专利名称：抗hiv病毒的多肽及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗HIV病毒的多肽及其编码基因与应用。
背景技术：
HIV病毒所引起的艾滋病是当今世界上对人类健康威胁最大的流行性传染病。在过去的十几年中，各国投入了巨大的努力和巨额资金致力于研制开发抗艾滋病的药物，目前世界上批准用于临床的抗艾滋病药物已有近二十种。但是，已有的任何一种药物都不能完全清除人体内的HIV病毒。几种药物组合使用的效果会优于单一药物治疗，但也不能完全清除HIV病毒。HIV在复制过程中有很高的突变率，病人体内的病毒呈异源性，其中一些病毒具有抗药性，当治疗进行到一定阶段时，这些抗药病毒的数量会逐渐占据优势，使得现有的治疗无效。而且这些抗病毒药物的长期毒性已在临床上显示出来。不断地研制开发新的抗艾滋病药物，尤其是不同于现有药物作用机制的新一代抗艾滋病药物，是非常重要而且十分必要的。
HIV是一种逆转录病毒，在感染过程中首先通过病毒表面包膜蛋白(envelope)与其受体的相互作用吸附到细胞表面，然后病毒质膜与细胞质膜融合，裸露的病毒颗粒进入到细胞中。在细胞质中病毒的RNA被逆转录成双链DNA，这段DNA存在于由病毒蛋白及宿主蛋白组成的整合前复合体(Pre-Integration Complex，简称PIC)中。PIC由细胞质膜附近迁移到核膜附近并进入细胞核。在细胞核中病毒DNA由病毒的整合酶整合到宿主细胞的染色体中。上述过程被称为逆转录病毒生命周期的前期。整合的病毒DNA被转录成RNA，其中大部分作为模板翻译病毒蛋白，小部分全长RNA作为病毒遗传物质被病毒蛋白包装成病毒颗粒出芽到细胞外成为未成熟病毒。在未成熟病毒中一些病毒蛋白以融合蛋白形式存在，经过病毒蛋白酶剪切后病毒颗粒结构重组成为有感染性的成熟病毒，此过程称为逆转录病毒生命周期的后期。
HIV病毒基因只有9kb，编码15种病毒蛋白。HIV病毒以如此少的自身携带的功能完成一个非常复杂的复制过程必须利用宿主细胞的许多功能。另一方面，宿主在与病毒长期共存的过程中也进化产生了各种防御病毒的机制，其中一种机制是通过表达宿主细胞限制性因子抑制病毒的复制。近年来发现的TRIM5、APOBEC3G等都是能够有效抑制HIV复制的宿主细胞限制性因子。
CFIm(Cleavage Factor Im)是真核生物mRNA前体3’加工复合体的一个组分。几乎所有的真核生物mRNA前体3’加工都包含两个密切相连的步骤，首先由加工复合体识别初级转录物的多聚腺苷酸添加位点，并在此位点切割，然后上游切割片断进行聚腺苷酸化，下游片断则迅速降解。现在已知至少六种不同的蛋白参与真核生物mRNA前体3’加工复合体的组成，即CPSF，CstF，PAP，PABPNI，CFIm和CFIIm。鼠源CFIm68(rCFIm68)，由552个氨基酸残基组成，具有序列表中序列1的氨基酸序列，其编码基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。rCFIm68的序列已于NCBI的GenBank中发表，但未见相关研究论文报道。人源CFIm68(hCFIm68)，由551个氨基酸残基组成，具有序列表中序列3的氨基酸序列，其编码基因具有序列表中序列4的核苷酸序列。hCFIm68与一个25kd小亚基形成异二聚体，该二聚体在3’加工复合体形成的早期就与mRNA前体结合，在polyA添加位点识别过程中起重要作用，能促进3’加工复合体的装配、PolyA位点的切割和PolyA的添加。rCFIm68和hCFIm68核苷酸序列同源性93.2％，氨基酸序列同源性99.5％，仅有两个氨基酸不同，分别是自氨基端的第192和468位氨基酸残基，另外hCFIm(序列3)与rCFIm(序列1)相比在492位处缺少一个精氨酸。序列1是序列2编码的蛋白质，序列3是序列4编码的蛋白质。
发明内容
本发明的目的是提供抗HIV病毒多肽及其编码基因。
本发明所提供的抗HIV病毒多肽，选自下列多肽之一所述多肽是将由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的多肽自氨基端的第453位氨基酸残基开始，向氨基端连续缺失0或自然数1至100中任意数值个氨基酸残基得到的101个多肽；或是将所述101个多肽的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
序列表中的序列5由453个氨基酸残基组成，是序列表中序列1的自氨基端第1至453位氨基酸残基。
所述抗HIV病毒多肽，优选为由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的多肽，或是将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽。
将由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的抗HIV病毒多肽命名为rCFIm453。
所述将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽，是缺失自序列表中序列5的氨基端第452和第453位氨基酸残基且将自序列表中序列5的氨基端第192位的甘氨酸残基取代为丝氨酸残基得到的多肽，即由自序列表中序列3的氨基端第1至451位复基酸残基组成的多肽。
将由自序列表中序列3的氨基端第1至451位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽命名为hCFIm451。
所述抗HIV病毒多肽尤其优选为由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的多肽，或是将由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽。
将由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽命名为rCFIm353。
所述将由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽，是将由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的多肽中的自序列5的氨基端第353和352位氨基酸残基缺失，且将自序列表中序列5的氨基端第192位的甘氨酸残基取代为丝氨酸残基得到的多肽，即由自序列表中序列3的氨基端第1至351位氨基酸残基组成的多肽。
将由自序列表中序列3的氨基端第1至351位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽命名为hCFIm351。
