固相支持物如硝化纤维上。继用可检测的标记抗体处理之后，即可用合适的缓冲液洗涤支持物。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物以除去未结合的抗体。之后可以用常规的手段检测固相支持物上结合的标记的量，并将这种测量转化为血液或其他机体组织的蛋白质水平或浓度。
本发明也涵盖试剂盒，其可用于检测生物样品中对应于本发明标记物的多肽或核酸的存在，例如任何体液，包括但不限于血清、血浆、淋巴液、膀胱液、尿、大便、csf、腹水或血液，并且包括机体组织的活组织检查样品。例如，试剂盒可以含有能够检测生物样品中的多肽或编码对应于本发明标记物的多肽的mRNA的标记化合物或试剂，以及用于测定样品中多肽或mRNA的量的部件，例如结合多肽的抗体或与编码多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针。试剂盒也可以包括说明书，用于阐释利用该试剂盒得到的结果。
例如，对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包括1)第一抗体(如连接在固相支持物上)，其与对应于本发明标记物的多肽结合；和，任选地，2)第二抗体，即与所述多肽或所述第一抗体结合的不同抗体，并且与可检测的标记缀合。
例如，对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包括1)寡核苷酸(如可检测地标记的寡核苷酸)，其与编码对应于本发明标记物的多肽的核酸序列杂交；或2)一对引物，可用于扩增对应于本发明标记物的核酸分子。
试剂盒也可以包括，例如，缓冲剂，防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包括检测可检测标记所必需的组分，如酶或底物。试剂盒也可以包括一个对照样品或一系列对照样品，可对其进行分析并与测试样品进行比较。试剂盒中的每种组分都可以存放在单个的容器中，并且所有的这些多种容器都可以放在一个单独的包装内，连同说明书，用于阐释利用该试剂盒进行分析的结果。
试剂盒。本发明的试剂盒上或试剂盒容器里可以含有书面制品。所述书面制品说明了如何使用试剂盒中所含的试剂来预测患者是否有效地对大环内酰胺治疗尤其是吡美莫司治疗起反应。在几种实施方案中，试剂的使用可依据本发明的方法。
实施例临床试验中患者对治疗的反应的药物遗传学分析吡美莫司功效与TNF基因簇中多态性的潜在相关性选定的候选基因的基因型分析。对46名患者进行了遗传标记物与治疗功效之间的相关性分析，其中相当于24名患者接受他克莫司治疗，22名患者接受吡美莫司治疗。
共分析了总计22个基因的31个独特的多态性位点。表1列出了在同意参与药物遗传学分析的试验人群中所研究的每种SNP的基因型频率。每种SNP由3条信息标识(1)REF_ACC或Genbank登录号，由此可以查到基因的基因组序列；(2)位置，指所查询的REF_ACC中核苷酸所处的位置；(3)TWT SNP#，是指Third Wave Technologies对经设计用以评估由第1和2项所限定的位置上的基因型的试验所分配的编号。定位是指基因中持有所述多态性的位点(如果已知的话)。
表1药物基因组学分析中所研究的多态性列表
表1(续)药物基因组学分析中所研究的多态性列表
+此sNP在该患者群体中不是多态性的*该群体中此sNP不呈Hardy Weinberg平衡。
未对编码FK506结合蛋白1A(巨菲蛋白-12)[吡美莫司和他克莫司(FK506)的靶标]的FKBP1A基因(SEQ ID NO13)进行基因型分析，是因为未发现该基因含有SNPs。在公共数据库中也没有关于FKBP1A多态性位点的报导。我们对FKBP1A基因进行了测序，以寻找未知的SNPs，但是没有找到。
为了查询每个目的基因座的基因型，利用公众可获得的公共的数据库如OMIM、SNP Consortium、LocusLink和dbSNP设计了侧接SNP的探针集合。所述探针集合由Third Wave Technologies，Inc.(TWT，Madison WI)合成。利用Third Wave Technologies开发的Invader试验根据制造商的说明用60ng基因组DNA进行基因型分析。Lyamichev V等人，《自然生物技术》(Nat Biotechnol)17292-6(1999)和Ryan D，《分子诊断学》4135-44(1999)。
ASN60THR LTA的基因型分柝。为了确认Third Wave Technologies的ASN60THR LTA基因型分析试验(TWT #229383)的结果，使用了巢式聚合酶链式反应(PCR)。所有的寡核苷酸均购自Research Genetics(Huntsville，AL)。首先使用具有如下序列的引物扩增出481bp的片段正向(5’-acaccacctgaacgtctcttc-3’；SEQ ID NO14)，反向(5’-tctcaatccctgaggaagtgg-3’；SEQ ID NO15)。全长LTA序列(SEQ ID NO11)见Genbank登录号M55913。扩增子用Microcon 100柱(Amlicon，Beverly，MA)进行纯化，并作为模板使用具有如下序列的引物扩增出163bp的片段正向(5’-tcagccaaaccttgagccctagag-3’；SEQ ID NO16)和反向(5’-atgtttaccaatgaggtgagcagcaggtttgcgg-3’；SEQ ID NO17)。两种PCR反应都是在Perkin Elmer 9700热循环仪中利用80ng基因组DNA、60ng各种引物、1.0单位(U)AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer)和200μM dNTP(Pharmacia，Piscataway，N.J.)在包括50mM KCl，10mM TRIS-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl和0.01％白明胶的缓冲液中进行。两种扩增的PCR循环如下构成94℃，5分钟；94℃，30秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃，10分钟；然后4℃。163bp的扩增子用Fau I(New EnglandBiolabs，Beverly MA)消化，并在4％琼脂糖凝胶上电泳。G等位基因产生未切的163bp片段，而A产生了35bp和128bp两个片段。在杂合型个体中，128bp与163bp两个片段都能看到。通过Third Wave Technologies技术所测定的两种基因型几乎都能通过限制性消化验证。
(-1031)TNF的基因型分柝。为了确认TNF-1031基因型分析试验的结果，PCR扩增了1113bp片段的TNF启动子，并对每个样品进行了测序。PCR引物序列如下正向(5’-TGGGAGTGAGAACTTCCCAG-3’；SEQ IDNO18)和反向(5’-TGAGCTCATCTGGAGGAAGC-3’；SEQ ID NO19)。人类TNF的全长序列见Genbank登录号M16441。PCR反应使用与上述相同的条件进行。PCR产物用Microcon 100(Amlicon，Beverly，MA)柱纯化。
扩增子纯化后，如所建议的那样(Perkin Elmer，Foster City，CA)，每100bp用5ng以ABI Prism Dye Terminator Cycle测序试剂盒进行测序。测序反应含有正向(5’-TGGGAGTGAGAACTTCCCAG-3’；SEQ ID NO20)或反向(5’-CTTAAACGTCCCCTGTATTC-3’；SEQ ID NO21)引物，并如下运行96℃，5分钟；96℃，10秒，50℃，5秒，60℃，4分钟，25个循环；然后4℃。测序反应用Centrisep旋转柱(Princeton Separation，Adelphia，NJ)纯化，然后在ABI 373A测序仪上跑样。DNA序列利用ABIPrism序列分析V3.3软件进行分析。
