专利名称：含CpG的单链脱氧核苷酸与其疫苗组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的含CpGODN的单链脱氧核苷酸，以及由所述单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物所组成疫苗组合物。此外，本发明还涉及含CpGODN的单链脱氧核苷酸在制备疫苗组合物中的应用，以及所述疫苗组合物作为药物的应用。
背景技术：
1984年，Tokunaga T等发现卡介苗(BCG)DNA能抑制肿瘤的生长，激活人外周血单个核细胞和天然杀伤(NK)细胞，诱生干扰素(IFN)，这些功能依赖于DNA分子中CpG结构(Tokunaga T，Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fractionfrom Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemicalcharacterization，and antitumor activity，JNCI，72955.1984)。CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸。，其中C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。近年来的研究表明，人工合成的含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA(CpG ODN)也可表现免疫调节作用，可增强B细胞、T细胞、NK细胞、抗原提呈细胞(如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和中性粒细胞的活性，并表现出明显的临床应用前景(Weiner GJ，The immunobiology and clinicalpotential of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol 2000Oct；68(4)455-63)。但由于序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族。在免疫应答的过程中，热休克蛋白可表现出如下四种基本的功能1、携带抗原进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞；2、引导抗原在抗原提呈细胞内进入MHC I类途径加工提呈；3、刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子，分泌细胞因子；4、使携带抗原与热休克蛋白形成复合物或融合蛋白的抗原，以获得激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的性质(Tamura Y，Peng P，LiuK，Daou M，Srivastava PK.Immunotherapy of tumors with autologoustumor-derived heat shock protein preparations.Science 1997 Oct3；278(5335)117-20)。
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是一个最强力的个体杀伤肿瘤细胞和杀伤病毒感染细胞的免疫细胞。外源性的蛋白类抗原在应用个体后，在包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞中主要经MHC II类途径加工提呈，激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generation ofheat shock protein-based vaccines by intracellular loading of gp96 withantigenic peptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，不能有效地诱生抗原特异性CTL。
分枝杆菌热休克蛋白65能够携带与其融合的或结合的或偶联的抗原肽进入MHC I类抗原提呈途径，激活抗原肽特异性的细胞毒性T淋巴细胞，杀伤表达抗原肽的肿瘤细胞。
丙型肝炎病毒(HCV)是引起丙型肝炎的病原体，在全世界感染了大约一亿七千多万人。肝癌和肝硬化是HCV感染引起的两个严重的并发症。在世界范围内，采用α-干扰素和病毒唑联合应用是治疗丙型肝炎病毒感染的方法，其有效率约为40％(Jon Cohen.The Scientific Challenge of Hepatitis C.Science，1999，28526-30)。采用结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)与多表位HCV核心抗原相融合所形成的融合蛋白是一种对丙型肝炎有预防和治疗作用的基因工程重组蛋白疫苗(CN02122116.2，中国)。
沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis，CT)是不运动的专营细胞内寄生的微生物，可在人类引起沙眼、包涵体性结膜炎、泌尿生殖系统疾病、性病淋巴肉芽肿、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎、输卵管性不孕及输卵管异位妊娠。
沙眼衣原体的主要外膜蛋白(MOMP)可刺激保护性免疫。采用结核杆菌热休克蛋白65和沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽相融合所形成的融合蛋白是一种对人沙眼衣原体感染及其相关疾病有预防和治疗作用的重组蛋白(CN02141977.9，中国)。
人前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)是表达在前列腺癌细胞的一种组织特异性抗原。采用结核杆菌热休克蛋白65和PSA表位抗原肽相融合所形成的融合蛋白是一种对人前列腺癌有预防和治疗作用的重组蛋白(CN01134935.2，中国)。
MUC1蛋白是粘蛋白(mucins)的一种，高水平表达在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌细胞，为免疫治疗的靶点。采用结核杆菌热休克蛋白65和MUC1抗原肽相融合所形成的融合蛋白是一种对表达MUC1蛋白的肿瘤(包括但不限于乳腺癌)具有预防和治疗作用的重组蛋白(CN01102614.6，中国)。
HER-2蛋白(HER-2)是一种和表皮生长因子受体(Tadashi Yamamoto，et al.Similarity of protein encoded by the human c-erbB-2gene to epidermal growthfactor receptor.Nature vol 319 16 January 1986，230-234)具有很高同源性的跨膜蛋白，在30％的人乳腺肿瘤细胞中过度表达，是乳腺癌免疫治疗的靶点。采用结核杆菌热休克蛋白65和HER-2抗原肽相融合所形成的融合蛋白是一种对人乳腺癌具有预防和治疗作用的重组蛋白(CN01136347.9，中国)。
上述研究结果表明，将CpG ODN与热休克蛋白相融合的抗原或抗原组合物联合应用具有广阔的前景。然而，截至到本发明为止，未见相关的文献报道或公开。
发明内容
本发明的目的之一是提供能够增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的含CpG的单链脱氧核苷酸，其可作为抗原或抗原组合物的佐剂来增强抗原或抗原组合物的免疫刺激作用。它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的含CpG的单链脱氧核苷酸至少包含选自下式的序列(1)(G)n(L)nX1+X2CGY1Y2(M)n(G)n，其中X1为A，T或G；X2为A或T；Y1为A或T；Y2为A，T或C；L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；优选地，含CpG的单链脱氧核苷酸具有选自下列任一所示的序列5’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO2)5’-ggggATAACgTTgCgggggg-3’(SEQ ID NO3)5’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’(SEQ ID NO4)5’-ggggTCCTACgTAggAgggggg-3’(SEQ ID NO8)5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’(SEQ ID NO23)5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’(SEQ ID NO37)5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’(SEQ ID NO38)
5’-gggggAATCgATTCgggggg-3’(SEQ ID NO101)5’-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3’(SEQ ID NO100)5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO102)5’-gggACgTACgTCgggggg-3’(SEQ ID NO105)5’-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO108)5’-ggCgATCgATCgATCggggggg-3’(SEQ ID NO111)5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3’(SEQ ID NO112)5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’(SEQ ID NO114)5’-ggGGTCAACGTTGAgggggG-3’(SEQ ID NO128)5’-gTCgTTTTCgTCgACgAATTgggggggg-3’(SEQ ID NO164)5’-gTCgTTATCgTTTTTTCgTAgggggg-3’(SEQ ID NO165)5’-ggCgTTAACgACgggggg-3’(SEQ ID NO166)5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’(SEQ ID NO52)5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO160)5’-gTCTATTTTgTACgTACgTgggg-3’(SEQ ID NO169)5’-gACgTCgACgTCgACgTCAggggg-3’(SEQ ID NO170)5’-ggggTCgATCgTTgCTAgCgggggg-3’(SEQ ID NO173)5’-gggggACgTTATCgTATTggggggg-3’(SEQ ID NO174)5’-ggggTCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO175)5’-ACgATCgATCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO180)5’-AgACgTCTAACgTCggggg-3’(SEQ ID NO168)5’-ggggTgCTggCCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO5)5’-ggggTCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO6)5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’(SEQ ID NO22)5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO28)(2)(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n，其中X为A或T；Y为A或T；L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；优选含CpG的单链脱氧核苷酸具有选自下列任一所示的序列5’-ggggACgATACgTCggggggg-3’(SEQ ID NO1)