上述抗HIV病毒多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的抗HIV病毒多肽的编码基因，是由序列表中序列2的自5′端第1位-第1359位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列；所述由自序列表中序列3的氨基端第1至451位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽的编码基因，是由序列表中序列4的自5′端第1位-第1353位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列；所述由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽的编码基因，是由序列表中序列2的自5′端第1位-第1059位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列；由自序列表中序列3的氨基端第1至351位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽，是由序列表中序列4的自5′端第1位-第1053位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。
上述抗HIV病毒多肽的编码基因的工程菌、细胞系或载体均属于本发明的保护范围。
细胞实验结果表明，本发明的抗HIV病毒多肽rCFIm353，hCFIm351，rCFIm453hCFIm451均可抑制假病毒HIV-luc感染宿主细胞，在293A细胞中，rCFIm353的抑制倍数达38倍，该HIV病毒多肽及其编码基因可用于制备抗HIV病毒药物，为HIV的治疗开拓新的途径。
图1为构建在pcDNA4/to/myc-HisB上的CFIm68截短体在293A细胞中的表达。
图2为构建在pBabe-puro-myc上的CFIm68截短体在293A细胞中的表达。
图3为在Rat2细胞中CFIm68及截短体对病毒感染的抑制。
图4为在293A细胞中rCFIm353和hCFIm351对病毒感染的抑制。
图5为表达rCFIm353的Rat2和293A细胞对HIV-luc和MLV-luc转染的抑制作用。
图6为病毒逆转录中间产物线性DNA和环状DNA的形成。
图7为rCFIm353和全长rCFIm68的细胞定位。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、具有抗HIV功能的宿主细胞基因发现按照Guangxia Gao等人于2002年9月发表在Science杂志中第1703-1706页的体细胞遗传学筛选方法获得宿主细胞基因。主要步骤如下建立一个大鼠野生型Rat2(购自ATCC)细胞cDNA文库(该文库为Guangxia Gao等人于2002年9月发表在Science杂志中第1703-1706页的文章中所用文库)，将这个cDNA库引入宿主细胞Rat2中。设计引物(上游aggatccatggc ttcgtacccc tgcca下游taggtacctcagttagcctcccccatct)从质粒pHSV106(购自Gibco/BRL公司)上扩增得到编码胸苷激酶(thymidine kinase，简称TK)基因的DNA片段，扩增的体系为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，模板10ng，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升。扩增的程序为94℃预变性4分钟，然后扩增25个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃2.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。扩增产物经BamHI和KpnI酶切后，连入基于HIV的逆转录载体pTrip-GFP(pTrip-GFP的构建方法见Zennou V等于2000年4月发表在cell上第173-185页的文章)的BamHI，KpnI位点，用TK基因取代编码绿色荧光蛋白的GFP基因，得到逆转录载体HIV-TK。将1微克表达VSVG的质粒pMD.G(构建方法参见Ori，DS.等发表在Proc.Nat.l Acad.Sci.USA，1996，93(21)第11400-11406页的文章)，1微克表达HIV-gag-pol等蛋白的质粒pCMVΔR8.2(构建方法参见Naldini，L等发表在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(21)，第11382-11388页的文章)，1.5微克逆转录载体HIV-TK共转染到293T细胞(购自ATCC)，采用FuGENE6转染试剂(Roche公司)在60mm培养皿中进行。48小时后，收获含病毒上清液，经0.45um孔径的膜过滤后，得到HIV-TK病毒液。然后用HIV-TK假病毒侵染这些表达大鼠基因片段的宿主细胞，并利用三氟胸苷(TFT)筛选出对病毒侵染有抗性的宿主细胞。将这些宿主细胞中的cDNA用PCR方法分离出来并转入野生型的宿主细胞中，确证其中一个cDNA的表达能使宿主细胞对病毒侵染产生抗性。将所克隆的基因进行序列测定，经GeneBank序列比对，结果表明该基因编码一个mRNA前体剪切因子CFIm68的N端第1位-353位氨基酸片段(自序列1的氨基端第1至353位氨基酸残基)。
实施例2、CFIm68基因不同截短体对HIV的抗性一、CFIm68全长基因的克隆根据序列表中序列2的大鼠CFIm68序列，设计引物(上游cgg ggt acc atg gcggac ggt gtg gac，下游cgc gga tcc acg atg acg gta ttc tcg ctc)。采用RNeasyMini kit RNA提取试剂盒(购自QIAGEN，货号74104)，并按照其说明书标准方法提取大鼠Rat2细胞总RNA。采用SuperScriptTMII逆转录酶(购自invitogen，货号18064-022)合成第一链cDNA，RT反应体系Oligo(dT)18(500微克/微升)1微升，totalRNA 1微克，dNTP(各10mM)1微升，补加灭菌去离子水至总体积12微升。65℃温浴5分钟，立即冰浴。在体系中加入5×First-Strand buffer 4微升，0.1M DTT 2微升。42℃温浴2分钟。添加1微升逆转录酶，42℃反应50分钟，70℃热失活15分钟。以上述所得cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，第一链cDNA 2微升，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升；扩增程序94℃预变性4分钟，然后扩增25个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃2.0分钟)，最后72℃延伸10分钟；将得到的扩增产物进行测序，测序结果表明扩增得到具有序列表中序列2的核苷酸序列的鼠CFIm68基因(rCFIm68基因)。根据序列表中序列4的人源CFIm68序列，设计引物(上游cgg ggt acc atg gcg gac ggc gtg gac，下游Cgc gga tcc acg atg acg ata ttcgcg ctc)，以人胎肝cDNA库(购自Invitrogen货号D8880-01)为模板，进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，cDNA库100ng，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升；扩增程序94℃预变性4分钟，然后扩增25个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃2.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。将得到的扩增产物进行测序，测序结果表明扩增得到具有序列表中序列4的核苷酸序列的人CFIm68基因(hCFIm68基因)。hCFIm68基因编码具有551个氨基酸残基的序列表中序列3的蛋白质。rCFIm编码具有552个氨基酸残基的序列表中序列1的蛋白质。两者核苷酸序列同源性93.2％，氨基酸序列同源性99.5％，仅有两个氨基酸不同，分别是自氨基端的第192和468位氨基酸残基，另外hCFIm(序列3)与rCFIm(序列1)相比在492位处缺少一个精氨酸。