统计学分析。在药物遗传学研究中，利用调查人全局评估(IGA)得分作为首要的功效标志。实验盲性期结束时(第43天)的IGA得分用作为比较的主要时间点。在第43天仅仅一个患者需要末次观察推进归因法(Last observation carried forward imputations)。在这种情况下，第29天后就没有可用的IGA得分了，则以这一天的得分替代第43天的IGA得分。将IGA得分重新编码，正如为评估试验本身的功效所作的那样。IGA得分为0或1则视为治疗成功，IGA得分为2-5则视为治疗失败。瘙痒症的严重性也用作为功效标志。瘙痒症得分被划分为不存在(得分＝0)或存在(得分＝1、2或3)瘙痒症两类。采用费舍尔精确检验(Fisher’s exact)模型研究基因型对每一个功效变量的影响。所有的统计学分析都是使用的SAS 8.2版软件。
为进行多重检验校正，对所有的结果实施Bonferroni校正法。用于校正显著性值(p值)的方程式为Bonferrroni＝PXη，此处P＝p值，代表基因型和治疗功效之间的相关性；而η＝在试验中进行基因型分析的多态性标记物的数目。
人口统计学试验参与者。如表2所示，就性别、年龄、种族和对治疗的反应而言，同意参与药物基因组学(PG)分析的试验个体代表了试验整体的患者群体。
表2与试验个体相比的药物基因组学分析参与者的人口统计学比较
+试验中他克莫司一方有70个受试者，而试验中吡美莫司一方有71个受试者*服用他克莫司的24个受试者和服用吡美莫司的22个患者接受了药物基因组学分析$IGA得分是在筛选时取得的#见到功效的患者数目和(百分率)，所述功效定义为在治疗第43天记录到0或1的IGA得分(试验盲性部分结束时)(-1031)TNF与大环内酰胺功效之间的相关性。如上所述，每个遗传标记物的统计学分析中所使用的首要的功效变量是重新编码的IGA得分。对22个基因总计31个基因座进行了基因型分析。在基因型分析的31个基因座中，有5个在药物基因组学分析中不是多态性的，故从分析中剔除。见上表1。因此，此分析中多重检验的罚分为26。
当对试验从整体上(两方组合起来)分析时，26个SNPs中有1个表现出具有统计学意义的与功效的相关性。肿瘤坏死因子α即TNF，定位于6p21.3上富含基因的MHC簇中(见图1)，并且该区域中的许多基因在炎症过程中起着重要作用。TNF启动子区是高度多态性的。位于该基因转录起始位点-1031bp的SNP与功效关联(p＝0.04，见下表3)。这些数据显示在(-1031)TNF上持有C等位基因(CC纯合型或CT杂合型)的患者与TT患者(17/29；59％成功率)相比，较小可能对治疗有反应(4/17；24％成功率)。
表3(-1031)TNF与大环内酰胺功效之间的相关性(-1031)TNF基因型
表3显示了由治疗第43天的IGA得分所判定的、对治疗反应或不反应(分别称之为“成功”或“不成功”)的每一种基因型的受试者的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。相关性P值为0.04(费舍尔精确检验)。
接下来，我们分别研究了(-1031)TNF与他克莫司和吡美莫司治疗功效之间的相关性。从表4中我们可以看出，根据(-1031)TNF可以将对吡美莫司有反应的受试者从无反应者中分开。只有在(-1031)TNF处具有TT基因型(SEQ ID NO1)的受试者才对吡美莫司治疗有反应。具有C等位基因(SEQ ID NO2；CC或CT)的10个受试者中没有一个对吡美莫司治疗有反应。尽管CC和CT患者的反应率为0％，但67％具有TTs基因型的患者在服用吡美莫司后见到特应性皮炎的减轻。
表4(-1031)TNF与吡美莫司功效之间的相关性(-1031)TNF基因型
表4显示了由治疗第43天的IGA得分所判定的、对治疗反应或不反应(分别称之为“成功”或“不成功”)的每一种基因型的吡美莫司治疗个体的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。相关性P值为0.03(费舍尔精确检验)。
然而，这个基因座的基因型看起来并不影响他克莫司的功效。见下表5。实际上，在使用他克莫司的受试者中，反应者看起来很可能同CT或CC一样可以是TT。因此，在作为整体的试验中所观察到的功效与(-1031)TNF之间的相关性只对吡美莫司成立，但与一般而言的大环内酰胺无关。
表5(-1031)TNF与他克莫司功效之间的相关性(-1031)TNF基因型
表5显示了由治疗第43天的IGA得分所判定的、对治疗反应或不反应(分别称之为“成功”或“不成功”)的每一种基因型的他克莫司治疗个体的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。未发现(-1031)TNF基因型与他克莫司反应之间存在相关性；相关性P值为1.0(费舍尔精确检验)。
ASN60THR LTA与大环内酰胺功效之间的相关性。将两方的试验一起分析，仅发现功效与(-1031)TNF的关联。有趣的是第二个多态性的数据表明了趋近于显著的倾向。LTA外显子3中的C→A多态性(SEQ ID NO3)导致所述蛋白的第60位氨基酸的天门冬酰胺被替代为苏氨酸(ASN60THR)，其与临床试验的功效关联(p＝0.07，见下表6)。LTA与TNF串联定位于6p21.3上，并且大量报导表明TNF和LTA中的标记物呈强连锁不平衡。Bouma G等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志》(Scand JImmunol)43456-63(1996)；Noguchi E等人，《美国呼吸道与危重症监护医学杂志》(Am J Respir Crit Care Med)16643-6(2002)；Moffatt M &Cookson W.《人类分子遗传学》(Hum Molec Genet)6551-4(1997)；Messer G等人，《实验医学杂志》(J Exp Med)173209-19(1991)。利用Invader试验(TWT#229383)测定了药物基因组学参与者这个基因座上的基因型，并通过限制性消化进行验证。数据显示在该基因座此有A野生型等位基因(SEQ ID NO3)的患者更有可能对治疗有反应；在具有A等位基因(SEQ ID NO4；AA或AC)的受试者中，反应率为57％(17/30)，而仅有25％的基因型为CC的受试者在所述试验中见到功效。
表6ASN60THR LTA与大环内酰胺功效之间的相关性(两方组合起来)ASN60THR LTA基因型
表6显示了由治疗第43天的IGA得分所判定的、对治疗反应或不反应(分别称之为“成功”或“不成功”)的每一种基因型的临床试验个体的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。虽然未发现显著的相关性(P值＝0.07，费舍尔精确检验)，P值逼近于显著性，并提示可能的关联。
接下来，我们分别研究了ASN60THR LTA与临床试验中每一方之间的相关性。如所预期的那样，发现了吡美莫司显著的相关性(P＝0.02，见下表7)，并观察到多态性的剂量效应。此基因座上具有CC基因型的患者对吡美莫司反应较差(1/8或11％成功治疗)。然而，具有AC基因型的患者反应较好(4/10或40％成功率)，且所有具有AA基因型的患者对治疗都有反应(3/3)。
表7ASN60THR LTA与吡美莫司功效之间的相关性ASN60THR LTA基因型
表7显示了由治疗第43天的IGA得分所判定的、对治疗反应或不反应(分别称之为“成功”或“不成功”)的每一种基因型的吡美莫司治疗个体的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。相关性P值为0.02(费舍尔精确检验)。
相似的关联在ASN60THR LTA与他克莫司的功效之间未发现。在表8中可以看到，ASN60THR LTA处A等位基因的存在对于他克莫司的反应并无影响。与关于(-1031)TNF的发现一样，在临床试验中ASN60THR LTA与功效之间的相关性是由试验中吡美莫司一方所驱动的。
表8ASN60THR LTA与他克莫司功效之间的相关性ASN60THR LTA基因型
表8显示了由治疗第43天的IGA得分所判定的、对治疗反应或不反应(分别称之为“成功”或“不成功”)的每一种基因型的他克莫司治疗个体的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。未发现ASN60THR LTA基因型与他克莫司反应之间存在相关性；相关性P值为1.0(费舍尔精确检验)。
