专利名称：：一种可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种药物控释体系的制备方法，更确切地说，涉及一种可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法，属于医药工程的药物制剂领域。
背景技术：
：壳聚糖是由β(1→4)键合的D-葡糖胺残基和数目不同、分布无规的N-乙酰葡糖胺组成的线性多糖。作为一种天然阳离子生物高聚物，壳聚糖具有来源广泛、无毒、无味、抗血栓、抗静电、耐碱、成膜性、生物黏附性、生物相容性和生物降解性，而且其降解产物无毒、无免疫原性、无致癌性。这些特性使壳聚糖成为应用前景广阔的生物医药载体。在Chenite等人所写的文章中(A.Chenite，C.Chaput，D.Wang，C.Combes，M.D.Buschmann，C.D.Hoemann，J.CLeroux，B.L.Atkinson，F.Binette，A.Selmani，Novelinjectableneutralsolutionsofchitosanformbiodegradablegelsinsitu，Biomaterials，2000，212155-2161)公开了一种利用甘油磷酸盐制备的具有可注射性的壳聚糖体系。该体系在4℃下保持溶液状态，当加热到37℃时形成水凝胶。不足之处是该体系需要使用大量甘油磷酸钠才可实现在体温下的溶液-凝胶转变，而过高的离子强度不利于所包药物的活性以及剂型的生物相容性。在Li等人所写的文章中(JinjiangLi，ZhengheXu，Physicalcharacterizationofachitosan-basedhydrogeldeliverysystem，JournalofPharmaceuticalSciences，2002，911669-1677)公开了一种加入羟乙基纤维素及少量甘油磷酸盐的方法制备可注射型壳聚糖体系的方法。不足之处是所需的胶凝温度为47℃，远远高于人体正常温度，不利于在人体的应用，且其药物释放速率较快，在10h内所包埋药物基本释放完毕。欧洲专利公开号WO2004/006961，公开日2004年1月22日，发明创造的名称为Compositionforcytocompatible，injectable，self-gellingchitosansolutionsforencapsulatinganddeliveringlivecellsorbiologicallyactivefactors(AbdellatifChenite，CarolineHoemann，MichaelBuschamann，etal.Compositionforcytocompatible，injectable，self-gellingchitosansolutionsforencapsulatinganddeliveringlivecellsorbiologicallyactivefactors，WO2004/006961)，该申请案公开了一种采用乙二醛、羟乙基纤维素作为交联剂制备可注射型壳聚糖体系的方法。该体系可在37℃下发生胶凝，但不足之处是乙二醛存在一定的细胞毒性，即使浓度很低也会降低体系的生物相容性。聚乙二醇[poly(ethyleneglycol)，PEG]是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而得到的一类分子量较低的水溶性聚醚，结构式为H[OCH2CH2]nOH。聚乙二醇是一种两亲性聚合物，既可溶于水，又可溶于大多数的有机溶剂，且具有良好的生物相容性、无毒、免疫原性低等特点，可通过肾排出体外，在体内不会有蓄积。另外聚乙二醇具有一定的化学惰性，但在端羟基活化后又易于和蛋白质等物质进行键合。将其与药物或药物载体混合或连接后可有效地延长被修饰物在体内的半衰期，提高亲水性，保护药物的活性。在Narayan等人所写的文章中(NarayanBhattarai，HassnaR.Ramay，JonathanGunn，etal.PEG-graftedchitosanasaninectablethermosensitivehydrogelforsustainedproteinrelease，JournalofControlledRelease，2005，103609-624)公开了一种将PEG活化后接枝于壳聚糖链上，制备可注射型壳聚糖体系的方法。该体系可以在37℃下发生溶液-凝胶转换，但不足之处是制备步骤繁琐，需要先对PEG或壳聚糖进行活化以进行交联反应；并且制备过程中需用到有机溶剂或有毒试剂，需要通过过滤或透析等除去。此外通过上述的甘油磷酸盐和PEG交联方式所制备的壳聚糖水凝胶都未表现出葡萄糖敏感性或该性质尚未被研究。葡萄糖敏感型给药体系是为了模仿人体正常胰岛素分泌模式，对糖尿病患者实现胰岛素智能脉冲释放的药物释放体系。目前所研究的葡萄糖敏感型给药有三类，分别为葡萄糖氧化酶-pH敏感材料体系、伴刀豆球蛋白A体系、苯基硼酸体系。它们的不足之处是前两种体系需要利用外源蛋白，会引发人体的免疫反应，需要用半透膜或其他材料与人体环境分开；苯基硼酸体系不能生物降解，在体外成形，需通过手术植入体内。