5’-ggggACgATATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO7)5’-ggACgATCgATCgTgggggg-3’(SEQ ID NO99)5’-TCggggACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO106)5’-gggggATCgATATCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO107)5’-ggATCgATCgATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO110)5’-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO109)5’-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO104)5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO113)5’-gggggggTCgATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO171)5’-ggggTCgTCgAACgTTgggggg-3’(SEQ ID NO172)5’-TgTCgTTCCTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO16)5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’-3’(SEQ ID NO29)5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’(SEQ ID NO44)5’-TACAACggCgAggAATACC-3’(SEQ ID NO46)5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’(SEQ ID NO48)5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO49)5’-TgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO50)5’-gTCggCACgCgACg-3’(SEQ ID NO51)5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’(SEQ ID NO53)5’-TCCCgCTggACgTT-3’(SEQ ID NO68)5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’(SEQ ID NO75)5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’(SEQ ID NO76)5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’(SEQ ID NO88)5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’(SEQ ID NO89)5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO90)5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’(SEQ ID NO91)5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’(SEQ ID NO93)5’-TCATCgACTCTCgAgCgTTC-3’(SEQ ID NO117)5’-ATCgTCgACTCTCgTgTTCTC-3’(SEQ ID NO118)5’-TgCAgCTTgCTgCTTgCTgCTTC-3’(SEQ ID NO127)
5’-ggTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO136)5’-ggTCgAACgTTCgAgATgAT-3’(SEQ ID NO137)5’-gggggCgTCgTTTTCgTCgACgAATT-3’(SEQ ID NO143)5’-actcgagacgcccgttgatagctt-3’(SEQ ID NO145)5’-AACgTTggCgTCgACgTCAgCgCC-3’(SEQ ID NO146)5’-gACgTCgACgTTgACgCT-3’(SEQ ID NO147)5’-ggCgTTAACgTTAgCgCT-3’(SEQ ID NO148)5’-AgCgCTAgCgCTgACgTT-3’(SEQ ID NO149)5’-CTAgACgTTCAAgCgTT-3’(SEQ ID NO150)5’-gACgATCgTCgACgATCgTC-3’(SEQ ID NO156)5’-gTCgTTCgTAgTCgACTACgAgTT-3’(SEQ ID NO161)5’-AAAAgACgTCgACgTCgACgTCTTTT-3’(SEQ ID NO162)5’-TgCgACgATCgTCgCACgATCggAT-3’(SEQ ID NO176)5’-TgCgACgTCgCACAgCgT-3’(SEQ ID NO177)(3)(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n，其中L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；优选地，含CpG的单链脱氧核苷酸具有选自下列任一所示的序列5’-TCgTTgCCgTCgg-3’(SEQ ID NO59)5’-TCgTTgCCgTCggg-3’(SEQ ID NO60)5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’(SEQ ID NO61)5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’(SEQ ID NO62)5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO63)5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’(SEQ ID NO64)5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’(SEQ ID NO65)5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’(SEQ ID NO66)5’-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO103)5’-TCgTCgggTgCAACgTTgCAgggggg-3’(SEQ ID NO129)5’-TCgTCgggTgCgTCgACgCAgggggg-3’(SEQ ID NO130)5’-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO131)5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO132)
5’-TCgTCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO133)5’-TCgTCgCAgAACgTTCTgggggg-3’(SEQ ID NO134)5’-TCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO135)5’-TCgTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO139)5’-TCgTATgCATCgATgCATAgggAgg-3’(SEQ ID NO140)5’-TCgTgCATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO157)5’-TCgAAACgTTTCgggggg-3’(SEQ ID NO158)5’-TCggACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO159)5’-TCgAgCgATCgCTCgAgggggg-3’(SEQ ID NO179)5’-TCgTCgCTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO13)5’-TCgTCgTTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO11)5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO18)5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO19)5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’(SEQ ID NO21)5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO24)5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO80)5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’(SEQ ID NO84)5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’(SEQ ID NO85)5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO86)5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’(SEQ ID NO87)5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’(SEQ ID NO125)5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’(SEQ ID NO126)5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’(SEQ ID NO163)5’-AACgACgACgTTggggg-3’(SEQ ID NO167)(4)(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n，其中X1为A，T或G；X2为A或T；L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；优选地，含CpG的单链脱氧核苷酸具有选自下列任一所示的序列5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’(SEQ ID NO9)5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’(SEQ ID NO10)
