蒲公英中酚酸类有效部位的制备及其抑制流感病毒的用途的制作方法

专利名称：：蒲公英中酚酸类有效部位的制备及其抑制流感病毒的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体而言，本发明涉及一种蒲公英植物提取物及其制备方法，该提取物可期待具有作为预防和治疗流感病毒感染引起的相关疾病之药物用途。
背景技术：
：流感病毒具有高度传染性，所以极易发生流行，甚至是世界范围的大流行。1917-1919年，欧洲爆发流感，导致2000万人死亡，是历史上最严重的一次流感爆发，而第一次世界大战的死亡人数只是850万人。我国也是流感多发国，自1957年以来的3次世界性大流行都起源于我国。流感病毒属正粘液病毒科，流感病毒属，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。由于流感病毒疫苗应用上的一些限制，以及该疫苗对临床流感患者无效等特点，抗病毒药物治疗在流感的控制中同样起着十分重要的作用。抗病毒药物根据它们针对病毒复制的不同环节可分为离子通道M2阻滞剂、神经氨酸酶抑制剂、流感病毒受体阻断剂和抗流感病毒反义寡核苷酸等。目前进入临床应用的主要为离子通道M2阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂。离子通道M2阻滞剂主要有两种金刚垸胺和金刚乙胺。他们均可产生显著的胃肠道、中枢神经系统副反应，如神经质、焦虑、注意力不集中、头痛、恶心和呕吐等。这些副作用一般较轻，多在用药后几小时内出现，停药后大多可迅速消失。由于离子通道M2阻滞剂对B型流感病毒缺乏活性，易产生耐药性，并且耐受性差。故它们没有被广泛应用。神经氨酸酶抑制剂目前进入临床应用的神经氨酸酶抑制剂有扎那米韦和奥司他韦，但至今为止尚未发现治疗流感病毒感染疾病的特中国传统医药是个资源丰富的宝库。数千年来，我们的祖先发现了很多临床上有效的能够预防与治疗感冒和抗病毒的天然药物，并长期使用这些中草药治疗和对抗流感以及其他病毒性疾病。中国境内数千年来虽有流感流行但没有爆发性死亡记录也说明了中医药的预防作用和治疗作用是十分确切的。在现今非典型性肺炎(SARS)以及禽流感肆虐的时代背景下，如何应用现代病毒药理学技术开发现代中药抗病毒新制剂是十分必要的。蒲公英为菊禾斗植物蒲公英(7bra:cacM/wmowgo//cw附Hand-Mazz，也称蒙古蒲公英)或同属数种植物的干燥全草，为清热解毒中药，主治乳痈、疔疮、目赤、咽痛、湿热黄疸和热淋涩痛等。蒲公英主要含有三萜类、植物甾醇类、倍半萜内酯类、香豆素类、黄酮类、酚酸类化合物、胡萝卜素类和脂肪酸类。其药理作用有抗菌消炎、抗氧化、保肝利胆、免疫调节和抗肿瘤等。目前，利用蒲公英单味药制成的注射剂、片剂和颗粒剂等广泛用于临床，治疗各种炎症性疾病取得了较好的疗效。蒲公英的药理作用主要为(1)广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、溶血性链球菌等具有较强杀灭作用，磺胺增效剂TMP可增强其抗菌作用。此外，对肺炎双球菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、绿浓杆菌也有较强抑制作用。对结核杆菌、炭疽杆菌、幽门螺旋杆菌、皮肤真菌、单纯疱疹病毒、钩端螺旋体等也具有一定抑制作用。(2)抗炎作用临床上对乳腺炎、肝炎、支气管炎、咽喉炎、腮腺炎、胆囊炎、胃炎等炎症性疾病均具有较好的疗效。据报道，蒲公英乙酸乙酯提取物及其主要成分木犀草素和木犀草素—7-0-(3-D-葡萄糖苷能抑制脂多糖(LPS)刺激的小鼠RAW264.7巨噬细胞--氧化氮合成酶(iNOS)和环氧合酶一2(COX-2)歪白的表达[HuC，KittsDD.Luteolinandluteolin-7-O-glucosidefromdandelionflowersuppressiNOSandCOX-2inRAW264.7cells.M/ecw/arawdCe//w/Gr历oc/2emz^7,2004,265:107.]。(3)抗氧化作用蒲公英提取物总黄酮具有类超氧化物歧化酶(SOD)作用，能有效清除超氧阴离子自由基和羟自由基。(4)保肝利胆作用蒲公英水提物和注射液具有保肝利胆作用，能降低四氯化碳诱导的肝损伤大鼠谷丙转氨酶(ALT)水平，并能改善肝细胞变性坏死。此外还有报道蒲公英的水提物和醇提物具有抗肿瘤作用，和免疫调节作用等。蒲公英具有较强的清热解毒功效，具有较高的研究和开发价值，但国内对蒲公英的研究主要停留在其粗提物上，尤其缺乏药效物质基础相关研究；抗病毒及相关研究未见报道。国内的专利一般都是以复方形式应用；少有从蒲公英中提取有效部位并针对病毒抑制进行研究的报道。