二、CFIm68基因不同截短体对HIV的抗性1、以pcDNA4/to/myc-HisB(购自Invitrogen公司)为载体的截短体构建对应rCFIm68基因内部即序列表中序列1的氨基端第46，146，309，409位氨基酸处分别设计引物作为上游引物(引物中带有下划线的序列表示KpnI酶切识别序列，方框中的序列为BamHI酶切识别序列)(46aacggggt accatg gcc cca gaa gac cgggac；或146aacggggt accatg aaa aga gaa ctt cac ggt cag；或309aacggggtaccatg cca ccg cct cea cag cag；或409aacggggt accatg ctg agt gaa gct gagttt gaa；)，根据序列表中序列1的C端设计引物Pccgc acg atg acg gtattc tcg ctc作为下游引物，分别以步骤一得到的rCFIm68基因做为模板，进行PCR扩增，分别获得自序列表中序列1的氨基端第46-552位、第146-552位、第309-552位、第409-552位氨基酸残基组成的N端缺失的氨基酸片段的编码基因，分别命名为rCFImΔ45基因、rCFImΔ145基因、rCFImΔ308基因、rCFImΔ408基因。其中，扩增的体系分别均为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，模板10ng，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升。扩增的程序均为94℃预变性4分钟，然后扩增25个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃2.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。
同样对应自序列表中序列1的氨基端第90，190，253，353，453位氨基酸处设计引物作为下游引物(90aacgc cca tgt tag att tcc aat ata；190aacgc tcc tgg agg acc agc ttt acc；253aacgc tgg agg acc tgg ggggcc agg；353aacgc tgg tgg tgg ggc acc tgg agg；453aacgc aga aat tgc tgt tac caa tgt)；对应序列表中序列1氨基端第1位氨基酸处设计引物Pncggggt accatg gcg gac ggt gtg gac作为上游引物，分别以步骤一得到的rCFIm68基因做为模板，进行PCR扩增，分别获得自序列表中序列1的氨基端第1-90位、第1-190位、第1-253位、第1-353位、第1-453位氨基酸残基组成的C端缺失的氨基酸片段的编码基因，分别命名为rCFIm90基因、rCFIm190基因、rCFIm253基因、rCFIm353基因、rCFIm453基因。其中，扩增的体系均为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，模板10ng，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升。扩增的程序均为94℃预变性4分钟，然后扩增25个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃2.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。用上述Pc和Pn为引物，分别以步骤一得到的rCFIm68基因做为模板，进行PCR扩增，得到序列表中序列1的rCFIm68编码基因rCFIm552。
对应自序列表中序列3的氨基端第351位、451位和551位氨基酸处设计了三条下游引物h351cgcgga tcctgg ggc acc tgg agg tgg tcc agg；h451cgcgga tcctgc agt tac cag tgt ctc aat agc；h551Cgcgga tccacg atg acg ata ttc gcgctc(带有下划线的序列为BamHI的酶切识别序列)，对应自序列表中序列3的氨基端第1位氨基酸处设计了一条上游引物cgg atg gcg gac ggc gtg gac(方框中的序列为KpnI的酶切识别序列)，分别以步骤一得到的hCFIm68基因做为模板，进行PCR扩增反应，得到自序列表中序列3的第1-第351位和第1-第451位氨基酸残基组成的hCFIm351基因、hCFIm451基因和序列表中序列3的hCFIm68编码基因hCFIm551。反应体系为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，模板10ng，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升；反应程序为94℃预变性4分钟，然后扩增25个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃2.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。其中，上述引物中5’端引物引入KpnI位点，3’端引物引入BamHI位点，上述PCR产物经KpnI和BamHI双酶切后分别连入载体pcDNA4/to/mvc-HisB的KpnI-BamHI位点。将含有rCFImΔ45基因的载体命名为prCFImΔ45，将含有rCFImΔ145基因的载体命名为prCFImΔ145、将含有rCFImΔ308基因的载体命名为prCFImΔ308、将含有rCFImΔ408基因的载体命名为prCFImΔ408、将含有rCFIm90基因的载体命名为prCFIm90、将含有rCFIm190基因的载体命名为prCFIm190、将含有rCFIm253基因的载体命名为prCFIm253、将含有rCFIm353基因的载体命名为prCFIm353、将含有rCFIm453基因的载体命名为prCFIm453、将含有hCFIm351基因的载体命名为phCFIm351、将含有hCFIm451基因的载体命名为phCFIm451、将含有rCFIm552的载体命名为prCFIm552、将含有hCFIm551的载体命名为phCFIm551。在每个截短体、全长蛋白末端融合有myc标签，将这些质粒转染入293A细胞(购自Invitrogen公司)，48小时后收获细胞，用anti-myc抗体(购自SantaCruz Biotechnology公司)进行免疫杂交，表明分别得到大小为60kDa的rCFImΔ45、大小为49kDa的rCFImΔ145、大小为33kDa的rCFImΔ308、大小为23kDa的rCFImΔ408、大小为15kDa的rCFIm90、大小为26kDa的rCFIm190、大小为32kDa的rCFIm253、大小为42kDa的rCFIm353、大小为52kDa的rCFIm453、大小为65kDa的rCFIm552、大小为42kDa的hCFIm351、大小为52kDa的hCFIm451、大小为65kDa的hCFIm551的杂交条带，说明各片段正常表达。结果如图1所示。