5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO12)5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO14)5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’(SEQ ID NO15)5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’(SEQ ID NO17)5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO20)5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’(SEQ ID NO30)5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’(SEQ ID NO31)5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’-3’(SEQ ID NO32)5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’3’(SEQ ID NO33)5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’3’(SEQ ID NO34)5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’3’(SEQ ID NO35)5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’(SEQ ID NO36)5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO39)5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’(SEQ ID NO40)5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’(SEQ ID NO41)5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’(SEQ ID NO42)5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’(SEQ ID NO43)5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO45)5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’(SEQ ID NO47)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO54)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’(SEQ ID NO55)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’(SEQ ID NO56)5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’(SEQ ID NO57)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’(SEQ ID NO58)5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’(SEQ ID NO67)5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO69)5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’(SEQ ID NO70)5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’(SEQ ID NO71)5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO72)5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO73)
5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO74)5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’(SEQ ID NO77)5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO78)5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO79)5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO80)5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’(SEQ ID NO81)5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’(SEQ ID NO82)5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’(SEQ ID NO83)5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’(SEQ ID NO92)5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’(SEQ ID NO94)5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’(SEQ ID NO95)5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO96)5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’(SEQ ID NO97)5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’(SEQ ID NO98)5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO115)5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’(SEQ ID NO116)5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO119)5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO120)5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO121)5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO122)5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO123)5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO124)5’-TCgTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO138)5’-TCgTCgAgCgCTCgATCggAT-3’(SEQ ID NO141)5’-TCgTCgTTTCgTAgTCgTTgACgTCggg-3’(SEQ ID NO142)5’-TCgTCggACgTTTTCCgACgTTCT-3’(SEQ ID NO144)5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO151)5’-TCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTT-3；(SEQ ID NO152)5’-TCgTCgTTggTCggggTCgTTggggTCgTT-3’(SEQ ID NO153)5’-TCgTCgTTTCgTCTCTCgTT-3’(SEQ ID NO154)
5’-TCgTCgTTTTgCTgCgTCgTT-3’(SEQID NO155)5’-TCgAgCgTTTTCgCTCgAATT-3’(SEQ ID NO178)(5)包含TTCGTCG的序列。
优选地，含CpG的单链脱氧核苷酸具有选自下列任一所示的序列5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO25)’5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’-3’(SEQ ID NO26)5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO27)5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO119)5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO120)5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO123)5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO151)本发明所述的含CpG的单链脱氧核苷酸还包括单链脱氧核苷酸中碱基上各个基团的修饰，其中所述的修饰包括非硫代修饰、硫代修饰、部分硫代修饰、稀有碱基修饰(dI，dU等)、甲基化修饰、巯基、Aminolinker C6、或Thiol-C6 S-S等用于与其他物质偶联所应用的修饰方式。
本发明的另一个目的是提供由上述单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物所组成的疫苗组合物，其中抗原或抗原组合物的优选为由分枝杆菌热休克蛋白65和抗原肽形成的复合物或融合蛋白，该复合物或融合蛋白能诱生抗原特异性CTL的制剂。所述的抗原肽是指具有免疫原性的肽段或在和其它的蛋白质形成复合物、偶连物或融合蛋白状态下具有免疫原性的肽段，例如CN02122116.2中的多表位丙型肝炎病毒核心抗原抗原肽，该抗原肽对丙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染引起的相关疾病具有预防和治疗作用，具体序列如下Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile AspAsp Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala ProLeu Glu Asp Ser Glu Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly ProArg Leu Gly Val Arg Ala Glu Asn Asp Glu Ile Glu Gly Pro ArgLeu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn Asp GluLeu Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg GlnGlu Ile Asp Asn Glu
CN02141977.9中的沙眼衣原体主要为多表位抗原多肽，其对由衣原体和衣原体感染引起的相关疾病具有治疗和预防的作用，具体序列如下Glu Phe Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe ThrAsn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn Ile Trp Asp Glu Leu Asn Val LeuCys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val GlyLys Glu Phe Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp AlaSer Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr ArgLeu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala SerPhe Asp Ala Asp Thr Tyr Lys LeuCN01134935.2中的人前列腺特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞多表位的单拷贝抗原多肽，其对人的前列腺癌具有预防和治疗的作用，具体序列如下Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile SerAsn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr LysCN011026146中的MUC1抗原细胞毒性T淋巴细胞表位抗原肽，其对表达MUC1的肿瘤包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌细胞等具有预防和治疗的作用，具体序列如下Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro AspThr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly ValThr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala LeuCN011363479中的多表位HER-2抗原肽，其对表达HER-2的肿瘤包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、腺癌、前腺癌、结肠和直肠癌、非小细胞肺癌、肺腺癌等具有治疗和预防的作用，具体序列如下Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile GlnGlu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu ProGlu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln ProGlu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile本发明的另一目的在于提供一种生产疫苗组合物的方法，包括将有效量的含CpG的单链脱氧核苷酸与有效量的抗原或抗原组合物混合。优选将有效量的含CpG的单链脱氧核苷酸与有效量的由分枝杆菌热休克蛋白65和抗原肽形成的复合物或融合蛋白相混合。
