专利名称：抗乙型肝炎病毒微小核糖核酸干扰分子及其设计方法
技术领域：
本发明涉及抗病毒基因治疗，具体涉及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因靶向灭活药物——抗HBV微小核糖核酸干扰分子(miR RNAi)及其设计方法。
背景技术：
乙型肝炎是一种由HBV引起的世界性传染病。据世界卫生组织估计，全世界超过20亿人被HBV感染，其中3.5亿人为慢性HBV携带者，中国约占1/3。每年至少有120万慢性HBV感染患者死于HBV相关疾病。虽然疫苗控制HBV感染发挥很大作用，但现存大量患者需要有效的治疗。目前国际公认的抗HBV药物如α干扰素(IFN-α)、拉米夫定(lamivudine，3TC)等的疗效都不理想。因此，研究与开发防治乙型肝炎的有效药物与方法仍然是目前医药界面临的一项紧迫而艰巨的任务。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是新近发展的一种基因治疗方法(Hannon GJ.RNA interference.Nature.2002 Jul 11；418(6894)244-51.)。研究表明，RNAi是细胞内自然发生的一种选择性灭活和调节特异基因的一种机制。当外源病毒或其他病原体进入细胞内，机体可通过一种叫Dicer的酶剪切此双链RNA并由此产生21-23聚(21-23mer)短双链特异小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)。这些siRNA在细胞内诱导形成RNA-酶抑制复合体，后者可以特异降解与siRNA同源的基因转录产物，从而抑制基因的表达。人类基因组有超过250个基因是用来编码微小RNA(miRNA)，一种内源性siRNA(BartelDP.Cell.2004 Jan 23；116(2)281-97.)。miRNA基因由RNA聚合酶II转录(LeeY，et al.EMBO J.2004 October 13；23(20)4051-4060.)，转录产物miRNA通过RNAi控制人类三分之一的基因，包括许多人类致病基因的表达。如果这些miRNA的缺乏或不适当的表达，可导致人类癌症和病毒感染。因此，干扰RNA技术将是研发根治乙型肝炎药物的一种新的技术方法。
HBV为比较严格的嗜肝DNA病毒。完整的HBV颗粒呈园形，直径42nm，双层结构，由外壳蛋白和核心成分组成。外壳蛋白包括S、前S1和前S2蛋白；核心成分则包括核心蛋白(HBcAg)、病毒DNA(HBV DNA)和DNA聚合酶。HBV基因组由一环形、部分双链DNA组成。HBV DNA长链(-)约3.2kb、短链S(+)约为400～1900bp。该基因组包括4个可被转录的开放读码区域——S、C、P和X区。S区由前S1、前S2和S基因组成，主要码组成病毒外壳的三种不同蛋白，即大蛋白、中蛋白和主蛋白；C区编码核心蛋白(HBcAg)。P区与另外三个区重叠，编码病毒DNA聚合酶等，为复制所必需。X基因产物为X蛋白(HBxAg)，可反式激活细胞内的某些癌基因及病毒基因，与肝癌的发生与发展有关。
本发明者根据RNAi的作用原理，通过比对20个HBV序列，其中包括10个从中国人分离的HBV序列，筛选确定了RNAi的靶序列，基于靶序列设计了对HBV基因具有靶向灭活作用的抗HBV miR RNAi，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是公开2个抗HBV miR RNAi的结构及其在HBV基因序列上的靶点。
本发明的另一个目的是提供抗HBV miR RNAi的设计方法。
所述的抗HBV miR RNAi是一种包含抗HBV miRNA基因的双链DNA寡核苷酸。其模板链和编码链的5′端各有一段由四个核苷酸组成单链突出用于抗HBVmiR RNAi的克隆。这种抗HBV miR RNAi可克隆到表达载体上得到表达克隆，然后转移到病毒载体包装成病毒感染细胞或组织，将miRNA基因带到细胞内。在RNA聚合酶II的催化下，模板链将被转录，转录产物自身折叠形成双链RNA，通过启动内源性RNAi途径诱导与它有同源序列的HBV基因转录产物的剪切和降解，使HBV基因灭活。因此，本发明涉及的抗HBV miR RNAi可定义为一种抗HBV的基因治疗药物，其化学本质是一种包含抗HBV miRNA基因的双链DNA寡核苷酸。
所公开的2个抗HBV miR RNAi分别作用于HBV的X蛋白和外壳蛋白。作用于HBV X蛋白基因的抗HBVmiR RNAi具有序列表中序列-1所示的DNA序列，作用于HBV外壳蛋白基因的抗HBV miR RNAi具有序列表中序列-2所示的DNA序列。