2、转录载体pBabe-puro的改造设计引物，上游引物gaagatctgtttaaacttaagcttggtac(带有下划线的序列为BglII酶切识别序列)，下游引物g tca cagatcctcttctgagatgag(方框中的序列为EcoRI酶切识别序列)，以pcDNA4/to/myc-HisB质粒为摸板，获得147bp包含myc标签和多克隆位点的序列，经BglII/EcoRI部分酶切后，连入pBabe-puro(购自clontech)的BamHI/EcoRI位点，获得pBabe-puro-myc。
3、pBabe-puro-myc为载体的截短体的构建将prCFImΔ45、prCFImΔ145、prCFImΔ308、prCFImΔ408、prCFIm90、prCFIm190、prCFIm253、prCFIm353、prCFIm453、prCFIm552、phCFIm351、phCFIm451、phCFIm551分别用PmeI/BamHI双酶切，切下rCFIm68和hCFIm68基因截短体，将pBabe-puro-myc用PmeI/BamHI双酶切，回收大片段作为载体，然后把rCFIm68和hCFIm68基因截短体分别与此载体片段连接，将连接产物分别转化大肠杆菌TOP10，提取质粒并测序验证，将含有步骤1中rCFImΔ45、rCFImΔ145、rCFImΔ308、rCFImΔ408、rCFIm90、rCFIm190、rCFIm253、rCFIm353、rCFIm453、hCFIm351、hCFIm451基因、hCFIm551、rCFIm552的质粒分别称为pBrCFImΔ45、pBrCFImΔ145、pBrCFImΔ308、pBrCFImΔ408、pBrCFIm90、pBrCFIm190、pBrCFIm253、pBrCFIm353、pBrCFIm453、pBhCFIm351、pBhCFIm451、pBhCFIm551、pBrCFIm552。将这些质粒分别转染入293A细胞，用anti-myc抗体进行Western免疫杂交，结果表明分别得到大小为59kDa的rCFImΔ45、大小为48kDa的rCFImΔ145、大小为32kDa的rCFImΔ308、大小为22kDa的rCFImΔ408、大小为14kDa的rCFIm90、大小为25kDa的rCFIm190、大小为31kDa的rCFIm253、大小为41kDa的rCFIm353、大小为51kDa的rCFIm453、大小为64kDa的rCFIm552、大小为41kDa的hCFIm351、大小为51kDa的hCFIm451、大小为64kDa的hCFIm551的杂交条带，说明各片段正常表达。结果如图2所示。
4、抗性片段的确定将1微克表达VSVG的质粒pMD.G，1微克表达MLV-gag-pol的质粒pHIT60(构建方法参见Soneoka Y.等发表在Nucleic Acids Res.1995Feb；23(4)第628-633页的文章)，1.5微克MLV假病毒载体pFB-luc(购自Stratagene)共转染到293T细胞，采用FUGENE6转染试剂(Roche公司)在60mm培养皿中进行。48小时后，收获含病毒上清液，经0.45um孔径的膜过滤后，得到MLV-luc病毒液。
将1微克表达VSVG的质粒pMD.G，1微克表达HIV-gag-pol等蛋白的质粒pCMVΔR8.2，1.5微克HIV假病毒载体pHR’-CMV-luc(pHR’-CMV-luc的构建方法见Li SL等，Microbiol Immunol.2000年44(12)，第1019-1025页)共转染到293T细胞，采用FuGENE6转染试剂(Roche公司)在60mm培养皿中进行。48小时后，收获含病毒上清液，经0.45um孔径的膜过滤后，得到HIV-luc病毒液。
按照包装MLV-luc的方法，将质粒pMD.G和pHIT60与下述14种质粒中的一种pBabe-puro-myc、pBrCFImΔ45、pBrCFImΔ145、pBrCFImΔ308、pBrCFImΔ408、pBrCFIm90、pBrCFIm190、pBrCFIm253、pBrCFIm353、pBrCFIm453、pBrCFIm552、pBhCFIm351、pBhCFIm451、pBhCFIm551共转染293T细胞，获得相应的的假膜病毒。
下述14种假膜病毒假病毒pBabe-puro-myc、假病毒pBrCFImΔ45、假病毒pBrCFImΔ145、假病毒pBrCFImΔ308、假病毒pBrCFImΔ408、假病毒pBrCFIm90、假病毒pBrCFIm190、假病毒pBrCFIm253、假病毒pBrCFIm353、假病毒pBrCFIm453、假病毒pBrCFIm552、假病毒pBhCFIm351、假病毒pBhCFIm451、假病毒pBhCFIm551分别感染Rat2细胞，筛选得到嘌呤霉素(4μg/ml)的抗性细胞群。
将假病毒MLV-luc或HIV-luc分别感染上述得到的14种嘌呤霉素抗性的Rat2细胞群，两天后用Promega公司的luciferase试剂盒测定嘌呤霉素抗性细胞群荧光素酶活性，获得14种嘌呤霉素抗性细胞群萤光素酶的荧光值。以整合有空质粒pBabe-puro-myc的嘌呤霉素抗性细胞群的荧光值作为对照，用它去除其他嘌呤酶素抗性细胞群萤光素酶的荧光值，所得比值即为抑制倍数，即抑制倍数＝含空质粒嘌呤霉素抗性细胞群组值/其它嘌呤霉素抗性细胞群组值。
结果表明，在Rat2细胞中，pBrCFIm353组，pBrCFIm453组，pBhCFIm351组、phCFIm451组均对HIV-luc具有抑制作用，抑制倍数分别为19倍、6倍、15倍、8倍，而对MLV-luc则没有明显的抑制作用，其他片段及全长基因对HIV-luc和MLV-luc感染无抗性。部分片段的抑制结果如图3所示，其中R90、R253、R353、R453、R552、RΔ145、RΔ308、RΔ408、h351、h451、h551分别表示pBrCFIm90、pBrCFIm253、pBrCFIm353、pBrCFIm453、pBrCFIm552、pBrCFImΔ145、pBrCFImΔ308、pBrCFImΔ408、pBhCFIm351、phCFIm451、pBhCFIm551组。