本发明的另一方面提供了一种增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的方法，其是将含CpG的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物联合使用。
本发明的研究结果表明，当含CpG的单链脱氧核苷酸与由分枝杆菌热休克蛋白65和抗原肽形成的复合物或融合蛋白混合使用时，含CpG的单链脱氧核苷酸能够显著增强分枝杆菌热休克蛋白65抗原肽融合蛋白诱生抗原肽特异性CTL的活性，显著增强分枝杆菌热休克蛋白65抗原肽融合蛋白刺激小鼠抑制表达抗原肽肿瘤细胞生长的活性，显著增强分枝杆菌热休克蛋白65抗原肽融合蛋白诱生抗原肽特异性的抗肿瘤、抗病毒和抗衣原体感染的活性。
本发明的再一方面是提供疫苗组合物在制备用于治疗病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、变态反应或癌症的疫苗中的应用。包括将由含CpG的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物组成的免疫组合物施与需要治疗的人或哺乳动物。所述的病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、变态反应或癌症包括但并不局限于由丙型肝炎病毒感染引起的相关疾病、由衣原体和衣原体感染引起的相关疾病、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、腺癌、结肠和直肠癌、非小细胞肺癌、肺腺癌等。
具体实施例方式
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法、ELISA采用间接法。
在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。
实施例1CpG单链脱氧核苷酸的设计设计序列如下(1)(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)nX1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n为0-65’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO2)
5’-ggggATAACgTTgCgggggg-3’(SEQ ID NO3)5’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’(SEQ ID NO4)5’-ggggTCCTACgTAggAgggggg-3’(SEQ ID NO8)5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’(SEQ ID NO23)5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’(SEQ ID NO37)5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’(SEQ ID NO38)5’-gggggAATCgATTCgggggg-3’(SEQ ID NO101)5’-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3’(SEQ ID NO100)5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO102)5’-gggACgTACgTCgggggg-3’(SEQ ID NO105)5’-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO108)5’-ggCgATCgATCgATCggggggg-3’(SEQ ID NO111)5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3’(SEQ ID NO112)5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’(SEQ ID NO114)5’-ggGGTCAACGTTGAgggggG-3’(SEQ ID NO128)5’-gTCgTTTTCgTCgACgAATTgggggggg-3’(SEQ ID NO164)5’-gTCgTTATCgTTTTTTCgTAgggggg-3’(SEQ ID NO165)5’-ggCgTTAACgACgggggg-3’(SEQ ID NO166)5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’(SEQ ID NO52)5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO160)5’-gTCTATTTTgTACgTACgTgggg-3’(SEQ ID NO169)5’-gACgTCgACgTCgACgTCAggggg-3’(SEQ ID NO170)5’-ggggTCgATCgTTgCTAgCgggggg-3’(SEQ ID NO173)5’-gggggACgTTATCgTATTggggggg-3’(SEQ ID NO174)5’-ggggTCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO175)5’-ACgATCgATCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO180)5’-AgACgTCTAACgTCggggg-3’(SEQ ID NO168)5’-ggggTgCTggCCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO5)5’-ggggTCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO6)5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’(SEQ ID NO22)
5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO28)(2)(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)nX＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-65’-ggggACgATACgTCggggggg-3’(SEQ ID NO1)5’-ggggACgATATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO7)5’-ggACgATCgATCgTgggggg-3’(SEQ ID NO99)5’-TCggggACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO106)5’-gggggATCgATATCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO107)5’-ggATCgATCgATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO110)5’-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO109)5’-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO104)5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO113)5’-gggggggTCgATCgATgggggg-3’(SEQ ID NO171)5’-ggggTCgTCgAACgTTgggggg-3’(SEQ ID NO172)5’-TgTCgTTCCTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO16)5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’-3’(SEQ ID NO29)5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’(SEQ ID NO44)5’-TACAACggCgAggAATACC-3’(SEQ ID NO46)5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’(SEQ ID NO48)5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO49)5’-TgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO50)5’-gTCggCACgCgACg-3’(SEQ ID NO51)5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’(SEQ ID NO53)5’-TCCCgCTggACgTT-3’(SEQ ID NO685’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’(SEQ ID NO75)5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’(SEQ ID NO76)5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’(SEQ ID NO88)5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’(SEQ ID NO89)5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO90)