发明内容本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种简便的可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法。该水凝胶由含有少量甘油磷酸盐的聚乙二醇及壳聚糖季铵盐溶液制备，在室温下为溶液形式，可通过注射进入人体，在体温下形成水凝胶，具有良好的生物相容性及可生物降解性。该水凝胶在溶液状态可简单地通过混合方式包埋药物、蛋白质、多肽、细胞、酶、抗体等。由于壳聚糖季铵盐上带有阳离子的季铵基团，因此通过调节pH值可以使季铵基团电离产生链间静电排斥，从而导致凝胶溶胀、溶解。聚乙二醇与壳聚糖季铵盐主要通过聚乙二醇链上的羟基与壳聚糖季铵盐链上的氨基或羟基形成氢键，从而构成凝胶网络。葡萄糖上带一个醛基和一个羟基，同样可以与壳聚糖季铵盐链形成氢键。在葡萄糖存在的条件下，由于部分葡萄糖取代聚乙二醇与葡萄糖反应，从而使部分凝胶网络解离，导致凝胶溶胀、溶解。因此由聚乙二醇交联形成的壳聚糖季铵盐可响应体内pH、葡萄糖浓度变化发生溶解或溶胀，实现药物的控制释放。本发明通过下述技术方案予以实现其制备步骤如下将摩尔比范围为1∶2-1∶8的壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵分散于水或异丙醇中，在60-90℃间反应2-12h后，以丙酮沉淀、洗涤，经烘干得到季铵基团取代度为20％-100％的壳聚糖季铵盐；将制备的壳聚糖季铵盐溶解于pH2.0-6.0的酸性溶液中得到1.0-10.0wt.％的壳聚糖季铵盐溶液；向壳聚糖季铵盐溶液中加入分子量范围为200-25000的聚乙二醇，得到聚乙二醇浓度为1.0-20.0wt.％的壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液；在4-30℃之间将0.5-3.0wt.％的甘油磷酸盐溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液，搅拌得到pH在6.5-8.0之间的均匀清澈混合溶液；将混合溶液倒入容器、模型内，在胶凝温度下恒温一段时间，得到具有所需形状的均匀透明壳聚糖季铵盐水凝胶。壳聚糖分子量为5-200万。壳聚糖脱乙酰度为65％-100％。溶解壳聚糖季铵盐的酸性溶液包括醋酸、盐酸、乳酸、柠檬酸、抗坏血酸、蚁酸。聚乙二醇分子量范围为500-10000。聚乙二醇包括羟基端基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、羧基端基聚乙二醇、醛基端基聚乙二醇及其他功能化聚乙二醇衍生物。在添加甘油磷酸盐后的壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液中还可添加三聚磷酸钠、海藻酸钠、聚乙烯醇等交联剂。在聚乙二醇、甘油磷酸盐添加之前或之后均可向壳聚糖季铵盐溶液中加入需包埋的固体微粒、水溶性添加物、药物、多肽、蛋白质、酶、细胞、抗体等。胶凝温度范围为30-60℃，最佳值为37-38℃。所得壳聚糖季铵盐水凝胶可响应于pH及葡萄糖浓度变化发生溶胀、溶解。由于采用上述技术方案，本发明采用的制备方法与现有技术相比较具有如下有益效果1.不必预先对聚乙二醇或壳聚糖季铵盐活化，制备方法简单方便，可有效保持生物活性药物的活性；2.不必使用有机溶剂或有毒试剂，体系生物相容性好，可生物降解；3.所制备体系可通过环境温度的变化实现溶液-凝胶转变，在室温下以溶液形式注射入体内，在体温下在位胶凝，能适应体内组织或空隙的不同形状，可用于体内药物释放、组织修复。4.所制备体系同时具有pH敏感性及葡萄糖敏感性，可作为pH敏感或葡萄糖敏感释药体系，实现药物可控释放。图1实施例1中壳聚糖及所制壳聚糖季铵盐的红外光谱。图中a线为壳聚糖的红外光谱，b线为季铵化后的壳聚糖季铵盐的红外光谱。图2实施例7制备的载药壳聚糖季铵盐水凝胶在不同pH的磷酸缓冲溶液中的药物释放曲线图3实施例8制备的载药壳聚糖季铵盐水凝胶在不同pH的磷酸缓冲溶液中的药物释放曲线图4实施例7制备的载药壳聚糖季铵盐水凝胶在不同葡萄糖浓度的磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的药物释放曲线图5实施例8制备的载药壳聚糖季铵盐水凝胶在不同葡萄糖浓度的磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的药物释放曲线具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。壳聚糖季铵盐水凝胶制备的具体方法和步骤说明如下(1)壳聚糖季铵盐的制备将摩尔比范围为1∶2-1∶8的壳聚糖及2，3-环氧丙基三甲基氯化铵分散于水或异丙醇中，加热到60-90℃的反应温度，反应2-12h。将反应液倒入丙酮中沉淀、洗涤，烘干得到壳聚糖季铵盐。壳聚糖的分子量范围为5-200万，脱乙酰度为65％-100％。(2)聚乙二醇交联壳聚糖季铵盐水凝胶的制备将上述步骤(1)所得的壳聚糖季铵盐溶解于pH2.0-6.0的酸性溶液中得到1.0-10.0wt.％的壳聚糖季铵盐溶液，酸性溶液包括醋酸、盐酸、乳酸、柠檬酸、抗坏血酸、蚁酸。向壳聚糖季铵盐溶液中加入分子量范围为200-25000的聚乙二醇，得到聚乙二醇浓度为1.0-20.0wt.％的壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液，聚乙二醇的最佳分子量范围为500-10000，聚乙二醇包括羟基端基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、羧基端基聚乙二醇、醛基端基聚乙二醇及其他功能化聚乙二醇衍生物。