多态性标记物与瘙痒症减轻之间的相关性。试验中所用的次要功效变量为瘙痒症。进行分析以观察ASN60THR LTA和(-1031)TNF是否与此功效变量关联(在第43天评估)。有关ASN60THRLTA和(-1031)TNF的分析结果分别示于表9和表10。
药物基因组学测试组中，少数受试者(7/46)见到瘙痒症状减轻。首要功效变量(IGA)的结果表明在ASN60THR LTA处存在C等位基因降低了对治疗反应的可能性。虽然未发现ASN60THR LTA与瘙痒症之间具有统计学意义的相关性，但是在该试验中，此基因座上纯合型CC的受试者没有瘙痒减轻的表现。而对于(-1031)TNF，虽然首要功效变量IGA的分析提示TT受试者更不可能对治疗有反应，但是当瘙痒症得分进行分析时，作为整体的试验无法得出相同的结果。试验的两方不能分开进行瘙痒症分析，因为反应者的数目太小。在药物基因组学分析样品中仅有两名吡美莫司受试者见到痒症减轻。不过，这两名见到与瘙痒症相关功效的吡美莫司受试者在(-1031)TNF处均为TT。
表9ASN60THR LTA与搔痒症之间的相关性(两方组合起来)ASN60THR LTA基因型
表9显示了由治疗第43天的瘙痒症得分所判定的、对治疗反应或不反应的ASN60THR LTA基因座上所研究的每一种基因型的个体数目。如果患者报告没有瘙痒症则治疗视为成功(得分＝0)。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。未发现ASN60THR LTA基因型与瘙痒症减轻之间显著的相关性(P＝0.06，费舍尔精确检验)，然而，相关性P值逼近于显著性。
表10治疗后(-1031)TNF与搔痒症之间的相关性(两方组合起来)(-1031)TNF基因型
表10显示了由治疗第43天的瘙痒症得分所判定的、对治疗反应或不反应的(-1031)TNF处每一种基因型的个体数目。如果患者报告没有瘙痒症则治疗视为成功(得分＝0)。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。未发现相关性(P＝1.0，费舍尔精确检验)。
(-1031)TNF和ASN60THR LTA处的基因型分析。获得了匿名患者这两个6p21.3基因座上的基因型。只有在(-1031)TNF处为TT基因型的一个受试者对吡美莫司治疗有反应。在(-1031)TNF为TT纯合型的个体就ASN60THRLTA而言为AA纯合型、AC杂合型或CC纯合型，这一观察结果显示(-1031)TNF和ASN60THR并非呈现完全连锁不平衡。
表11ASN60THR LTA和(-1031)TNF多态性周围的核苷酸序列
吡美莫司和他克莫司与分型的其他标记物之间的相关性。验证了所有分型的其他分子标记物，以观察它们在每一方独立的试验中，能否将反应者和无反应者区分开来。对于吡美莫司未见其他相关性，而对于他克莫司发现有一处相关性。在CCR2编码区的G→A多态性(SEQ ID NO6；见TWT#47987)导致缬氨酸变为异亮氨酸(VAL64ILE)，这与他克莫司治疗的反应相关联(p＝0.04，见上表11)。吡美莫司功效和VAL64ILE CCR2之间的相关性P值是1.0(费舍尔精确检验)。
CCR2编码趋化因子(C-C)基序受体2，即单核细胞趋化蛋白-1的受体，并且是在炎性疾病中介导单核细胞浸润的趋化因子。CCR2编码单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1，也称之为SCYA2)受体两种已知的同工型，其为特异性介导单核细胞趋化现象的趋化因子。业已证明MCP-1参与炎性疾病如类风湿性关节炎和动脉硬化症。Boring L等人，《自然》(Nature)394894-7(1998)。VAL64ILE多态性发生在CCR2的第一个跨膜区，并且已在HIV-1感染和艾滋病的情形中进行了研究。Mummidi S等人，《自然医学》(NatureMed)4786-93(1998)。所发现的相关性为p＝0.04。
这些数据证明VAL64ILE CCR2上的A等位基因更可能对他克莫司治疗有反应；与4/13或31％的GG受试者相比，8/10或80％的AG受试者见到功效(在所述群体中没有AA受试者)。这种相关性比所见到的吡美莫司功效的相关性更弱，特别是(-1031)TNF和吡美莫司功效之间的相关性(p＝0.003)。
表12VAL63ILE CCR2(TWT#47987)与他克莫司功效之间的相关性VAL63ILE CCR2基因型
表12显示了(由治疗第43天的IGA得分所判定的)对治疗反应或不反应的VAL64ILE CCR2上每一种基因型的他克莫司治疗个体的数目。每个方格中包括了具有给定基因型且符合所述反应等级的个体数目，跟着是百分率。相关性P值为0.04(费舍尔精确检验)。
LTB(SEQ ID NO12，见TWT#128095)也定位在位于6p21.3上的TNF基因簇中。在此分析中也对LTB中的多态性进行了分型(SEQ ID NO22)。然而，如下文所示，在TWT#128095与临床试验功效之间没有相关性。当独立分析吡美莫司和他克莫司受试者时也未发现相关性。
表13试验功效(两方组合起来)与LTB(TWT#128095)之间的相关性；数据表明无相关性(p＝1.0，费舍尔精确检验)LTB(TWT#128095)
表14在吡美莫司治疗个体中功效与LTB(TWT#128095)之间的关联；数据表明无相关性(p＝1.0，费舍尔精确检验)LTB(TWT#128095)
表15在他克莫司治疗治疗个体中功效与LTB(TWT#128095)之间的关联；数据表明无相关性(p＝1.0，费舍尔精确检验)LTB(TWT#128095)
这些数据有助于定位负责吡美莫司反应的基因区域；生物学上相关的多态性似乎并不定位在TNF附近。
总之，LTA或TNF都在判定小儿特异性皮炎治疗的吡美莫司功效中起重要作用。相反，对他克莫司的反应似乎受其他生物学路径的影响。因此，不同的生物学机制影响者对吡美莫司和他克莫司的反应。虽然吡美莫司与他克莫司具有实质上的结构相似性，并且都靶向聚菲蛋白-12，最终的效果是抑制钙调磷酸酶，但已知这两种化合物具有不同的特性。Nghiem P等人，《美国科学院皮肤病学杂志》(J Am Acad Dermatol)46228-241(2002)以及其中所引用的参考文献。
特此将文中所引用的参考文献整体并入作为参考用于所有目的，就如同特别和单独地指明将每一篇单个的出版物或专利或专利申请全文并入作为参考用于所有目的一样。另外，特此将文中所引用所有GenBank登录号、Unigene Cluster编号和蛋白质登录号整体并入作为参考用于所有目的，就如同特别和单独地指明将每一个这样的编号全部并入作为参考用于所有目的一样。
本发明不应局限于本申请中所描述的具体实施方案，所述实施方案旨在作为本发明个别方面的单纯的举例说明。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修饰和变动，这对于本领域技术人员来说将是显而易见的。根据前述说明和附图，除了本文详述的那些之外，落在本发明精神和范围内的功能上等同的方法和设备对本领域技术人员来说将是显而易见的。这样的修饰和变动旨在落入所附权利要求书的范围之内。本发明只应受所附权利要求书、连同为其授予这样的权利要求书的全部范围的等同体所限定。
序列表<110>诺瓦提斯公司<120>与炎性疾病的治疗功效相关的遗传多态性的用途<130>DV/4-33389A<150>60/508,971<151>2003-10-06<160>22<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>53<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>变异<222>(1)...(53)<223>TNF基因座变体(-1031位为T)<221>变异<222>(23)...(0)<223>T<400>1agcaaaggag aagctgagaa gatgaaggaa aagtcagggt ctggaggggc ggg53<210>2<211>53<212>DNA<213>智人<220>
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<220>