5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’(SEQ ID NO91)5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’(SEQ ID NO93)5’-TCATCgACTCTCgAgCgTTC-3’(SEQ ID NO117)5’-ATCgTCgACTCTCgTgTTCTC-3’(SEQ ID NO118)5’-TgCAgCTTgCTgCTTgCTgCTTC-3’(SEQ ID NO127)5’-ggTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO136)5’-ggTCgAACgTTCgAgATgAT-3’(SEQ ID NO137)5’-gggggCgTCgTTTTCgTCgACgAATT-3’(SEQ ID NO143)5’-actcgagacgcccgttgatagctt-3’(SEQ ID NO145)5’-AACgTTggCgTCgACgTCAgCgCC-3’(SEQ ID NO146)5’-gACgTCgACgTTgACgCT-3’(SEQ ID NO147)5’-ggCgTTAACgTTAgCgCT-3’(SEQ ID NO148)5’-AgCgCTAgCgCTgACgTT-3’(SEQ ID NO149)5’-CTAgACgTTCAAgCgTT-3’(SEQ ID NO150)5’-gACgATCgTCgACgATCgTC-3’(SEQ ID NO156)5’-gTCgTTCgTAgTCgACTACgAgTT-3’(SEQ ID NO161)5’-AAAAgACgTCgACgTCgACgTCTTTT-3’(SEQ ID NO162)5’-TgCgACgATCgTCgCACgATCggAT-3’(SEQ ID NO176)5’-TgCgACgTCgCACAgCgT-3’(SEQ ID NO177)(3)(TCG)n(L)nCG(M)n(G)nL，M＝A，T，C，G；n为0-65’-TCgTTgCCgTCgg-3’(SEQ ID NO59)5’-TCgTTgCCgTCggg-3’(SEQ ID NO60)5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’(SEQ ID NO61)5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’(SEQ ID NO62)5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO63)5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’(SEQ ID NO64)5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’(SEQ ID NO65)5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’(SEQ ID NO66)
5’-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO103)5’-TCgTCgggTgCAACgTTgCAgggggg-3’(SEQ ID NO129)5’-TCgTCgggTgCgTCgACgCAgggggg-3’(SEQ ID NO130)5’-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO131)5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO132)5’-TCgTCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO133)5’-TCgTCgCAgAACgTTCTgggggg-3’(SEQ ID NO134)5’-TCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO135)5’-TCgTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO139)5’-TCgTATgCATCgATgCATAgggAgg-3’(SEQ ID NO140)5’-TCgTgCATCgATgCAgggggg-3’(SEQ ID NO157)5’-TCgAAACgTTTCgggggg-3’(SEQ ID NO158)5’-TCggACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO159)5’-TCgAgCgATCgCTCgAgggggg-3’(SEQ ID NO179)5’-TCgTCgCTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO13)5’-TCgTCgTTTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO11)5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’(SEQ ID NO18)5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO19)5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’(SEQ ID NO21)5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’(SEQ ID NO24)5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO80)5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’(SEQ ID NO84)5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’(SEQ ID NO85)5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO86)5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’(SEQ ID NO87)5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’(SEQ ID NO125)5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’(SEQ ID NO126)5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’(SEQ ID NO163)5’-AACgACgACgTTggggg-3’(SEQ ID NO167)(4)(TCG)n(L)nX1X2CG (M)n
X1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n为0-6；5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’(SEQ ID NO9)5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’(SEQ ID NO10)5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO12)5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO14)5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’(SEQ ID NO15)5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’(SEQ ID NO17)5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO20)5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’(SEQ ID NO30)5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’(SEQ ID NO31)5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’-3’(SEQ ID NO32)5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’3’(SEQ ID NO33)5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’3’(SEQ ID NO34)5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’3’(SEQ ID NO35)5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’(SEQ ID NO36)5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’(SEQ ID NO39)5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’(SEQ ID NO40)5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’(SEQ ID NO41)5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’(SEQ ID NO42)5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’(SEQ ID NO43)5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’(SEQ ID NO45)5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’(SEQ ID NO47)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO54)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’(SEQ ID NO55)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’(SEQ ID NO56)5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’(SEQ ID NO57)5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’(SEQ ID NO58)5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’(SEQ ID NO67)5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’(SEQ ID NO69)5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’(SEQ ID NO70)
5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’(SEQ ID NO71)5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO72)5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO73)5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’(SEQ ID NO74)5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’(SEQ ID NO77)5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO78)5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’(SEQ ID NO79)5’-TCgTTCggggTgCCg-3’(SEQ ID NO80)5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’(SEQ ID NO81)5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’(SEQ ID NO82)5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’(SEQ ID NO83)5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’(SEQ ID NO92)5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’(SEQ ID NO94)5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’(SEQ ID NO95)5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’(SEQ ID NO96)5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’(SEQ ID NO97)5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’(SEQ ID NO98)5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO115)5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’(SEQ ID NO116)5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO119)5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO120)5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’(SEQ ID NO121)5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO122)5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO123)5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO124)5’-TCgTgCgACgTCgCAgATgAT-3’(SEQ ID NO138)5’-TCgTCgAgCgCTCgATCggAT-3’(SEQ ID NO141)5’-TCgTCgTTTCgTAgTCgTTgACgTCggg-3’(SEQ ID NO142)5’-TCgTCggACgTTTTCCgACgTTCT-3’(SEQ ID NO144)5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO151)
