专利名称：一种促肝细胞生长蛋白质的制备工艺及其注射剂制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术药物的制造。特别涉及促肝细胞生长素、它的制备方法和应用。
背景技术：
促肝细胞生长素是一种刺激新生的人和动物肝细胞DNA合成的药物，该药物可促进肝细胞再生，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能，改善肝脏枯否细胞的吞噬功能，防止来自肠道的毒素对肝细胞的进一步损害，促进肝坏死后的修复。对肝细胞损伤有保护作用。对肝衰竭有明显的提高存活力的作用。
促肝细胞生长素目前已经有产品上市，是以乳牛或乳猪的新鲜肝脏器官为原料，经过生化加工制备得到的。
目前的促肝细胞生长素的制备由于大量使用动物脏器，使成本增加，同时由于工艺条件的限制，难以提高产量，生物活性不高。
本发明采用新的工艺，提高了产率，避免了浪费，提高了生物活性，具有工业化应用价值。
发明内容
本发明提供一种促肝细胞生长素的制备方法，该方法是以出生一个月内的乳牛或乳猪的新鲜肝脏为原料，经过提取纯化工艺制备而成的。
本发明还提供用本发明方法制备的促肝细胞生长素，它是一种混合的蛋白质类物质，具备保肝护肝的生物效应。可以用于制备疗效确切的治疗肝病的药物。本发明的促肝细胞生长素，优选的是促肝细胞生长素，主要活性组份蛋白质的分子量为2.1万道尔顿。
本发明还提供用本发明的促肝细胞生长素作为药物活性成分制备的注射用药物制剂，该药物制剂优选的是水针剂或冻干粉针剂。作为水针剂，每2毫升含本发明的促肝细胞生长素活性蛋白质15～45μg；作为冻干粉针剂，每支含本发明的促肝细胞生长素活性蛋白质15～45μg。
本发明的促肝细胞生长素是以出生一个月内的乳牛或乳猪的新鲜的肝脏为原料制备的，其步骤包括(1)对获得的乳牛或乳猪的新鲜肝脏进行刺激；(2)分散乳化使细胞破碎；(3)加入溶剂并加热；(4)冷冻沉淀杂质；(5)离心得到粗提液；(6)柱层析得洗脱液；(7)洗脱液用超滤膜超滤，纯化得2～4万道尔顿区间的药物活性蛋白质。
本发明的注射剂，是通过将上述本发明的药物活性物质加入药物可接受的辅料，按照制剂学常规技术进一步加工得到的。
本发明的促肝细胞生长素药物活性物质的制备方法具体可以经过以下步骤1、对获得的新鲜肝脏进行刺激选取经免疫检验合格的出生一个月内的乳牛或乳猪，其宰杀后应立即取肝脏，并用刀立即将肝脏分割成6-8块、4℃放置1小时进行刺激。
2、分散乳化使细胞破碎。
将分割放置的肝脏用绞肉机打成0.5cm的小块，然后以分散乳化机乳化20分钟，得到细腻均匀、呈乳白色的分散乳化液。
3、加入溶剂并加热将分散乳化液，加入3倍体积PH 3.5的0.84％的盐水。加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达到0.05％，搅拌1小时。对上述液体加热，至料液温度80℃恒温15分钟，接着加热至90℃恒温20分钟，4、冷冻沉淀水冷却至室温，转入4℃冷库存放48小时，以沉淀油脂、杂蛋白和十二烷基肌氨酸钠。
5、离心得到粗提液取上清液，用无纺布过滤，用离心机离心，得澄清的粗提液。
6、柱层析将粗提液上层析柱，层析介质可以是阴离子(如阴离子大孔树脂、DE32-纤维素、DE52-纤维素、DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose)或阳离子(如阳离子大孔树脂、CM-纤维素、CM-Sephadex、CM-Sepharose)，然后先后用A洗液和B洗液洗脱收集洗脱液。
7、洗脱液用超滤膜超滤对洗脱液，以分子量为4万和1万道尔顿的超滤膜超滤，经纯化得到2-4万道尔顿区间的蛋白质，并除盐。
本发明制备中所述的A洗液是指含氯化钠0.20M的0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液；所述的B洗液是指含氯化钠0.70M的0.05mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液。
本发明的注射剂，具体可以通过以下方法制备对上述纯化的本发明的促肝细胞生长素药物活性物质进行含量测定，步骤是，调整液体的PH至6.5-7.0，以福林酚法测定促肝细胞生长素药物活性物质的含量，并调整至灌装浓度。将调整完浓度的促肝细胞生长素溶液，过滤除菌、除热原、加入或不加入辅料，灌装、制成水针剂，进一步的可以经过冷冻，制成冻干粉针剂。