5、抗性片段在293A细胞中对HIV-luc和MLV-luc假病毒的抗性按照步骤4的方法，分别取假病毒pBrCFIm353、假病毒pBhCFIm351、假病毒pBabe-puro-myc三种假病毒中的一种，感染293A细胞，筛选得到嘌呤霉素(4μg/ml)抗性细胞群。分别用假病毒MLV-luc或HIV-luc感染这三个嘌呤霉素(4μg/ml)抗性细胞群，两天后测定嘌呤霉素抗性细胞群荧光素酶活性。抑制倍数的确定方法同步骤4。结果如图4所示，表明在293A细胞中，rCFIm353和hCFIm351均对HIV-luc具有抑制作用，抑制倍数分别为在38倍和9倍，而对MLV-luc则没有明显的抑制作用。
实施例3、rCFIm353对HIV-luc抑制位点的确定rCFIm353对HIV-luc的抑制作用可能发生在感染的早期阶段，即整合入染色体形成原病毒之前，或发生晚期阶段，即原病毒的表达。为区分这两种可能性，用脂质体转染的方法分别将载体HIV-luc和载体MLV-luc转入表达rCFIm353的Rat2和293A细胞，同时将载体HIV-luc和MLV-luc转染入整合有空载体pBabe-puro-myc的Rat2和293A细胞。48小时后荧光素酶活性，确定抑制倍数，结果如图5所示，含rCFIm353的细胞对HIV-luc和MLV-luc都没有抑制作用。表明rCFIm353对HIV-luc的抑制应该发生在感染的早期阶段。
为确定阻断HIV感染的确切位置，检测了HIV-luc感染后的病毒DNA合成情况。将转入pBrCFIm353得到的表达rCFIm353的Rat2细胞(实验组)与整合有空载体pBabe-puro-myc的Rat2(对照组细胞)在用不同浓度HIV-luc假病毒感染24小时后，提取Hirt DNA，该方法可提取细胞中的低分子量DNA，其中包括逆转录病毒逆转录后生成的DNA(具体方法见Hirt B，J.Mol.Boil.1967，26365-369)。以Hirt DNA为模板，PCR检测Luc DNA的合成，(上游引物gag gat gga acc gct gga gag caa c；下游引物atc cag agg aat tca tta tca gtg c)PCR的反应体系为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，HirtDNA 10微升，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升；反应程序为94℃预变性4分钟，然后扩增30个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃1.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。凝胶电泳表明实验组与对照组中HIV-Luc病毒逆转录产生Luc DNA的PCR产物的量无明显差异。结果如图6所示，表明阻断位点在逆转录完成以后的阶段。
病毒完成逆转录后，线性的病毒DNA进入核中，部分形成有两个长末端重复序列(2-LTR)连接的环状DNA形式。这些环状DNA不是形成正常整合原病毒过程的中间体，但可作为DNA进入核中的标志。同样以上述试验中的Hirt DNA为模板，PCR检测环状DNA量，(上游引物为gta act aga gat acc ctc aac下游引物为cag atctgg tct aac cag aga)。PCR的反应体系为dNTP混合物(各2.5mM)4微升，10×PCR缓冲液5微升，上游引物(20μM)1微升，下游引物(20μM)1微升，Hirt DNA 10微升，Pyrobest DNA聚合酶(购自TaKaRa公司)1.25U，补加灭菌去离子水至总体积50微升；反应程序为94℃预变性4分钟，然后扩增35个循环(每次94℃30秒，55℃30秒，72℃1.0分钟)，最后72℃延伸10分钟。凝胶电泳结果如图6所示，表明与对照相比，含有rCFIm353的细胞的病毒环状DNA的PCR产物显著减少。说明rCFIm353对HIV-luc的抑制位点在DNA入核之前。图6中，2-LTR指细胞内病毒环状DNA的扩增产物。
由上可确定，阻断HIV-luc的位点应在逆转录完成后，入核之前。即整合前复合体(PIC)的形成，及PIC向核膜的迁移和入核过程。
实施例4、rCFIm353和全长rCFIm68的细胞定位将rCFIm353从实施例2中构建的pBrCFIm353用KpnI和BamHI双酶切切下，连入载体pEGFP-N1(购自clontech公司)的KpnI，BamHI位点。将含GFP标签的rCFIm353和含myc标签的全长rCFIm68共转染入Hala细胞(购自ATCC)中，荧光显微镜下观测，发现rCFIm353定位于细胞质和细胞核中，而全长rCFIm68仅定位于细胞核中，结果如图7所示。图7中，rCFIm-FL表示全长rCFIm68，右侧图片为左侧图片和中间图片的叠加结果。
序列表<160>5<210>1<211>552<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>1Met Ala Asp Gly Val Asp His Ile Asp Ile Tyr Ala Asp Val Gly Glu1 5 10 15Glu Phe Asn Gln Glu Ala Glu Tyr Gly Gly His Asp Gln Ile Asp Leu20 25 30Tyr Asp Asp Val Ile Ser Pro Ser Ala Asn Asn Gly Asp Ala Pro Glu35 40 45Asp Arg Asp Tyr Met Asp Thr Leu Pro Pro Thr Val Gly Asp Asp Val50 55 60Gly Lys Gly Ala Ala Pro Asn Val Val Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Arg65 70 75 80Ile Ala Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Thr Trp Trp Thr Thr Asp Glu Asp85 90 95Leu Thr Glu Ala Val His Ser Leu Gly Val Asn Asp Ile Leu Glu Ile100 105 110Lys Phe Phe Glu Asn Arg Ala Asn Gly Gln Ser Lys Gly Phe Ala Leu115 120 125Val Gly Val Gly Ser Glu Ala Ser Ser Lys Lys Leu Met Asp Leu Leu130 135 140Pro Lys Arg Glu Leu His Gly Gln Asn Pro Val Val Thr Pro Cys Asn145 150 155 160Lys Gln Phe Leu Ser Gln Phe Glu Met Gln Ser Arg Lys Thr Thr Gln165 170 175Ser Gly Gln Met Ser Gly Glu Gly Lys Ala Gly Pro Pro Gly Gly Gly180 185 190Ser Arg Ala Ala Phe Pro Gln Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg Phe Pro195 200 205Gly Ala Val Pro Gly Gly Asp Arg Phe Pro Gly Pro Ala Gly Pro Gly210 215 220