5’-TCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTT-3；(SEQ ID NO152)5’-TCgTCgTTggTCggggTCgTTggggTCgTT-3’(SEQ ID NO153)5’-TCgTCgTTTCgTCTCTCgTT-3’(SEQ ID NO154)5’-TCgTCgTTTTgCTgCgTCgTT-3’(SEQ ID NO155)5’-TCgAgCgTTTTCgCTCgAATT-3’(SEQ ID NO178)(5)包含TTCGTCG的序列5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO25)’5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’-3’(SEQ ID NO26)5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’(SEQ ID NO27)5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’(SEQ ID NO119)5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’(SEQ ID NO120)5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’(SEQ ID NO123)5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’(SEQ ID NO151)实施例2CpG单链脱氧核苷酸的合成DNA合成采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。
DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸，而是由3’端开始。具体的反应步骤如下一、脱保护基用三氯乙酸脱去连结在CpG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
二、活化将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与GpG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CpG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭缩合反应后为了防止连在CpG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CpG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CpG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
固相合成寡核苷酸是在DNA合成仪上进行的，上述方法合成的寡核苷酸在脱去保护基后，目的寡核苷酸纯度是极低的，含有大量的杂质，主要杂质有所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基以及合成时产生的短链等，以至于粗产品中寡核苷酸含量仅为15％左右。尽管合成时每一步的效率都在97％～98％，但累积的效率并不高。以链长20mer和50mer为例，(97.5％)20≈60％、(97.5％)50≈28％，可见在粗产品中目的寡核苷酸含量很低，甚至10％都不到。这些杂质，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，造成定量不准，影响下一步的反应，因此必须对寡核苷酸进行纯化。建议采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，该方法纯化的产品纯度高，可用于绝大部份的分子生物学实验，可避免许多意想不到的麻烦。若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用脱盐纯化即可。
寡核苷酸DNA是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中，260nm波长下吸光度为1的寡核苷酸溶液定义为1OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说，其碱基的组成不尽相同，但1260OD寡核苷酸DNA的重量约为33μg。
实施例3含CpG的单链脱氧核苷酸对热休克蛋白丙型肝炎病毒抗原肽融合蛋白免疫刺激作用的增强作用一、丙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤试验1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和多表位HCV核心抗原融合蛋白(HSP-HCV)，含CpG的脱氧寡核苷酸(CpG ODN)，转染HCV核心抗原多表位抗原肽基因的B16细胞(HCV+B16细胞)。CpG ODN1(SEQ ID NO7)，CpG ODN2(SEQ ID NO106)，CpG ODN3(SEQ ID NO103)，CpG ODN4(SEQ ID NO18)，CpG ODN5(SEQ ID NO86)，CpG ODN6(SEQ ID NO79)，CpG ODN7(SEQ ID NO95)，CpG ODN8(SEQ ID NO123)，CpG ODN9(SEQ ID NO124)，CpG ODN10(SEQ ID NO159)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雄性C57/BL6小鼠40只，每组10只小鼠，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-HCV组(注射20μg HSP-HCV)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-HCV+CpG ODN组(注射20μg HSP-HCV，50μg CpG ODN)。HSP-HCV和CpGODN分别用PBS配制成所需浓度，HSP-HCV+CpG ODN组是将HSP-HCV和CpGODN混合后注射。
3、实验方法(1)注射于第1，14和21天分别给各组小鼠注射生理盐水、HSP-HCV应用液、CpG ODN应用液和HSP-HCV+CpG ODN混合液。
(2)制备效应细胞在第26天将小鼠脱颈处死。按常规方法取小鼠脾细胞或淋巴结细胞，制备单细胞悬液。用含10％FBS的IMDM培养基重悬细胞，加入10％的ConA刺激的小鼠睥细胞和条件培养基及HSP-HCV(20μg/ml)。37℃，5％CO2培养7天。收获小鼠脾细胞做效应细胞。
(3)制备靶细胞采用10％FBS的IMDM培养基培养HCV+B16细胞。用51Cr标记HCV+B16细胞(在37℃，5％CO2条件下培养1小时)。用含10％FBS的IMDM洗涤细胞，共三次。
(4)细胞毒实验将51Cr标记HCV+B16细胞于10％FBS的IMDM培养基中加入到96孔培养板的孔中，每孔100μl，含1×104个细胞。按100∶1效靶比加入效应细胞(100μl)，设三个重复孔。37℃，5％CO2培养4-6小时。将96孔培养板离心5分钟(3000rpm)。自每孔吸出100μl上清，测放射性。按下述公式计算效应细胞的细胞毒活性，以特异性杀伤率表示。
特异杀伤率(％)＝实验孔rpm-自发释放rpm/最大释放rpm-自发释放rpm4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表1-1CpG ODN对HSP65-HCV诱生特异性CTL活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强热休克蛋白丙型肝炎病毒抗原肽融合蛋白免疫诱生HCV核心抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的活性(p＜0.05)。这种CTL在体内可杀伤HCV感染的细胞。因此，含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强热休克蛋白丙型肝炎病毒抗原肽融合蛋白的抗病毒(包括但不限于丙型肝炎病毒)活性。
二、体内杀伤HCV感染细胞的实验转染HCV核心抗原多表位抗原肽基因的B16细胞(HCV+B16细胞)可作为丙型肝炎病毒感染的细胞模型(CN02122116.2)。观察小鼠抑制这种B16细胞生长的能力，可检测注射含CpG单链脱氧核苷酸(CpG ODN)和结核杆菌热休克蛋白65多表位HCV核心抗原融合蛋白刺激小鼠CTL在体内杀伤感染HCV细胞的活性。
1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和多表位HCV核心抗原融合蛋白(HSP-HCV)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染HCV核心抗原多表位抗原肽基因的B16细胞(HCV+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雄性C57/BL6小鼠40只，每组10只，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-HCV组(注射20μg HSP-HCV)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)和HSP-HCV+CpG ODN组(注射20μg HSP-HCV，50μgCpG ODN)，。
3、实验方法(1)注射HSP-HCV和CpGODN分别用PBS配制成所需浓度，HSP-HCV+CpG ODN组是将HSP-HCV和CpGODN混合后注射。于第1，14和21天分别给各组小鼠注射生理盐水、HSP-HCV、CpG ODN和HSP-HCV+CpG ODN。于第24天接种HCV+B16细胞(1×105个/只)，注射部位是小鼠右侧背部皮下。
(2)取肿瘤并称重在接种肿瘤后的第15天，杀死小鼠取肿瘤并称取肿瘤的重量。
4、实验结果表1-2 CpG ODN对HSP65-HCV刺激小鼠CTL在体内杀伤感染HCV细胞活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)可显著增强结核杆菌热休克蛋白65多表位HCV核心抗原融合蛋白刺激小鼠CTL在体内杀伤感染HCV细胞的活性(p＜0.05)，其表现是联合应用CpG ODN和结核杆菌热休克蛋白65多表位HCV核心抗原融合蛋白的小鼠抑制表达HCV核心抗原的肿瘤细胞的生长能力显著增强。