本发明促肝细胞生长素能促进肝细胞DNA合成，使肝细胞再生，可用于慢性肝炎、重症肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治疗。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果1、药理作用1.1实验性部分利用本发明的促肝细胞生长素，对切除大鼠肝脏后进行观察，10天左右，可使肝脏功能恢复到原有水平；可明显刺激单层培养的正常大鼠肝细胞DNA合成增加。
1.2促肝细胞生长素的生物效应(1)能明显刺激新生肝细胞的DNA合成，促进损伤的肝细胞线粒体、粗面内质网恢复，促进肝细胞再生，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能。
(2)改善肝脏枯否细胞的吞噬功能，防止来自肠道的毒素对肝细胞的进一步损害，抑制肿瘤坏死因子(TNF)活性和Na+，K+，-ATP酶活性抑制因子活性，从而促进肝坏死后的修复。同时具有降低转氨酶、血清胆红素和缩短凝血酶原时间的作用。
(3)对四氯化碳诱导的肝细胞损伤有较好的保护作用。
(4)对D-氨基半乳糖诱致的肝衰竭有明显的提高存活力的作用。
2、临床应用(1)重症肝炎中国医科大学等单位，在综合治疗的基础上加用促肝细胞生长素(PHGF)治疗重症肝炎1687例(对照组1196例)，两组病死率对比PHGF组36.2％，对照组58.8％(P＜0.01)。认为促肝细胞生长素具有促进肝细胞DNA合成，促使肝细胞再生修复。降低内毒素血症及白细胞介素6(IL 6)，白细胞介素8(IL 8)水平，减少细胞膜脂质过氧化等作用，并能抑制肝细胞坏死和炎症反应。PHGF能抑制肝组织损伤时肝细胞Fas抗原表达，阻断CTL细胞引起肝细胞凋亡。
(2)慢性活动性肝炎上海市传染病医院等单位应用促肝细胞生长素治疗慢性活动性肝炎1668例，对照组1084例，结果证明PHGF在降低丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、血清胆红素(SB)的平均复常天数均优于对照组。这与PHGF促进肝细胞再生，恢复肝功能，调节免疫有关。
(3)肝硬化应用PHGF治疗肝硬化34例，治疗43d，结果治疗组肝、脾缩小，消除腹腔积液等均优于对照组。北京地坛医院等15家单位应用促肝细胞生长素治疗肝硬化333例，对照组307例，结果促肝细胞生长素不仅具有降酶、退黄作用，而且能提高血清清蛋白和消除腹腔积液，明显优于对照组。
(4)甲胎蛋白(AFP)异常升高应用PHGF治疗AFP升高48例，4周后PHGF治疗组有效率82.1％，对照组62.5％，两组比较差异有显著性(P＜0.05)。
(5)肝性脑病重症肝炎血清中存在Na+K+ATP酶活性抑制因子(中分子物质)，通过抑制Na+K+ATP酶的活性，引起脑细胞功能紊乱，导致脑水肿和肝性脑病。对4例重症肝炎治疗前后Na+K+ATP酶进行测定，分别为3.047±1.624和1.444±0.250。说明用促肝细胞生长素可缓解血清中中分子物质对Na+K+ATP酶活性的抑制作用。应用促肝细胞生长素治疗重症肝炎肝性脑病的病死率53.57％，综合治疗组79.17％。提示促肝细胞生长素可降低重症肝炎肝性脑病的病死率。
(6)抗肝纤维化对28例慢性肝病患者用PHGF治疗前后进行2次肝穿刺，表明促肝细胞生长素治疗后肝细胞变性(胞浆疏松，气球样变、嗜酸性变和各种炎型的坏死)均有不同程度减轻，特别是对慢性活动性肝炎的特征改变-碎屑样坏死，近半数缩小。成纤维组织增生明显减轻，提示PHGF对肝细胞炎症性损伤有良好修复和抗肝纤维化作用。
(7)药物性肝损伤以硫代乙酰胺(TAA)复制体外培养大鼠肝细胞损伤模型，结果培养递质中加入TAA后，乳酸脱氢酶(LDH)逸出量明显增加，肝细胞增生指数下降，上清液和细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性显著下降。TAA和促肝细胞生长素合用，则肝细胞逸出的LDH明显减少，增生指数上升并超过正常对照组，上清液和细胞内SOD显著升高。说明PHGF能阻止肝细胞TAA损伤和促进肝细胞再生的作用。