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<221>CDS<222>(1)...(702)<223>肿瘤坏死因子α(TNFα)mRNA编码区<400>7atg agc act gaa agc atg atc cgg gac gtg gag ctg gcc gag gag gcg 48Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala1 5 10 15
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<221>CDS<222>(74)...(1201)<223>β-肌动蛋白表达(ACTB)mRNA编码区<400>9cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 60ccgccagctc acc atg gat gat gat atc gcc gcg ctc gtc gtc gac aac109Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn1 5 10ggc tcc ggc atg tgc aag gcc ggc ttc gcg ggc gac gat gcc ccc cgg 157Gly Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg15 20 25gcc gtc ttc ccc tcc atc gtg ggg cgc ccc agg cac cag ggc gtg atg 205Ala Val Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met30 35 40gtg ggc atg ggt cag aag gat tcc tat gtg ggc gac gag gcc cag agc 253Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser45 50 55 60aag aga ggc atc ctc acc ctg aag tac ccc atc gag cac ggc atc gtc 301Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val65 70 75acc aac tgg gac gac atg gag aaa atc tgg cac cac acc ttc tac aat 349Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn80 85 90gag ctg cgt gtg gct ccc gag gag cac ccc gtg ctg ctg acc gag gcc 397Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala95 100 105
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<221>CDS<222>(51)...(991)<223>趋化因子(CC基序)受体2(CCR2)mRNA编码区
<400>10acagagaaag tggattgaac aaggacgcat ttccccagta catccacaac atg ctg 56Met Leu1tcc aca tct cgt tct cgg ttt atc aga aat acc aac gag agc ggt gaa104Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser Gly Glu5 10 15gaa gtc acc acc ttt ttt gat tat gat tac ggt gct ccc tgt cat aaa152Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys His Lys20 25 30ttt gac gtg aag caa att ggg gcc caa ctc ctg cct ccg ctc tac tcg200Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser35 40 45 50ctg gtg ttc atc ttt ggt ttt gtg ggc aac atg ctg gtc gtc ctc atc248Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val Leu Ile55 60 65tta ata aac tgc aaa aag ctg aag tgc ttg act gac att tac ctg ctc296Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr Leu Leu70 75 80aac ctg gcc atc tct gat ctg ctt ttt ctt att act ctc cca ttg tgg344Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro Leu Trp85 90 95gct cac tct gct gca aat gag tgg gtc ttt ggg aat gca atg tgc aaa392Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met Cys Lys100 105 110tta ttc aca ggg ctg tat cac atc ggt tat ttt ggc gga atc ttc ttc440Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe115 120 125 130atc atc ctc ctg aca atc gat aga tac ctg gct att gtc cat gct gtg488Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val135 140 145ttt gct tta aaa gcc agg acg gtc acc ttt ggg gtg gtg aca agt gtg536Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr Ser Val150 155 160
atc acc tgg ttg gtg gct gtg ttt gct tct gtc cca gga atc atc ttt584Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile Ile Phe165 170 175act aaa tgc cag aaa gaa gat tct gtt tat gtc tgt ggc cct tat ttt632Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro Tyr Phe180 185 190cca cga gga tgg aat aat ttc cac aca ata atg agg aac att ttg ggg680Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile Leu Gly195 200 205 210ctg gtc ctg ccg ctg ctc atc atg gtc atc tgc tac tcg gga atc ctg728Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu215 220 225aaa acc ctg ctt cgg tgt cga aac gag aag aag agg cat agg gca gtg776Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val230 235 240aga gtc atc