实施例4含CpG的单链脱氧核苷酸对热休克蛋白沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽融合蛋白诱生特异性CTL活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65和沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原肽融合蛋白(HSP65-Chla)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原肽基因的B16细胞(Chla+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雌性C57/BL6小鼠40只，每组10只，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP65-Chla组(注射20μg HSP65-Chla)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP65-Chla+CpG ODN组(注射20μg HSP65-Chla，50μg CpG ODN)。
3、实验方法(1)注射HSP65-Chla和CpGODN分别用PBS配制成所需浓度，HSP65-Chla+CpG ODN组是将HSP65-Chla和CpGODN混合后注射。于第1，14和21天分别给各组小鼠注射生理盐水、HSP65-Chla、CpG ODN和HSP65-Chla+CpG ODN。
(2)制备效应细胞在第26天将小鼠脱颈处死。按常规方法取小鼠脾细胞或淋巴结细胞，以下操作如实施例1的相关表述。
(3)制备靶细胞采用10％FBS的IMDM培养基培养Chla+B16细胞。用51Cr标记的Chla+B16细胞做靶细胞，下述操作如实施例1的相关表述。
(4)细胞毒实验将51Cr标记的Chla+B16细胞于10％FBS的IMDM培养基中加入到96孔培养板的孔中，下述操作和细胞毒的计算如实施例1的相关表述。
4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表2CpG ODN对HSP-Chla诱生特异性CTL活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65和沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原肽融合蛋白诱生衣原体特异性CTL的活性(p＜0.05)。这种CTL在体内可杀伤感染衣原体的细胞。因此，含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65和沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原肽融合蛋白治疗和预防衣原体感染及其相关疾病的活性。
实施例5含CpG的单链脱氧核苷酸对结核杆菌热休克蛋白65和人前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)表位抗原肽融合蛋白免疫刺激作用的增强作用一、CpG ODN对HSP65-HCV诱生特异性CTL活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和人前列腺特异性抗原(Prostate specificantigen，PSA)抗原肽融合蛋白(HSP-PSA)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染PSA抗原肽基因的B16细胞(PSA+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雄性C57/BL6小鼠40只，每组10只，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-PSA组(注射20μg HSP-PSA)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-PSA+CpG ODN组(注射20μg HSP-PSA，50μg CpG ODN)。
3、实验方法(1)注射于第1，14和21天分别给各组小鼠注射生理盐水、HSP-PSA、CpG ODN和HSP-PSA+CpG ODN。
(2)制备效应细胞在第26天将小鼠脱颈处死。按常规方法取小鼠脾细胞或淋巴结细胞，制备单细胞悬液。用含10％FBS的IMDM培养基重悬细胞，加入10％的ConA刺激的小鼠睥细胞条件培养基及HSP-PSA(200μg/ml)。37℃，5％CO2培养7天。收获细胞做效应细胞。
(3)制备靶细胞采用含10％FBS的IMDM培养基培养转染PSA抗原肽基因的B16细胞(PSA+B16细胞)。用51Cr标记PSA+B16细胞，(培养1小时，37℃，5％CO2)。用含10％FBS的IMDM洗涤细胞，共三次。
(4)细胞毒实验将51Cr标记PSA+B16细胞于10％FBS的IMDM培养基中加入到96孔培养板的孔中，每孔100μl，含1×104个细胞。按100∶1效靶比加入效应细胞，设三复孔。下述操作和细胞毒的计算如实施例1的相关表述。
4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表3-1CpG ODN对HSP-PSA诱生特异性CTL活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65与PSA抗原肽融合蛋白免疫诱生PSA特异性CTL的活性(p＜0.05)，这种CTL可杀伤表达PSA的肿瘤细胞。因此，含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强热休克蛋白PSA抗原肽融合蛋白预防和治疗前列腺癌的生物学活性。
二、CpG ODN对HSP65-PSA抗表达PSA肿瘤活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和人前列腺特异性抗原(Prostate specificantigen，PSA)抗原肽融合蛋白(HSP-PSA)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染PSA抗原肽基因的B16细胞(PSA+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雄性C57/BL6小鼠40只，每组10只，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-PSA组(注射20μg HSP-PSA)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-PSA+CpG ODN组(注射20μg HSP-PSA，50μg CpG ODN)。
3、实验方法(1)注射HSP-PSA和CpG ODN用PBS配制，HSP-PSA+CpG ODN组是将HSP-PSA和CpG ODN混合后注射。于第1，14和21天分别给小鼠注射生理盐水、HSP-PSA、CpG ODN和HSP-PSA+CpG ODN。于第28天接种PSA+B16细胞(1×105/只)，注射部位是小鼠右后背部皮下。
(2)取肿瘤并称重在接种肿瘤后的第15天，杀死小鼠取肿瘤并称肿瘤的重量。
4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表3-2CpG ODN对HSP65-PSA抗表达PSA肿瘤活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65与PSA抗原肽融合蛋白抑制表达PSA肿瘤细胞的生长(p＜0.05)。含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强热休克蛋白与PSA抗原肽融合蛋白预防和治疗前列腺癌的生物学活性。
实施例6含CpG的单链脱氧核苷酸对热休克蛋白-MUC1抗原肽融合蛋白免疫刺激作用的增强作用一、CpG ODN对HSP65-MUC1诱生特异性CTL活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和MUC1抗原肽融合蛋白(HSP-MUC1)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染MUC1抗原肽基因的B16细胞(MUC1+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雌性C57/BL6小鼠40只，每组10只，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-MUC1组(注射20μg HSP-MUC1)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-MUC1+CpG ODN组(注射20μg HSP-MUC1，50μg CpG ODN)。
3、实验方法(1)注射HSP-MUC1和CpG ODN用PBS配制至所需浓度，HSP-MUC1+CpG ODN组是将HSP-MUC1和CpG ODN混合后注射。于第1，14和21天分别给各组小鼠注射生理盐水、HSP-MUC1、CpG ODN和HSP-MUC1+CpG ODN。
(2)制备效应细胞在第26天将小鼠脱颈处死。按常规方法取小鼠脾细胞或淋巴结细胞，制备单细胞悬液。用含10％FBS的IMDM培养基重悬细胞，加入10％的ConA刺激的小鼠睥细胞条件培养基及HSP-MUC1(200μg/ml)。37℃，5％CO2培养7天。收获细胞做效应细胞。
(3)制备靶细胞采用10％FBS的IMDM培养基培养MUC1+B16细胞。用51Cr标记PSA+B16细胞(培养1小时，37℃，5％CO2)。用含10％FBS的IMDM洗涤细胞，共三次。
(4)细胞毒实验将51Cr标记MUC1+B16细胞于10％FBS的IMDM培养基中加入到96孔培养板的孔中，每孔100μl，含1×104个细胞。按100∶1效靶比加入效应细胞，设三复孔。下述操作和细胞毒的计算如实施例1的相关表述。
4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表4-1CpG ODN对HSP65-MUC1诱生特异性CTL活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白诱生MUC1特异性细胞毒性T淋巴细胞的活性(p＜0.05)，这种CTL可杀伤表达MUC1的肿瘤细胞。因此，含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白预防和治疗表达MUC1肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等的生物学活性。
二、CpG ODN对HSP65-MUC1抗表达MUC1肿瘤活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和MUC1抗原肽融合蛋白(HSP-MUC1)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染MUC1抗原肽基因的B16细胞(MUC1+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雌性C57/BL6小鼠，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-MUC1组(注射20μg HSP-MUC1)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-MUC1+CpG ODN组(注射20μg HSP-MUC1，50μg CpG ODN)，每组10只。
3、实验方法(1)注射于第28天接种MUC1+B16细胞(1×105/只)，注射部位是小鼠右后背部皮下。
(2)取肿瘤并称重在接种肿瘤后的第15天，杀死小鼠并称肿瘤的重量。
4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表4-2CpG ODN对HSP65-MUC1抗表达MUC1肿瘤活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白抑制表达MUC1肿瘤细胞的生长(p＜0.05)。含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白预防和治疗表达MUC1肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等的生物学活性。