Gly Pro Pro Pro Pro Phe Pro Ala Gly Gln Thr Pro Pro Arg Pro Pro225 230 235 240Leu Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gly245 250 255Gln Val Leu Pro Pro Pro Leu Ala Gly Pro Pro Asn Arg Gly Asp Arg260 265 270Pro Pro Pro Pro Val Leu Phe Pro Gly Gln Pro Phe Gly Gln Pro Pro275 280 285Leu Gly Pro Leu Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Val Pro Gly Tyr Gly290 295 300Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gln Gln Gly Pro Pro Pro Pro Pro305 310 315 320Gly Pro Phe Pro Pro Arg Pro Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Leu Thr325 330 335Leu Ala Pro Pro Pro His Leu Pro Gly Pro Pro Pro Gly Ala Pro Pro340 345 350Pro Ala Pro His Val Asn Pro Ala Phe Phe Pro Pro Pro Thr Asn Ser355 360 365Gly Met Pro Thr Ser Asp Ser Arg Gly Pro Pro Pro Thr Asp Pro Tyr370 375 380Gly Arg Pro Pro Pro Tyr Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Pro Pro Gly Arg385 390 395 400Glu Met Asp Thr Ala Arg Thr Pro Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Glu405 410 415Ile Met Asn Arg Asn Arg Ala Ile Ser Ser Ser Ala Ile Ser Arg Ala420 425 430Val Ser Asp Ala Ser Ala Gly Asp Tyr Gly Ser Ala Ile Glu Thr Leu435 440 445Val Thr Ala Ile Ser Leu Ile Lys Gln Ser Lys Val Ser Ala Asp Asp450 455 460Arg Cys Lys Gly Leu Ile Ser Ser Leu Gln Asp Cys Leu His Gly Ile465 470 475 480Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Arg Arg Arg Glu Arg Ser Arg485 490 495Glu Arg Asp His Ser Arg Ser Arg Glu Lys Ser Arg Arg His Lys Ser500 505 510Arg Ser Arg Asp Arg His Asp Asp Tyr Tyr Arg Glu Arg Ser Arg Glu515 520 525Arg Glu Arg His Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp530 535 540Arg Glu Arg Glu Tyr Arg His Arg
545 550<210>2<211>1659<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2atggcggacg gtgtggacca catagacatt tacgcggatg tgggggaaga gttcaaccag 60gaagcggaat atggtgggca tgatcagata gatttgtatg atgatgtcat ctctccatct120gcaaataatg gcgatgcccc agaagaccgg gactacatgg atactcttcc accaactgtt180ggtgatgatg tgggtaaagg ggcagcacca aacgttgtct atacttacac tggaaagaga240atcgcattgt atattggaaa tctaacatgg tggacaacag atgaggacct aactgaagca300gttcattctt tgggagtaaa tgatattttg gagataaaat tttttgaaaa tcgggcaaat360ggacaatcaa agggatttgc ccttgttggt gttggatctg aagcatcttc caaaaagtta420atggatcttt tgcctaaaag agaacttcac ggtcagaatc ctgttgtaac tccatgcaat480aaacagttcc tgagtcagtt tgaaatgcaa tccaggaaaa ctacacaatc aggacaaatg540tctggggaag gtaaagctgg tcctccagga ggcggttcac gcgcagcatt tccacaaggt600ggtagaggac ggggccgttt tccaggggct gttcctggtg gggacagatt tcctgggcca660gcaggaccag gagggccacc tccacctttc ccagctggac agactccacc acgtccacct720ctaggtccac ctggcccacc tggcccccca ggtcctccac ctcccggtca ggttctgcca780cctcctctag caggacctcc taatcgagga gaccgccctc caccaccagt tctttttcct840ggacaacctt ttgggcagcc tccgctgggt ccacttcctc ctgggcctcc acctccagtt900ccaggctacg gcccccctcc aggtccaccg cctccacagc agggaccacc tccacctcca960ggcccctttc cacctcgacc accaggtcca ctagggcctc cccttacact tgctcctcct 1020ccacatcttc cgggaccacc tccaggtgcc ccaccaccag ctccacatgt gaatcctgct 1080tttttccctc caccaactaa tagtggcatg ccaacatcag atagtcgagg tccaccgcca 1140acagacccat atggccgacc tccaccatat gataggggtg actatggtcc ccctgggagg 1200gaaatggata ctgcaagaac acctctgagt gaagctgagt ttgaagaaat catgaataga 1260aatcgggcaa tctctagcag tgctatttca agagctgtat ctgatgctag tgctggtgat 1320tatgggagtg ctattgaaac attggtaaca gcaatttctc taattaaaca atccaaagta 1380tctgccgacg atcgctgcaa aggtcttatt agctctttgc aagactgcct tcatggaatt 1440