ttc acc atc atg att gtt tac ttt ctc ttc tgg act ccc824Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro245 250 255tat aac att gtc att ctc ctg aac acc ttc cag gaa ttc ttc ggc ctg872Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu260 265 270agt aac tgt gaa agc acc agt caa ctg gac caa gcc acg cag gtg aca920Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln Val Thr275 280 285 290gag act ctt ggg atg act cac tgc tgc atc aat ccc atc atc tat gcc968Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala295 300 305ttc gtt ggg gag aag ttc aga ag cctttttcac atagctcttg gctgtaggat1021Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg310tgccccactc caaaaaccag tgtgtggagg tccaggagtg agaccaggaa agaatgtgaa 1081agtgactaca caaggactcc tcgatggtcg tggaaaagga aagtcaattg gcagagcccc 1141tgaagccagt cttcaggaca aagaaggagc ctagagacag aaatgacaga tctctgcttt 1201ggaaatcaca cgtctggctt cacagatgtg tgattcacag tgtgaatctt ggtgtctacg 1261ttaccaggca ggaaggctga gaggagagag actccagctg ggttggaaaa cagtattttc 1321
caaactacct tccagttcct catttttgaa tacaggcata gagttcagac tttttttaaa 1381tagtaaaaat aaaattaaag ctgaaaactg caacttgtaa atgtggtaaa gagttagttt 1441gagttactat catgtcaaac gtgaaaatgc tgtattagtc acagagataa ttctagcttt 1501gagcttaaga attttgagca ggtggtatgt ttgggagact gctgagtcaa cccaatagtt 1561gttgattggc aggagttgga agtgtgtgat ctgtgggcac attagcctat gtgcatgcag 1621catctaagta atgatgtcgt ttgaatcaca gtatacgctc catcgctgtc atctcagctg 1681gatctccatt ctctcaggct tgctgccaaa agccttttgt gttttgtttt gtatcattat 1741gaagtcatgc gtttaatcac attcgagtgt ttcagtgctt cgcagatgtc cttgatgctc 1801atattgttcc ctattttgcc agtgggaact cctaaatcaa attggcttct aatcaaagct 1861tttaaaccct attggtaaag aatggaaggt ggagaagctc cctgaagtaa gcaaagactt 1921tcctcttagt cgagccaagt taagaatgtt cttatgttgc ccagtgtgtt tctgatctga 1981tgcaagcaag aaacactggg cttctagaac caggcaactt gggaactaga ctcccaagct 2041ggactatggc tctactttca ggccacatgg ctaaagaagg tttcagaaag aagtggggac 2101agagcagaac tttcaccttc atatatttgt atgatcctaa tgaatgcata aaatgttaag 2161ttgatggtga tgaaatgtaa atactgtttt taacaactat gatttggaaa ataaatcaat 2221gctataacta tgttgataaa a 2242<210>11<211>618<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)...(618)<223>淋巴毒素α(LTA)mRNA编码区<400>11atg aca cca cct gaa cgt ctc ttc ctc cca agg gtg tgt ggc acc acc 48Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr1 5 10 15cta cac ctc ctc ctt ctg ggg ctg ctg ctg gtt ctg ctg cct ggg gcc 96Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala20 25 30cag ggg ctc cct ggt gtt ggc ctc aca cct tca gct gcc cag act gcc 144Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala35 40 45cgt cag cac ccc aag atg cat ctt gcc cac agc acc ctc aaa cct gct 192Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala50 55 60
gct cac ctc att gga gac ccc agc aag cag aac tca ctg ctc tgg aga 240Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg65 70 75 80gca aac acg gac cgt gcc ttc ctc cag gat ggt ttc tcc ttg agc aac 288Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Ash85 90 95aat tct ctc ctg gtc ccc acc agt ggc atc tac ttc gtc tac tcc cag 336Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln100 105 110gtg gtc ttc tct ggg aaa gcc tac tct ccc aag gcc acc tcc tcc cca 384Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro115 120 125ctc tac ctg gcc cat gag gtc cag ctc ttc tcc tcc cag tac ccc ttc 432Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe130 135 140cat gtg cct ctc ctc agc tcc cag aag atg gtg tat cca ggg ctg cag 480His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln145 150 155 160gaa ccc tgg ctg cac tcg atg tac cac ggg gct gcg ttc cag ctc acc 528Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr165 170 175cag gga gac cag cta tcc acc cac aca gat ggc atc ccc cac cta gtc 576Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val180 185 190ctc agc cct agt act gtc ttc ttt gga gcc ttc gct ctg tag 618Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu *195 200 205<210>12<211>894<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS
<222>(9)...(743)<223>淋巴毒素β(LTB)mRNA编码区<400>12cagtctca atg ggg gca ctg ggg ctg gag ggc agg ggt ggg agg ctc cag 50Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln1 5 10ggg agg ggt tcc ctc ctg cta gct gtg gca gga gcc act tct ctg gtg 98Gly Arg Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val15 20 25 30acc ttg ttg ctg gcg gtg cct atc act gtc ctg gct gtg ctg gcc tta 146Thr Leu Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu35 40 45gtg ccc cag gat cag gga gga ctg gta acg gag acg gcc gac ccc ggg 194Val Pro Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly50 55 60gca cag gcc cag caa gga ctg ggg ttt cag aag ctg cca gag gag gag 242Ala Gln Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu65 70 75cca gaa aca gat ctc agc ccc ggg ctc cca gct gcc cac ctc ata ggc 290Pro Glu Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly80 85 90gct ecg ctg aag ggg cag ggg cta ggc tgg gag acg acg aag gaa cag 338Ala Pro Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln95 100 105 110gcg ttt ctg acg agc ggg acg cag ttc tcg gac gcc gag ggg ctg gcg 386Ala Phe Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala115 120 125ctc ccg cag gac ggc ctc tat tac ctc tac tgt ctc gtc ggc tac cgg 434Leu Pro Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg130 135 140ggc cgg gcg ccc cct ggc ggc ggg gac ccc cag ggc cgc tcg gtc acg 482Gly Arg Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr145 150 155
ctg cgc agc tct ctg tac cgg gcg ggg ggc gcc tac ggg ccg ggc act 530Leu Arg Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr160 165 170ccc gag ctg ctg ctc gag ggc gcc gag acg gtg act cca gtg ctg gac 578Pro Glu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp175 180 185 190ccg gcc agg aga caa ggg tac ggg cct ctc tgg tac acg agc gtg ggg 626Pro Ala Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly195 200 205ttc ggc ggc ctg gtg cag ctc cgg agg ggc gag agg gtg tac gtc aac 674Phe Gly Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn210 215 220atc agt cac ccc gat atg gtg gac ttc gcg aga ggg aag acc ttc ttt 722Ile Ser His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe225 230 235ggg gcc gtg atg gtg ggg tga gggaatatga gtgcgtggtg cgagtgcgtg 773Gly Ala Val Met Val Gly *240aatattgggg gcccggacgc ccaggacccc atggcagtgg gaaaaatgta ggagactgtt 833tggaaattga ttttgaacct gatgaaaata aagaatggaa agcttcagtg ctgccgataa 893a 894<210>13<211>327<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)...(327)<223>FK506结合蛋白1A(巨菲蛋白12)的FKBP1A开放读框mRNA编码区<400>13atg gga gtg cag gtg gaa acc atc tcc cca gga gac ggg cgc acc ttc 48Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe1 5 10 15
ccc aag cgc ggc cag acc tgc gtg gtg cac tac acc ggg atg ctt gaa 96Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu20 25 30gat gga aag aaa ttt gat tcc tcc cgg gac aga aac aag ccc ttt aag 144Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys35 40 45ttt atg cta ggc aag cag gag gtg atc cga ggc tgg gaa gaa ggg gtt 192Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val50 55 60gcc cag atg agt gtg ggt cag aga gcc aaa ctg act ata tct cca gat 240Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp65 70 75 80tat gcc tat ggt gcc act ggg cac cca ggc atc atc cca cca cat gcc 288Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala85 90 95act ctc gtc ttc gat gtg gag ctt cta aaa ctg gaa tga 327Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu *100 105<210>14<211>21<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(21)<223>人LTA的扩增引物-正向<400>14acaccacctg aacgtctctt c 21<210>15<211>21<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合