在4-30℃之间将0.5-3.0wt.％的甘油磷酸盐溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液，搅拌得到pH在6.5-8.0之间的均匀清澈混合溶液，混合溶液中还可添加三聚磷酸钠、海藻酸钠、聚乙烯醇等交联剂。将混合溶液倒入容器、模型内，在胶凝温度下恒温一段时间，可得到具有所需形状的均匀透明壳聚糖季铵盐水凝胶。(3)载药壳聚糖季铵盐水凝胶的制备将上述步骤(1)所得的壳聚糖季铵盐溶解于酸性溶液中得到壳聚糖季铵盐溶液。向壳聚糖季铵盐溶液中加入聚乙二醇，得到壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液。在4-30℃之间将甘油磷酸盐溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液，搅拌得到均匀清澈混合溶液，混合溶液中还可添加三聚磷酸钠、海藻酸钠、聚乙烯醇等交联剂。所需包埋的药物、蛋白质、多肽、细胞、酶或抗体可在聚乙二醇、甘油磷酸盐添加之前或之后加入。将所得载药混合溶液倒入容器、模型内，在胶凝温度下恒温一段时间，得到载药壳聚糖季铵盐水凝胶。上述方法将通过下面的实例进一步描述，但是提供的实例不能作为对此方法的限制。实施例1将3.0g壳聚糖分散于20mL水中，在80℃下搅拌1h。将16.94g2，3-环氧丙基三甲基氯化铵溶解于40mL水中，加入壳聚糖分散液中。在80℃下搅拌反应10h后，将反应液倒入丙酮中沉淀，在冰箱中搅拌洗涤过夜后烘干，得到白色疏松产物。通过红外光谱表征，见附图1，季铵化后1597cm-1处的氨基伸缩振动峰消失，在1481cm-1出现-CH3的C-H弯曲振动强吸收峰，证明壳聚糖链上发生季铵基团取代，生成壳聚糖季铵盐。实施例2将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72gPEG8000溶解于8mL0.1mol/L的乳酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.125g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.4。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。实施例3将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72gPEG500溶解于8mL0.1mol/L的乳酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.125g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.4。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。实施例4将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72g单甲氧基PEG2000溶解于8mL0.1mol/L的乳酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.125g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.4。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。实施例5将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72gPEG8000溶解于8mL0.1mol/L的醋酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.125g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.4。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。实施例6将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72gPEG8000溶解于8mL0.1mol/L的乳酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.25g/mL的β-甘油磷酸钠溶液1mL及10mg/mL的三聚磷酸钠溶液1mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液pH值为7.4。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。该体系在4℃下可稳定保存。实施例7将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72gPEG8000溶解于8mL0.1mol/L的乳酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.125g/mL的β-甘油磷酸钠溶液2mL，充分搅拌使其混合均匀。