所公开的2个抗HBV miR RNAi的作用靶点分别位于HBV的X蛋白和外壳蛋白基因的一段保守序列上。其中作用于HBV X蛋白的抗HBV miR RNAi的具体靶点序列具有序列表中序列-3所示的DNA序列，而作用于HBV外壳蛋白的抗HBVmiR RNAi的具体靶点序列具有序列表中序列-4所示的DNA序列。
所提供的抗HBV miR RNAi的设计方法的特征在于1.通过序列比对筛选HBV基因的保守序列作为设计抗HBV miR RNAi的候选序列，该序列应不小于450bp；2.采用invitrogen网站提供的在线RNAi设计软件(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)，针对HBV保守序列设计抗HBV miR RNAi。
本发明对乙型肝炎治疗提供了一种新型的基因靶向灭活药物，并为进一步的抗HBV药物研究提供了很好的研发平台。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述实施例1抗HBV miR RNAi的设计1.应用BioEdit及其辅助软件Clustal W比对20个HBV序列，其中包括10个从中国人分离的HBV病毒序列，从HBV的X区和S区得到两个保守序列。其中HBV的X区保守序列长465bp，具有序列表中序列-5所示的DNA序列；而S区保守序列长1203bp，具有序列表中序列-6所示的DNA序列。
2.进入invitrogen的RNAi设计软件网页(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)，将筛选得到的保守序列贴入序列框，在靶向设计选择栏(Target Design Options)中选择“miR RNAi”类型，然后按软件向导操作完成抗HBV miR RNAi设计。给出的Top Strand、Bottom Strand和ds Oligo分别代表模板链、编码链和miR RNAi。
实施例2抗HBV miR RNAi的合成分别合成抗HBV miR RNAi的模板链和编码链寡核苷酸。两种寡核苷酸经退火(annealing)形成互补双链的抗HBV miR RNAi，其5′端上由四个核苷酸组成的突出单链用于抗HBV miR RNAi的克隆。
实施例3 抗HBV miR RNAi的克隆与包装应用invitrogen公司的试剂盒(BLOCK-iTTMLentiviral Pol II miR RNAiExpression System)将作用于HBV X蛋白和外壳蛋白的2个抗HBV miR RNAi分别或串联的方式克隆到表达载体(pcDNATM6.2-GW/miR或pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR)上，产生表达克隆。然后，应用适配载体pDONRTM221将抗HBV miR RNAi转移到pLenti6/V5-DEST载体上产生重组Lenti病毒表达克隆，进而包装成重组Lenti病毒颗粒。
实施例4重组Lenti病毒转染肝脏细胞与抗HBV的RNAi作用将分离纯化的重组Lenti病毒转染被HBV感染的肝脏细胞，48-96小时后对肝细胞进行HBV基因灭活检测。带有作用于HBV X蛋白和外壳蛋白的抗HBV miRRNAi的重组Lenti病毒在肝细胞内由RNA聚合酶II转录产成生miRNA，后者诱导RNA-酶抑制复合体生成，并特异地与HBV的X蛋白和外壳蛋白基因的表达产物互补，在核酸内切酶的作用下降解HBV的X蛋白和外壳蛋白基因的转录物，阻止HBV X蛋白和外壳蛋白的产生，从而抑制病毒基因的激活和新生病毒的包装。
序列表序列1模板链5′-TGCTGTGAAGTATGCCTCAAGGTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGACCTTGGCATACTTCA-3′编码链5′-CCTGTGAAGTATGCCAAGGTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGACCTTGAGGCATACTTCAC-3′序列2模板链5′-TGCTGAATGCTCCCACTCCTACCTGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCAGGTAGGTGGGAGCATT-3′编码链5′-CCTGAATGCTCCCACCTACCTGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCAGGTAGGAGTGGGAGCATTC-3′序列35′-CCGACCTTGAGGCATACTTCA-3′序列45′-TCAGGTAGGAGTGGGAGCATT-3′序列55′-ATGGCTGCTAGGGTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCATCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCGTCTCGGGGCCGTTTGGGTCTCTACCGTCCCCTTCTTCTTCTGCCGTTCCGGCCAACCTCGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGGTCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAA
AGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAATGATCTTTGTACTAGGACGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAA-3′序列65′-ATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGACAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCGTTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCAACAAGGATCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACTCCACCACACGGCGGTCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACAGCAGTGCCAGCAGCACCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAACTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGGGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTATTGCCTCTCCCATATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCTTCAACCACCAGCACAGGACCCTGCAGAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGA-3′。
权利要求
1.一种抗乙型肝炎病毒微小核糖核酸干扰分子，其特征是具有基因靶向灭活作用的2个分别作用于HBV的X蛋白基因和外壳蛋白基因的双链DNA寡核苷酸，其中作用于HBV X蛋白的miR RNAi具有序列表中序列-1所示的DNA序列结构；作用于HBV的外壳蛋白的抗HBV mi RNAi具有序列表中序列-2所示的DNA序列结构。
2.根据权利要求1所述的抗乙型肝炎病毒微小核糖核酸干扰分子，其特征是作用于HBV的X蛋白的抗HBV mi RNAi的作用靶点具有序列表中序列-3所示的DNA序列结构；作用于HBV的外壳蛋白的抗HBV mi RNAi的作用靶点具有序列表中序列-4所示的DNA序列结构。
3.根据权利要求1所述的2个抗HBV mi RNAi在制备治疗乙型肝炎药物上的应用。
4.一种抗乙型肝炎病毒微小核糖核酸干扰分子的设计方法，其特征是包括如下步骤(1)通过序列比对筛选HBV基因的保守序列作为设计抗HBV miR RNAi的候选序列，该序列应不小于450bp；(2)采用invitrogen网站提供的在线RNAi设计软件，针对HBV保守序列设计抗HBV miR RNAi。
5.根据权利要求4所述的抗乙型肝炎病毒微小核糖核酸干扰分子的设计方法，其特征是HBV基因的保守序列，其中HBV X蛋白基因的保守序列具有序列表中序列-5所示的DNA序列结构；HBV外壳蛋白基因的保守序列具有序列表中序列-6所示的DNA序列结构。
全文摘要
本发明公开一种抗乙型肝炎病毒微小核糖核酸干扰分子，其特征是具有基因靶向灭活作用的2个分别作用于HBV的X蛋白基因和外壳蛋白基因的双链DNA寡核苷酸，其中作用于HBV X蛋白和外壳蛋白的抗HBV mi RNAi分别具有序列表中序列－1和序列－2所示的DNA序列结构，其作用靶点分别具有序列表中序列－3和序列－4所示的DNA序列结构。公开的抗HBV mi RNAi设计方法包括筛选HBV基因的保守序列和采用invitrogen网站提供的在线RNAi设计软件针对HBV保守序列设计抗HBV miR RNAi两个步骤，还公开了序列表中序列－5和序列－6所示的HBV X蛋白和外壳蛋白基因上的保守序列。为进一步的抗HBV药物研究提供了很好的研发平台。
文档编号A61P31/20GK101024088SQ20061002033
公开日2007年8月29日 申请日期2006年2月20日 优先权日2006年2月20日
发明者刘永明 申请人:桂林医学院