<222>(1)...(21)<223>人LTA的扩增引物-反向<400>15tctcaatccc tgaggaagtg g 21<210>16<211>24<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(24)<223>人LTA的测序引物-正向<400>16tcagccaaac cttgagccct agag 24<210>17<211>34<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(34)<223>人LTA的测序引物-反向<400>17atgtttacca atgaggtgag cagcaggttt gcgg34<210>18<211>20<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(20)<223>人TNF的扩增引物-正向<400>18tgggagtgag aacttcccag20
<210>19<211>20<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(20)<223>人TNF的扩增引物-反向<400>19tgagctcatc tggaggaagc20<210>20<211>20<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(20)<223>人TNF的测序引物-正向<400>20tgggagtgag aacttcccag20<210>21<211>20<212>DNA<213>智人<220>
<221>引物_结合<222>(1)...(20)<223>人TNF的测序引物-反向<400>21cttaaacgtc ccctgtattc20<210>22<211>894<212>DNA<213>智人<220>
<221>变异<222>(9)...(743)<223>LTB*1(G)多态性编码区<400>22cagtctcaat gggggcactg gggctggagg gcaggggtgg gaggctccag gggaggggtt 60ccctcctgct agctgtggca ggagccactt ctctggtgac cttgttgctg gcggtgccta 120tcactgtcct ggctgtgctg gccttagtgc cccaggatca gggaggactg gtaacggaga 180cggccgaccc cggggcacag gcccagcaag gactggggtt tcagaagctg ccagaggagg 240agccagaaac agatctcagc cccgggctcc cagctgccca cctcataggc gctccgctga 300aggggcaggg gctaggctgg gagacgacga aggaacaggc gtttctgacg agcgggacgc 360agttctcgga cgccgagggg ctggcgctcc cgcaggacgg cctctattac ctctactgtc 420tcgtcggcta ccggggccgg gcgccccctg gcggcgggga cccccagggc cgctcggtca 480cgctgcgcag ctctctgtac cgggcggggg gcgcctacgg gccgggcact cccgagctgc 540tgctcgaggg cgccgagacg gtgactccag tgctggaccc ggccaggaga caagggtacg 600ggcctctctg gtacacgagc gtggggttcg gcggcctggt gcagctccgg aggggcgaga 660gggtgtacgt caacatcagt caccccgata tggtggactt cgcgagaggg aagaccttct 720ttggggccgt gatggtgggg tgagggaata tgagtgcgtg gtgcgagtgc gtgaatattg 780ggggcccgga cgcccaggac cccatggcag tgggaaaaat gtaggagact gtttggaaat 840tgattttgaa cctgatgaaa ataaagaatg gaaagcttca gtgctgccga taaa 89权利要求
1.吡美莫司在制备治疗选定的患者群体的炎性疾病的药物中的用途，其中该患者群体是基于这些患者来自TNF基因簇的遗传座位上的基因型选定的，所述遗传座位表明了吡美莫司在炎性疾病治疗中的功效。
2.他克莫司在制备治疗选定的患者群体的炎性疾病的药物中的用途，其中该患者群体是基于这些患者CCR2遗传座位上的基因型选定的，所述CCR2遗传座位表明了他克莫司在炎性疾病治疗中的功效。
3.治疗个体病情的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司的适应症的病情，所述方法包括以下步骤(a)获取个体来自TNF基因簇的遗传座位上的基因型，所述遗传座位表明了选定的大环内酰胺制剂在所述病情治疗中的功效；(b)向所述个体给药所选定的大环内酰胺制剂或者给予所述病情备选的治疗。
4.如权利要求3所述的方法，其中选定的大环内酰胺制剂含有吡美莫司。
5.如权利要求3所述的方法，其中选定的大环内酰胺制剂含有他克莫司。
6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中遗传座位为人TNF基因或脊椎动物物种中与人TNF基因同源的基因。
7.如权利要求1的用途或如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中遗传座位为人TNF基因的(-1031)TNF基因座或脊椎动物物种中与人TNF基因同源的相应基因座。
8.如权利要求3、4、6或7中任一项所述的方法，其中当(-1031)TNF遗传座位具有TT基因型时，所选定的大环内酰胺制剂含有吡美莫司。
9.如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中当(-1031)TNF遗传座位具有CC或CT基因型时，所述病情备选的治疗选自高剂量的吡美莫司，吡美莫司和备选的免疫抑制剂，以及备选的免疫抑制剂。
10.如权利要求9所述的方法，其中备选的免疫抑制剂选自氢化可的松、环孢霉素、他克莫司和西罗莫司。
11.如权利要求1所述的用途或如权利要求3所述的方法，其中遗传座位为人LTA基因或脊椎动物物种中与人LTA基因同源的基因。
12.如权利要求1或11所述的用途或如权利要求3或11所述的方法，其中遗传座位为人LTA基因的ASN60THR LTA基因座或脊椎动物物种中与人LTA基因同源的相应基因座。
13.如权利要求3、11或12中任一项所述的方法，其中当ASN60THRLTA遗传座位具有AA或AC基因型时，所选定的大环内酰胺制剂含有吡美莫司。
14.如权利要求3、11或12中任一项所述的方法，其中当ASN60THRLTA遗传座位具有CC基因型时，所述病情备选的治疗选自高剂量的吡美莫司，吡美莫司和备选的免疫抑制剂，以及备选的免疫抑制剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中备选的免疫抑制剂选自氢化可的松、环孢霉素、他克莫司和西罗莫司。