向混合溶液中加入10mg盐酸阿霉素(模型药物)，并混合均匀。将含有盐酸阿霉素的混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。实施例8将实施例1中所制壳聚糖季铵盐0.50g及0.72gPEG8000溶解于8mL0.1mol/L的乳酸溶液中，搅拌下逐滴加入0.25g/mL的β-甘油磷酸钠溶液1mL及10mg/mL的三聚磷酸钠溶液1mL，充分搅拌使其混合均匀。向混合溶液中加入10mg盐酸阿霉素(模型药物)，并混合均匀。将含有盐酸阿霉素的混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。将该混合溶液加热到37℃并保温60min使该体系胶凝充分。实施例9将实施例7或8中所制载药混合溶液各取1.0g置于10mL玻璃试管中，在37℃下保温60min使溶液胶凝充分。再向各试管中分别加入4mL不同pH值的磷酸缓冲溶液，在37℃下振荡。定期取出1mL上清液，在484nm处测吸光度值，并补充1mL同pH值的缓冲溶液。以不同pH值的磷酸缓冲溶液配制不同浓度的标准盐酸阿霉素溶液，在484nm处测吸光度值，并绘出标准曲线。根据标准曲线确定盐酸阿霉素释放值，并绘出累计释放量-时间曲线。实施例7或8制备的载药壳聚糖季铵盐水凝胶在不同pH缓冲溶液中的药物释放曲线分别见附图2、3。实施例10将实施例7或8中所制载药混合溶液各取1.0g置于10mL玻璃试管中，在37℃下保温60min使溶液胶凝充分。再向各试管中分别加入4mL不同葡萄糖浓度的磷酸缓冲溶液(pH7.4)，在37℃下振荡。定期取出1mL上清液，在484nm处测吸光度值，并补充1mL同葡萄糖浓度的缓冲溶液。以不同葡萄糖浓度的磷酸缓冲溶液(pH7.4)配制不同浓度的标准盐酸阿霉素溶液，在484nm处测吸光度值，并绘出标准曲线。根据标准曲线确定盐酸阿霉素释放值，并绘出累计释放量-时间曲线。实施例7或8制备的载药壳聚糖季铵盐水凝胶在不同葡萄糖浓度的磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的药物释放曲线分别见附图4、5。权利要求1.一种可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法，其特征是，包括下列步骤(1)将摩尔比范围为1∶2-1∶8的壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵分散于水或异丙醇中，在60-90℃间反应2-12h后，以丙酮沉淀、洗涤，经烘干得到季铵基团取代度为20％-100％的壳聚糖季铵盐；(2)将制备的壳聚糖季铵盐溶解于pH2.0-6.0的酸性溶液中得到1.0-10.0wt.％的壳聚糖季铵盐溶液；(3)向壳聚糖季铵盐溶液中加入分子量范围为200-25000的聚乙二醇，得到聚乙二醇浓度为1.0-20.0wt.％的壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液；(4)在4-30℃之间将0.5-3.0wt.％的甘油磷酸盐溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐-聚乙二醇混合溶液，搅拌得到pH在6.5-8.0之间的均匀清澈混合溶液；(5)将混合溶液倒入容器、模型内，在胶凝温度下恒温一段时间，得到具有所需形状的均匀透明壳聚糖季铵盐水凝胶。2.如权利要求1所述制备方法，步骤(1)中所述壳聚糖分子量为5-200万。3.如权利要求1所述制备方法，步骤(1)中所述壳聚糖脱乙酰度为65％-100％。4.如权利要求1所述制备方法，步骤(2)中所述酸性溶液包括醋酸、盐酸、乳酸、柠檬酸、抗坏血酸、蚁酸。5.如权利要求1所述制备方法，步骤(3)中所述聚乙二醇分子量范围为500-10000。6.如权利要求1所述制备方法，步骤(3)中所述聚乙二醇包括羟基端基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇、羧基端基聚乙二醇、醛基端基聚乙二醇及其他功能化聚乙二醇衍生物。7.如权利要求1所述制备方法，步骤(4)中所述混合溶液中还可添加三聚磷酸钠、海藻酸钠、聚乙烯醇等交联剂。8.如权利要求1所述制备方法，在步骤(2)至(5)中的任一项所述的溶液中可加入固体微粒、水溶性添加物、药物、多肽、蛋白质、酶、细胞、抗体等。9.如权利要求1所述制备方法，在步骤(5)中的胶凝温度范围为30-60℃，最佳值为37-38℃。10.如权利要求1所述制备方法，在步骤(5)中所得壳聚糖季铵盐水凝胶可响应于pH及葡萄糖浓度变化发生溶胀、溶解。全文摘要本发明公开了一种可注射型pH及葡萄糖敏感水凝胶的制备方法。利用该方法可以简化水凝胶的制备步骤，避免使用有机溶剂，克服了仅使用甘油磷酸钠作交联剂时渗透压大的缺点。本发明通过下述技术方案予以实现制备壳聚糖季铵盐；将壳聚糖季铵盐与聚乙二醇溶解于酸溶液中，在室温下加入甘油磷酸盐溶液并混合均匀；将所得混合溶液在胶凝温度下恒温一段时间，得到壳聚糖季铵盐水凝胶。该体系可以通过注射方式进入人体，并能响应于体内pH值或葡萄糖浓度变化而改变溶胀状态从而实现所包埋药物的控制释放。文档编号A61K47/36GK1954817SQ200510114678公开日2007年5月2日申请日期2005年10月28日优先权日2005年10月28日发明者马光辉,苏志国,吴颉申请人:中国科学院过程工程研究所