(8)原发性肝癌辅助治疗29例晚期原发性肝癌患者分别采用肝动脉门静脉双置泵化疗和静脉化疗，促肝细胞生长素辅助治疗，将单纯化疗组作为对照组。结果使用PHGF患者无血细胞减少和肝功能改变等不良反应。置泵组、静脉组、对照组分别平均生存9.0，6.5，3.6个月。提示促肝细胞生长素与化疗药物使用后可改善症状，减少化疗不良反应，缩小肿瘤，延长生存期；促进外周单核细胞产生干扰素，增强机体抗肿瘤免疫活性。
本发明采用的新的制备方法，提高了促肝细胞生长素产率，避免了浪费，同时提高了促肝细胞生长素的生物活性，降低了副作用，生产成本低，具有工业化应用价值。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1促肝细胞生长素注射剂的制备1、肝脏选取选取经免疫检验合格的出生一个月内的乳猪，其宰杀后应立即取肝脏，并用刀立即将肝脏分割成6-8块、4℃放置1小时进行刺激。
2、分散乳化将分割放置的肝脏用绞肉机打成0.5cm的小块，然后以分散乳化机乳化20分钟，得到细腻均匀、呈乳白色的分散乳化液。
3、破碎细胞将分散乳化液，加入3倍体积PH3.5的0.84％的盐水5。加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达到0.05％，搅拌1小时。
4、加热冷沉对提取液加热，至料液温度80℃恒温15分钟，接着加热至90℃恒温20分钟，水冷却至室温，转入4℃冷库存放48小时，以沉淀油脂、杂蛋白和十二烷基肌氨酸钠。
5、离心澄清取上清液，用无纺布过滤，用离心机离心，得澄清的粗提液。
6、层析将粗提液上层析柱，层析介质为DE-52纤维素。层析后，先后用A洗液(pH8.0含氯化钠0.20M的0.05mol/LTris-HCl溶液)和B洗液(pH8.0含氯化钠0.70M的0.05mol/LTris-HCl溶液)洗脱，收集洗脱液。
7、超滤对洗脱液，以分子量为4万和1万道尔顿的超滤膜超滤，纯化得到2-4万道尔顿区间的蛋白质；同时除盐。
8、含量测定对以上得到的纯化液，调PH至6.5-7.0，以福林酚法测定蛋白质含量，合格后调整至灌装浓度。
9、过滤除菌、除热原，灌装将调整浓度后的促肝细胞生长素溶液，过滤除菌、除热原，灌装，制成水针剂。实施例2福林酚法测定促肝细胞生长素蛋白质含量试剂 碱性铜试液 取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。
临用前，合并两液，并加水至500ml。
操作法(1)对照品溶液的制备 取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含有0.3mg的溶液。
(2)供试品溶液的制备 照各药品项下的方法制备。
(3)标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液(取福林酚试液中的贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。以吸收度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
(4)测定法 精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数。
取3个批号的促肝细胞生长素注射液，每批取5支样品，依上述方法测得其蛋白质含量，促肝细胞生长素注射液的蛋白质含量为15.0～45.0μg/ml。
实施例3促肝细胞生长素的聚丙烯酰胺疑胶电泳和分子量测定将促肝细胞生长素经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(显)示产品中有三个蛋白质组份，经高效液相色谱图面积计算主带占总蛋白时的60％以上。
1.试剂的配制(1)分离胶储备液30g丙烯酰胺(Acr)，0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，加水至100mL，置冰箱4℃保存，备用。
(2)分离胶缓冲液18.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加少量水溶解后用1mol/L，盐酸调pH8.8，然后加水至100mL，置冰箱4℃保存，备用。