16.治疗个体病情的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司的适应症的病情，所述方法包括以下步骤(a)获取个体遗传座位上的基因型，该遗传座位表明了选定的大环内酰胺制剂在所述病情治疗中的功效，其中所述遗传座位为人CCR2基因或脊椎动物物种中与人CCR2基因同源的基因；(b)向所述个体给药所选定的大环内酰胺制剂或者给予所述病情备选的治疗。
17.如权利要求2所述的用途或如权利要求16所述的方法，其中遗传座位为人CCR2基因的VAL64ILE CCR2基因座或脊椎动物物种中与人CCR2基因同源的相应基因座。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中当VAL64ILE CCR2遗传座位具有GG基因型时，所选定的大环内酰胺制剂含有他克莫司。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中当VAL64ILE CCR2遗传座位具有AG基因型时，所述病情备选的治疗选自高剂量的他克莫司，他克莫司和备选的免疫抑制剂，以及备选的免疫抑制剂。
20.如权利要求16、17或19所述的方法，其中备选的免疫抑制剂选自氢化可的松、环孢霉素、吡美莫司和西罗莫司。
21.治疗个体病情的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司适应症的病情，所述方法包括以下步骤(a)测量来自个体的样品中的TNF-αmRNA水平，其中所述样品取自非炎症组织；和(b)(i)当样品中的TNF-αmRNA水平低或者正常时，向该个体给药吡美莫司制剂；或者(ii)当样品中的TNF-αmRNA水平升高时，向该个体给药(A)与其他免疫抑制剂联合的吡美莫司制剂或(B)其他免疫抑制剂。
22.治疗个体病情的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司适应症的病情，所述方法包括以下步骤(a)测量来自个体的样品中的TNF-α蛋白水平，其中所述样品取自非炎症组织；和(b)(i)当样品中的TNF-α蛋白水平低或者正常时，向该个体给药吡美莫司制剂；或者(ii)当样品中的TNF-α蛋白水平升高时，向该个体给药(A)与其他免疫抑制剂联合的吡美莫司制剂或(B)其他免疫抑制剂。
23.确定个体病情治疗策略的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司适应症的病情，所述方法包括分析来自该个体的样品中的TNF-αmRNA或TNF-α蛋白水平；并且其中的治疗策略包括当样品中的TNF-αmRNA或TNF-α蛋白水平低或者正常时，选择吡美莫司制剂用作治疗；或者，当样品中的TNF-αmRNA或TNF-α蛋白水平升高时，选择(A)与其他免疫抑制剂联合的吡美莫司制剂或(B)其他免疫抑制剂用作治疗。
24.选择个体以纳入用于确定吡美莫司制剂功效的临床试验的方法，所述方法包括如下步骤(a)询问个体(-1031)TNF多态性基因座上的基因型；(b)之后(i)如果他们在此基因座上为TT则纳入；(ii)如果他们在此基因座上为CC或CT则排除；或者(iii)(i)和(ii)兼而有之。
25.用于确定病情治疗策略的试剂盒，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司适应症的病情，所述试剂盒包括(a)用于检测大环内酰胺制剂治疗所述病情的功效的生物标志物的试剂；(b)承载该试剂的容器；和(c)位于容器上或内部的说明所述生物标志物在确定所述病情的治疗策略中的用途的书面制品。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中生物标志物为选自TNF、LTA和CCR2的基因的遗传多态性。
27.如权利要求25或26所述的试剂盒，其中用于检测所述生物标志物的试剂为成组的引物对，所述引物对与位于选自TNF、LTA和CCR2的基因的遗传多态性任一侧的多核苷酸杂交，且限定了跨越所述遗传多态性的核苷酸区域。
28.如权利要求25所述的试剂盒，其中生物标志物为来自待治疗个体的样品中的TNF-αmRNA水平。
29.如权利要求25所述的试剂盒，其中生物标志物为来自待治疗个体的样品中的TNF-α蛋白水平。
30.确定个体病情治疗策略的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司适应症的病情，所述方法包括分析个体来自TNF基因簇的遗传座位上的基因型，所述遗传座位表明了选定的大环内酰胺制剂在治疗所述病情中的功效。
31.如权利要求30所述的方法，其中遗传座位为人TNF基因或脊椎动物物种中与人TNF基因同源的基因。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中遗传座位为人TNF基因的(-1031)TNF基因座或脊椎动物物种中与人TNF基因同源的相应基因座。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中当(-1031)TNF遗传座位具有TT基因型，所述治疗策略包括选择含有吡美莫司的大环内酰胺制剂用作治疗。
34.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中当(-1031)TNF基因座具有CC或CT基因型，所述治疗策略包括选择高剂量的吡美莫司，吡美莫司和备选的免疫抑制剂，或者备选的免疫抑制剂用作治疗。
35.如权利要求34所述的方法，其中备选的免疫抑制剂选自氢化可的松、环孢霉素、他克莫司和西罗莫司。
36.如权利要求30所述的方法，其中遗传座位为人LTA基因或脊椎动物物种中与人LTA基因同源的基因。
37.如权利要求36所述的方法，其中遗传座位为人LTA基因的ASN60THR LTA基因座或脊椎动物物种中与人LTA基因同源的相应基因座。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中当ASN60THR LTA基因座具有AA或AC基因型时，所述治疗策略包括选择含有吡美莫司的大环内酰胺制剂用作治疗。
39.如权利要求36或37所述的方法，其中当ASN60THR LTA基因座具有CC基因型时，所述治疗策略包括选择高剂量的吡美莫司，吡美莫司和备选的免疫抑制剂，或者备选的免疫抑制剂用作治疗。
40.如权利要求39所述的方法，其中备选的免疫抑制剂包括氢化可的松、环孢霉素、他克莫司和西罗莫司。
41.确定个体病情治疗策略的方法，其中所述病情选自特应性皮炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎或其他为吡美莫司或他克莫司适应症的病情，所述方法包括分析个体遗传座位上的基因型，该遗传座位表明了选定的大环内酰胺制剂在治疗所述病情中的功效，其中所述遗传座位为人CCR2基因或脊椎动物物种中与人CCR2基因同源的基因。
42.如权利要求41所述的方法，其中遗传座位为人CCR2基因的VAL64ILE CCR2基因座或脊椎动物物种中与人CCR2基因同源的相应基因座。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中当VAL64ILE CCR2遗传座位具有GG基因型时，所述治疗策略包括选择含有他克莫司的大环内酰胺制剂用作治疗。
44.如权利要求41或42所述的方法，其中当VAL64ILE CCR2遗传座位具有CC基因型时，所述治疗策略包括选择高剂量的他克莫司、他克莫司和备选的免疫抑制剂，或者备选的免疫抑制剂用作治疗。
45.如权利要求44所述的方法，其中备选的免疫抑制剂选自氢化可的松、环孢霉素、吡美莫司和西罗莫司。
全文摘要
染色体6p21.3MHC III区域持有这样的DNA序列，其最有可能是位于TNF或LTA基因内，能够影响对治疗特应性皮炎的吡美莫司的反应。因此，TNF和LTA基因的遗传多态性可用作为有关吡美莫司治疗炎性疾病的功效的生物标志物。与此形成对照，他克莫司似乎受其他生物路径的影响。
文档编号A61K49/00GK1890384SQ200480035800
公开日2007年1月3日 申请日期2004年10月5日 优先权日2003年10月6日
发明者S·艾德, C·N·拉韦丹, K·麦卡洛 申请人:诺瓦提斯公司