实施例7含CpG的单链脱氧核苷酸对热休克蛋白HER2抗原肽融合蛋白免疫刺激作用的增强作用一、CpG ODN对HSP65-HER-2诱生特异性CTL活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65和HER-2抗原肽融合蛋白(HSP-HER-2)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染HER-2抗原肽基因的B16细胞(HER-2+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雌性C57/BL6小鼠，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-HER-2组(注射20μg HSP-HER-2)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-HER-2+CpG ODN组(注射20μg HSP-HER-2，50μg CpG ODN)，每组10只。
3、实验方法(1)注射HSP-HER-2和CpG ODN用PBS配制，HSP-HER-2+CpG ODN是将HSP-HER-2和CpG ODN混合后注射。于第1，14和21天分别给小鼠注射生理盐水、HSP-HER-2、CpG ODN和HSP-HER-2+CpG ODN。
(2)制备效应细胞在第26天将小鼠脱颈处死。按常规方法取小鼠脾细胞或淋巴结细胞，制备单细胞悬液。用含10％FBS的IMDM培养基重悬细胞，加入10％的ConA刺激的小鼠睥细胞条件培养基及HSP-HER-2(200μg/ml)。37℃，5％CO2培养7天。收获细胞做效应细胞。
(3)制备靶细胞采用10％FBS的IMDM培养基培养转染HER-2抗原肽基因的B16细胞(HER-2+B16细胞)。用51Cr标记HER-2+B16细胞(培养1小时，37℃，5％CO2)。用含10％FBS的IMDM洗涤细胞，共三次。
(4)细胞毒实验将51Cr标记HER-2+B16细胞于10％FBS的IMDM培养基中加入到96孔培养板的孔中，每孔100μl，含1×104个细胞。按100∶1效靶比加入效应细胞，设三复孔。
下述操作和细胞毒的计算如实施例1的相关表述。
4、实验结果
结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表5-1CpG ODN对HSP65-HHER-2诱生特异性CTL活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白与HER-2抗原肽融合蛋白免疫诱生HER-2特异性细胞毒性T淋巴细胞的活性(p＜0.05)，这种CTL可杀伤表达HER-2的肿瘤细胞。因此，含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65与HER-2抗原肽融合蛋白预防和治疗表达HER-2肿瘤如乳腺癌和卵巢癌等的生物学活性。
二、CpG ODN对HSP65-HER-2抗表达HER-2肿瘤活性的增强作用1、材料结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)和HER-2抗原肽融合蛋白(HSP-HER-2)，含CpG的单链脱氧核苷酸(CpG ODN)，转染HER-2抗原肽基因的B16细胞(HER-2+B16细胞)。
2、实验动物及分组采用6-8周的雌性C57/BL6小鼠，分为生理盐水组(注射生理盐水)，HSP-HER-2组(注射20μg HSP-HER-2)，CpG ODN组(注射50μg CpG ODN)，HSP-HER-2+CpG ODN组(注射20μg HSP-HER-2，50μg CpG ODN)，每组10只。
3、实验方法(1)注射于第1，14和21天分别给小鼠注射生理盐水、HSP-HER-2、CpG ODN和HSP-HER-2+CpG ODN。于第28天接种HER-2+B16细胞(1×105/只)，注射部位是小鼠右后背部皮下。
(2)取肿瘤并称重在接种肿瘤后的第15天，杀死小鼠并称肿瘤的重量。
4、实验结果结果见下表，其中的数据代表的10只老鼠数据的均值(n＝10)。
表5-2CpG ODN对HSP65-HER-2抗表达HER-2肿瘤活性的增强作用
5、结论含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65与HER-2抗原肽融合蛋白抑制表达HER-2肿瘤细胞的生长(p＜0.05)。含CpG的单链脱氧核苷酸可明显增强结核杆菌热休克蛋白65与HER-2抗原肽融合蛋白预防和治疗表达HER-2肿瘤如乳腺癌和卵巢癌等的生物学活性。
序列表<110>长春华普生物技术有限公司<120>含CpG的单链脱氧核苷酸与其疫苗组合物及其应用<160>180<210>1<211>21<212>DNA<213>artificial<400>1ggggacgata cgtcgggggg g 21<210>2<211>22<212>DNA<213>artificial<400>2ggggtcgttc gtcgttgggg gg 22<210>3<211>20<212>DNA<213>artificial<400>3ggggataacg ttgcgggggg20<210>4<211>21<212>DNA<213>artificial<400>4ggggtgcaac gttcaggggg g 21
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权利要求
1.一种可以增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的含CpG的单链脱氧核苷酸，其特征在于，所述单链脱氧核苷酸至少包含选自下式的序列(1)(G)n(L)nX1X2CGY1Y2(M)n(G)n，其中X1为A，T或G；X2为A或T；Y1为A或T；Y2为A，T或C；L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；(2)(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n，其中X为A或T；Y为A或T；L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；(3)(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n，其中L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；(4)(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n，其中X1为A，T或G；X2为A或T；L和M分别为A，T，C或G；n为0-6的整数；(5)包含TTCGTCG的序列。
2.根据权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，所述的单链脱氧核苷酸选自SEQ ID NO1-185任一所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的单链脱氧核苷酸，所述的单链脱氧核苷酸还包括在其碱基上各个基团的修饰。
4.根据权利要求3所述的单链脱氧核苷酸，所述的修饰包括非硫代修饰、硫代修饰、部分硫代修饰、稀有碱基修饰、甲基化修饰、巯基、Aminolinker C6、或Thiol-C6S-S用于与其他物质偶联所应用的修饰方式。
5.根据权利要求1至4中任一所述的单链脱氧核苷酸，所述的抗原或抗原组合物为热休克蛋白与抗原肽融合所形成的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的单链脱氧核苷酸，所述的热休克蛋白为结核杆菌热休克蛋白65。
7.根据权利要求5所述的单链脱氧核苷酸，所述的抗原肽选自多表位丙型肝炎病毒核心抗原肽、沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽、人前列腺特异性抗原肽、MUC1抗原肽或HER-2抗原肽。
8.一种疫苗组合物，包含权利要求1至4任一所述的单链脱氧核苷酸和抗原或抗原组合物。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，所述的抗原或抗原组合物为热休克蛋白与抗原肽融合所形成的融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，所述的热休克蛋白为结核杆菌热休克蛋白65。
11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，所述的抗原肽为多表位丙型肝炎病毒核心抗原肽。
12.根据权利要求9所述的疫苗组合物，所述的抗原肽为沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽。
13.根据权利要求9所述的疫苗组合物，所述的抗原肽为人前列腺特异性抗原肽。
14.根据权利要求9所述的疫苗组合物，所述的抗原肽为MUC1抗原肽。
15.根据权利要求9所述的疫苗组合物，所述的抗原肽为HER-2抗原肽。
16.一种生产权利要求8所述疫苗组合物的方法，包括将权利要求1至4任一所述的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物混合。
17.根据权利要求16所述的方法，所述抗原或抗原组合物为热休克蛋白与抗原肽融合所形成的融合蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法，所述的热休克蛋白为结核杆菌热休克蛋白65。
19.根据权利要求17所述的方法，所述的抗原肽为多表位丙型肝炎病毒核心抗原肽。
20.根据权利要求17所述的方法，所述的抗原肽为沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽。
21.根据权利要求17所述的方法，所述的抗原肽为人前列腺特异性抗原肽。
22.根据权利要求17所述的方法，所述的抗原肽为MUC1抗原肽。
23.根据权利要求17所述的生方法，所述的抗原肽为HER-2抗原肽。
24.一种增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的方法，包括将权利要求1至4任一所述的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物联合应用。
25.根据权利要求24所述的方法，所述抗原或抗原组合物为热休克蛋白与抗原肽融合所形成的融合蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法，所述的热休克蛋白为结核杆菌热休克蛋白65。
27.根据权利要求25所述的方法，所述的抗原肽为多表位丙型肝炎病毒核心抗原肽。
28.根据权利要求25所述的方法，所述的抗原肽为沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽。
29.根据权利要求25所述的方法，所述的抗原肽为人前列腺特异性抗原肽。
30.根据权利要求25所述的方法，所述的抗原肽为MUC1抗原肽。
31.根据权利要求25所述的方法，所述的抗原肽为HER-2抗原肽。
32.权利要求8至15中任一所述的疫苗组合物在制备用于治疗病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、变态反应或癌症的疫苗中的应用。
33.根据权利要求32的应用，所述疫苗组合物的应用对象为人类或哺乳类动物。
34.根据权利要求32的应用，所述的病毒感染为丙型肝炎病毒感染或由该病毒感染引起的相关疾病。
35.根据权利要求32的应用，所述的细菌感染为衣原体感染或由衣原体感染引起的相关疾病。
36.根据权利要求32的应用，所述的癌症为前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、腺癌、结肠和直肠癌、非小细胞肺癌或肺腺癌。
全文摘要
本发明涉及一种能够增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的含CpG的单链脱氧核苷酸，以及由所述单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物所组成的疫苗组合物及其制备方法，其中含CpG的单链脱氧核苷酸能够显著增强热休克蛋白－抗原肽融合蛋白诱生抗原肽特异性CTL的活性，显著增强热休克蛋白－抗原肽融合蛋白诱生抗原肽特异性的抗肿瘤、抗病毒和抗衣原体感染的活性。此外，本发明还涉及含CpG的单链脱氧核苷酸在制备疫苗组合物中的应用及其增强免疫刺激作用的方法，所述的疫苗组合物可作为药物在治疗病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、变态反应或癌症等相关疾病中的应用。
文档编号A61K39/39GK1810970SQ20051000295
公开日2006年8月2日 申请日期2005年1月27日 优先权日2005年1月27日
发明者王丽颖, 包木胜, 于永利 申请人:长春华普生物技术有限公司