(3)浓缩胶储备液Acr 10g，Bis 0.5g，加水至100mL，置冰箱4℃保存，备用。
(4)浓缩胶缓冲液Tris6.0g，加少量水溶解后用1mol/L盐酸调pH6.8，然后加水至100mL，置冰箱4℃保存，备用。
(5)电极缓冲液Tris6.0g，甘氨酸28.8g，10％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)10mL，加水至1000mL，置冰箱4℃保存，备用。用前稀释10倍。
(6)2倍样品缓冲液浓缩胶缓冲液2mL，甘油2mL，10％(w/v)SDS4ml，0.1％(w/v)溴酚蓝0.5mL，巯基乙醇1mL，加水至10mL，置冰箱4℃保存，备用。
(7)固定液10％(w/v)三氯乙酸溶液。
(8)染色液0.25％(w/v)考马斯亮蓝R250水溶液。
(9)脱色液7％乙酸溶液。
所有试剂均为分析纯，水为三重蒸馏水。
2.实验方法样品液的制备取本品10μl，与等量上样缓冲液混合，置沸水浴中水浴，备用，取蛋白分子量标准(北京鼎国试剂公司)水浴方法同供试品。
制胶灌注凝胶液前，先用滴管吸取少量用电极缓冲液I配制浓度为3％的热琼脂溶胶，滴人凝胶腔与电极下槽底部之间所形成的凹型小槽内，待琼脂凝固后开始制备分离胶。
12％分离胶的制备分离胶储备液10mL，分离胶缓冲液7.5mL，10％SDS0.3mL，四甲基乙二胺(TEMED)20μl，10％过硫酸铰(AP)0.2mL，加水至30mL，搅拌均匀后，将所配制的分离胶胶液沿着凝胶腔的长玻璃板的一面缓缓倒人凝胶腔内，直至9cm左右高度为止。然后用滴管沿凝胶腔内壁缓缓加入蒸馏水进行水封，水层高度约为5mm，30～40min后聚合完成。
5％浓缩胶的制备浓缩胶储备液5mL，浓缩胶缓冲液2.5mL，10％SDS 0.1mL，TEMED 10μl，10％AP 0.1mL，加水至10mL，搅拌均匀后，加到吸取表面水层的分离胶上部。小心插入加样梳，整个操作过程应避免气泡的混入，约20min后聚合完成。聚合完成后，在上下两槽倒人电极缓冲液I，小心取出加样梳。
电泳测定上样，接通电源，开始电泳。开始用120V恒电压，待澳酚蓝示踪荆进入分离胶后改用200V恒电压电泳至示踪剂迁移到凝胶腔下沿约1cm处停止电泳。
固定、染色、脱色取出凝胶板置固定液中固定过夜，然后置染色液中染色12h。染色毕，将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，然后加入脱色液脱色，经常更换脱色液，至凝胶胶板的蓝色背景褪清，蛋白质色谱带清晰为止。
标准曲线绘制及样品分子量测定鉴于各胶带染色前后的胶柱有变化，所以必须进行校正。各样品和标准品胶柱固定染色前的胶柱长分别记为d1，溴酚蓝迁移距离为d2，脱色后的胶柱为d3，蛋白质迁移距离为d4，按下式求得各样品和标准蛋白质迁移率Rf，Rf＝dl×c14/d2×d3以标准蛋白质的Rf为横坐标，蛋白质分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作蛋白质分子量与其Rf关系标准曲线，根据未知样品蛋白质的Rf在标准曲线上查出对应的分子量。
实施例4促肝细胞生长素注射剂的制备1、肝脏选取选取经免疫检验合格的出生一个月内的乳牛，其宰杀后应立即取肝脏，并用刀立即将肝脏分割成6-8块、4℃放置1小时进行刺激。
2、分散乳化将分割放置的肝脏用绞肉机打成0.5cm的小块，然后以分散乳化机乳化20分钟，得到细腻均匀、呈乳白色的分散乳化液。
3、破碎细胞将分散乳化液，加入3倍体积PH3.5的0.84％的盐水5。加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达到0.05％，搅拌1小时。
4、加热冷沉对提取液加热，至料液温度80℃恒温15分钟，接着加热至90℃恒温20分钟，水冷却至室温，转入4℃冷库存放48小时，以沉淀油脂、杂蛋白和十二烷基肌氨酸钠。
5、离心澄清取上清液，用无纺布过滤，用离心机离心，得澄清的粗提液。
6、层析将粗提液上层析柱，层析介质为DE-52纤维素。层析后，先后用A洗液(pH8.0含氯化钠0.20M的0.05mol/LTris-HCl溶液)和B洗液(pH8.0含氯化钠0.70M的0.05mol/LTris-HCl溶液)洗脱，收集洗脱液。