gagtccaagt cctatgggtc tggatcaaga agacgtgaac gatcaagaga aagggaccat1500agtagatcac gggaaaagag tcgacgtcat aaatctcgga gtagagatcg ccatgatgat1560tattacagag agagaagcag agagcgagag agacaccggg atcgcgatcg ggatcgtgac1620cgggagcgcg accgagagcg agaataccgt catcgttag 1659<210>3<211>551<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>3Met Ala Asp Gly Val Asp His Ile Asp Ile Tyr Ala Asp Val Gly Glu1 5 10 15Glu Phe Asn Gln Glu Ala Glu Tyr Gly Gly His Asp Gln Ile Asp Leu20 25 30Tyr Asp Asp Val Ile Ser Pro Ser Ala Asn Asn Gly Asp Ala Pro Glu35 40 45Asp Arg Asp Tyr Met Asp Thr Leu Pro Pro Thr Val Gly Asp Asp Val50 55 60Gly Lys Gly Ala Ala Pro Asn Val Val Tyr Thr Tyr Thr Gly Lys Arg65 70 75 80Ile Ala Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Thr Trp Trp Thr Thr Asp Glu Asp85 90 95Leu Thr Glu Ala Val His Ser Leu Gly Val Asn Asp Ile Leu Glu Ile100 105 110Lys Phe Phe Glu Asn Arg Ala Asn Gly Gln Ser Lys Gly Phe Ala Leu115 120 125Val Gly Val Gly Ser Glu Ala Ser Ser Lys Lys Leu Met Asp Leu Leu130 135 140Pro Lys Arg Glu Leu His Gly Gln Asn Pro Val Val Thr Pro Cys Asn145 150 155 160Lys Gln Phe Leu Ser Gln Phe Glu Met Gln Ser Arg Lys Thr Thr Gln
165 170 175Ser Gly Gln Met Ser Gly Glu Gly Lys Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser180 185 190Ser Arg Ala Ala Phe pro Gln Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg Phe Pro195 200 205Gly Ala Val Pro Gly Gly Asp Arg Phe Pro Gly Pro Ala Gly Pro Gly210 215 220Gly Pro Pro Pro Pro Phe Pro Ala Gly Gln Thr Pro Pro Arg Pro Pro225 230 235 240Leu Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gly245 250 255Gln Val Leu Pro Pro Pro Leu Ala Gly Pro Pro Asn Arg Gly Asp Arg260 265 270Pro Pro Pro Pro Val Leu Phe Pro Gly Gln Pro Phe Gly Gln Pro Pro275 280 285Leu Gly Pro Leu Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Val Pro Gly Tyr Gly290 295 300Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Gln Gln Gly Pro Pro Pro Pro Pro305 310 315 320Gly Pro Phe Pro Pro Arg Pro Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Leu Thr325 330 335Leu Ala Pro Pro Pro His Leu Pro Gly Pro Pro Pro Gly Ala Pro Pro340 345 350Pro Ala Pro His Val Asn Pro Ala Phe Phe Pro Pro Pro Thr Asn Ser355 360 365Gly Met Pro Thr Ser Asp Ser Arg Gly Pro Pro Pro Thr Asp Pro Tyr370 375 380Gly Arg Pro Pro Pro Tyr Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Pro Pro Gly Arg385 390 395 400Glu Met Asp Thr Ala Arg Thr Pro Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Glu405 410 415Ile Met Asn Arg Asn Arg A1a Ile Ser Ser Ser Ala Ile Ser Arg Ala
420 425 430Val Ser Asp Ala Ser Ala Gly Asp Tyr Gly Ser Ala Ile Glu Thr Leu435 440 445Val Thr Ala Ile Ser Leu Ile Lys Gln Ser Lys Val Ser Ala Asp Asp450 455 460Arg Cys Lys Val Leu Ile Ser Ser Leu Gln Asp Cys Leu His Gly Ile465 470 475 480Glu Ser Lys Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Arg Arg Glu Arg Ser Arg Glu485 490 495Arg Asp His Ser Arg Ser Arg Glu Lys Ser Arg Arg His Lys Ser Arg500 505 510Ser Arg Asp Arg His Asp Asp Tyr Tyr Arg Glu Arg Ser Arg Glu Arg515 520 525Glu Arg His Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg530 535 540Glu Arg Glu Tyr Arg His Arg545 550<210>4<211>1656<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>4atggcggacg gcgtggacca catagacatt tacgcggatg tcggcgaaga gttcaaccag 60gaagctgaat atggtgggca tgatcagata gatttgtatg acgatgtcat atctccatct120gcaaataatg gagatgcccc agaagaccga gattacatgg atactctccc accaactgtt180ggtgatgatg tgggtaaagg agcagcacca aatgttgtct atacatatac tggaaagaga240attgcattat atattggaaa tctaacatgg tggacaacag atgaagactt aactgaagca300gttcattctt tgggagtaaa tgatattttg gagataaaat tttttgaaaa tcgggcaaat360ggccagtcaa aggggtttgc ccttgttggt gttggatctg aagcatcttc aaaaaagtta420atggatctgt tacctaaaag agaacttcat ggtcagaatc ctgttgtaac tccatgcaat480
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385 390 395 400Glu Met Asp Thr Ala Arg Thr Pro Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Glu405 410 415Ile Met Asn Arg Asn Arg Ala Ile Ser Ser Ser Ala Ile Ser Arg Ala420 425 430Val Ser Asp Ala Ser Ala Gly Asp Tyr Gly Ser Ala Ile Glu Thr Leu435 440 445Val Thr Ala Ile Ser450
权利要求
1.一种抗HIV病毒多肽，是将由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的多肽自氨基端的第453位氨基酸残基开始，向氨基端连续缺失0或自然数1至100中任意数值个氨基酸残基得到的101个多肽之一；或是将所述101个多肽的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽之一。
2.根据权利要求1所述的抗HIV病毒多肽，其特征在于所述抗HIV病毒多肽为由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的多肽，或是将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽。
3.根据权利要求2所述的抗HIV病毒多肽，其特征在于所述将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽是由自序列表中序列3的氨基端第1至451位氨基酸残基组成的多肽。
4.根据权利要求1所述的抗HIV病毒多肽，其特征在于所述抗HIV病毒多肽为由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的多肽，或是将由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽。
5.根据权利要求4所述的抗HIV病毒多肽，其特征在于所述将由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的多肽，是由自序列表中序列3的氨基端第1至351位氨基酸残基组成的多肽。
6.权利要求1-5中任一所述的抗HIV病毒多肽的编码基因。
7.根据权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的抗HIV病毒多肽的编码基因，是由序列表中序列2的自5′端第1位-第1359位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列；所述由自序列表中序列3的氨基端第1至451位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽的编码基因，是由序列表中序列4的自5′端第1位-第1353位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列；所述由自序列表中序列5的氨基端第1至第353位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽的编码基因，是由序列表中序列2的自5′端第1位-第1059位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列；由自序列表中序列3的氨基端第1至351位氨基酸残基组成的抗HIV病毒多肽，是由序列表中序列4的自5′端第1位-第1053位脱氧核苷酸组成的核苷酸序列。
8.含有权利要求6或7所述抗HIV病毒多肽的编码基因的工程菌、细胞系或载体。
9.权利要求1-5中任一所述的抗HIV病毒多肽在制备抗HIV病毒药物中的应用。
10.权利要求1-5中任一所述的抗HIV病毒多肽的编码基因在制备抗HIV病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗HIV病毒的多肽及其编码基因与应用。该抗HIV病毒多肽，选自下列多肽之一所述多肽是将由序列表中序列5的氨基酸残基序列组成的多肽，自氨基端的第453位氨基酸残基开始向氨基端连续缺失0或自然数1至100中任意一个数值个氨基酸残基组成的101个多肽；或是将所述101个多肽的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗HIV病毒活性的蛋白质。本发明的抗HIV病毒多肽可抑制HIV假病毒感染宿主细胞，可用于制备抗HIV病毒药物。
文档编号A61K48/00GK1786167SQ20051011423
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月21日 优先权日2005年10月21日
发明者刘利新, 高光侠 申请人:中国科学院生物物理研究所