7、超滤对洗脱液，以分子量为4万和1万道尔顿的超滤膜超滤，纯化得到2-4万道尔顿区间的蛋白质；同时除盐。
8、含量测定对以上得到的纯化液，调PH至6.5-7.0，以福林酚法测定蛋白质含量，合格后调整至灌装浓度。
9、过滤除菌、除热原，灌装将调整浓度后的促肝细胞生长素溶液，过滤除菌、除热原，灌装，制成水针剂。
权利要求
1.一种促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，经过以下步骤(1)对获得的乳牛或乳猪的新鲜肝脏进行刺激；(2)分散乳化使细胞破碎；(3)加入溶剂并加热；(4)冷冻沉淀；(5)离心得到粗提液；(6)柱层析得洗脱液；(7)洗脱液用超滤膜超滤，纯化得2～4万道尔顿区间的药物活性蛋白质。
2.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤1中所述刺激是乳牛或乳猪宰杀后应立即取肝脏，用刀立即将肝脏分割成6-8块、4℃放置1小时。
3.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤2中所述分散乳化使细胞破碎是，将步骤1刺激后的肝脏用绞肉机打成0.5cm的小块，然后以分散乳化机乳化20分钟，得到细腻均匀、呈乳白色的分散乳化液。
4.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤3中所述加入溶剂并加热是，将步骤2得到的分散乳化液加入3倍体积pH3.5的0.84％的盐水。加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达到0.05％，搅拌1小时，对提取液加热，至料液温度80℃恒温15分钟，接着加热至90℃恒温20分钟。
5.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤4中所述冷冻沉淀是用水冷却至室温，转入4℃冷库存放48小时，以沉淀油脂、杂蛋白和十二烷基肌氨酸钠。
6.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤5中所述离心得到粗提液，是取上清液，用无纺布过滤，用离心机离心，得澄清的粗提液。
7.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤6中所述的柱层析是将粗提液上层析柱，所述层析柱介质是阴离子或阳离子交换树脂，选自阴离子大孔树脂、DE32-纤维素、DE52-纤维素、DEAE-SEPHADEX、DEAE-SEPHAROSE阳离子大孔树脂、CM-纤维素、CM-SEPHADEX、CM-SEPHAROSE。粗提液上层析柱后，先后用A洗液(pH8.0的含氯化钠0.20M的0.05mol/LTris-HCl溶液)和B洗液(pH8.0的含氯化钠0.70M的0.05mol/LTris-HCl溶液)洗脱，收集洗脱液。
8.权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤7中所述洗脱液用超滤膜超滤，是以分子量为4万和1万道尔顿的超滤膜超滤，得到2-4万道尔顿区间的蛋白质。
9.含有用权利要求1的制备方法制备的促肝细胞生长素的药物制剂，其特征在于，是注射剂，该注射剂用以下方法制备调整纯化并除盐的促肝细胞生长素的pH至6.5-7.0，以福林酚法测定蛋白质含量，并调整至灌装浓度，将调整浓度后的促肝细胞生长素溶液，过滤除菌、除热原、需要时加入辅料，灌装，制成水针剂或冻干粉针剂。
全文摘要
本发明公开了一种促肝细胞生长蛋白质的制备工艺及其注射剂制备方法，步骤是出生一个月内的乳牛或乳猪的肝脏用绞肉机绞碎，采用分散乳化机分散20分钟，加入含0.05％的十二烷基肌氨酸钠，破碎细胞，加热、泠沉沉淀杂蛋白，离子交换等纯化方法获得。其中的主要有效成分2.1万道尔顿蛋白质含量大于60％。含量测定、药效学和毒理学实验结果显示，本发明的促肝细胞生长蛋白质及其注射剂取材更方便容易，成本降低，药理药效与前人研究结果相当。
文档编号A61K38/27GK1762383SQ20051010835
公开日2006年4月26日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者郭斌阁 申请人:郭斌阁