我们用一定的技术手段对蒲公英植物不同的提取物部位进行了抑制流感病毒的研究。以阳性药物利巴韦林(病毒唑)为对照的药效学试验表明，蒲公英提取物的酚酸类有效部位针对上呼吸道感染病症在体内外抗病毒试验和动物实验性治疗试验中显示出良好的活性致狗肾传代细胞(MDCK)半数中毒浓度(TD5Q)为3.26mg/ml，90%中毒浓度为8.69mg/ml，最大无毒浓度在100—1000(ig/ml之间。蒲公英提取物的酚酸类有效部位抗流感病毒FM-1(甲型流感病毒的鼠肺适应株)的半数有效浓度(EC5。)为213|ig/ml，治疗指数为15.3。蒲公英提取物的酚酸类有效部位致鸡胚的最大无毒剂量为TC(尸10mg/胚，对流感病毒FM-1感染鸡胚的最小抑制浓度(MIC)为10mg/ml。动物急性毒性试验表明蒲公英提取物的酚酸类有效部位毒副作用很低。我们对该有效部位(蒲公英酚酸类有效部位)进行了物质基础研究，发现了其中含有四个木犀草素骨架的黄酮类化合物成分；更为进一步的成果是我们首次发现该提取部位(酚酸类有效部位)中除含有咖啡酸、阿魏酸和绿原酸等传统酚酸类活性物质外，还含有二个结构相似的双咖啡酰奎尼酸类酚酸化合物活性物质，它们的结构是3,5-0双咖啡酰基奎尼酸；3,4-0-双咖啡酰基奎尼酸；4，5-0-双咖啡酰基奎尼酸。而该类咖啡酰奎尼酸类化合物在我们以往的抗病毒筛选中，已经过验证是有效的抑制流感病毒的活性成分，因此根据这些有效成分富集后抗病毒药效的增高事实，可以推论该蒲公英有效部位有望开发成为新型的抑制病毒感染的中药新药，并以其无毒副作用、价格低廉等优势替代现有抗病毒类中成药。其中，我们首次报道的在该种植物中发现的双咖啡酰奎尼酸类化合物是--类由奎尼酸(quinicacid:)与两个咖啡酸(caffeicacid)通过酯化反应縮合而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界并有着多种显著的药效活性。(赵昱，赵军，李湘萍，周长新，孙汉董，郝小江，肖培根，咖啡酰奎尼酸类化合物研究进展，^，屮^^,吉，2006年)由此完成本发明。
发明内容本发明的目的是提供了一种蒲公英植物中富含酚酸类化合物的提取物；本发明的另---目的是提供了一种制备蒲公英植物中富含酚酸类化合物提取物的方法；本发明的再一目的是提供了将蒲公英植物中富含酚酸类化合物的提取物用于抑制流感病毒的用途；本发明的又一目的是提供了一种含有蒲公英植物中的富含酚酸类化合物提取物的药物或药物组合物。其特征为该提取部位中除含有咖啡酸、阿魏酸和绿原酸外，还含有三个结构相似的双咖啡酰奎尼酸类酚酸化合物活性物质，它们是3,5-0-双咖啡酰基奎尼酸；3,4-0-双咖啡酰基奎尼酸；4,5-0-双咖啡酰基奎尼酸。本发明中的蒲公英植物中富含酚酸类化合物提取物按比色法测定含酚性化合物含量在20%以上。具体实施方案以往的植化研究发现蒲公英植物中含有三萜类、香豆素类、酚酸类(包括含酚羟基的黄酮类)、倍半萜类、植物甾醇类、胡萝卜素类和长链脂肪酸类化合物。本发明人根据不同提取部位对流感病毒抑制结果为活性指标发现其粗提物具有一定体外抗病毒活性，且其抗病毒活性成分集中在植物提取物的大极性酚酸类部位，通过工艺优化，本发明人采用水或水醇溶剂提取辅以多种正、反相层析手段得到该有效部位。经一维和二维核磁共振波谱、质谱、红外、紫外等光谱数据，我们首次发现该大极性酚酸类有效部位含有两类化合物，一是四个木犀草素骨架的黄酮类化合物成分；再一类就是咖啡酸和绿原酸等传统酚酸类活性物质，以及三个结构相似的双咖啡酰奎尼酸类酚酸化合物，它们是3，5-0-双咖啡酰基奎尼酸；3,4-0-双咖啡酰基奎尼酸；4,5-0-双咖啡酰基奎尼酸。近代药理学试验研究表明此类木犀草素骨架的黄酮类化合物和单、双咖啡酰基奎尼酸类化合物具有多种重要生理活性，主要是针对免疫系统的作用表现在抑制白三烯合成和释放，抑制乙肝病毒和艾滋病毒，抑制组胺释放，从而可用于抗炎、抗病毒和治疗过敏性疾病。此外还发现其具有强效抗氧化作用、抑制脂氧酶抗动脉粥样硬化作用、抗血小板聚集活性以及降血脂作用等活性。(文献李袓晟、朱志安，医学综述，2004，10(4)，249—250)。同时，本发明中的木犀草素骨架的黄酮类化合物以及咖啡酰基奎尼酸等酚酸类化合物在有效部位中含量颇高，总酚酸有效部位在提取物中的含量超过了20%。本发明特别强调的一点是我们首次报道从蒲公英提取物有效部位中分离得到三个具有高效生理活性的双咖啡酰基奎尼酸类化合物。经红外、质谱、紫外和核磁共振波谱等综合解析推导出三个双咖啡酰基奎尼酸类化合物结构如下。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>化合物z,化合物Z2化合物Z33，5-6>-双咖啡酰基奎尼酸3,4-0-双咖啡酰基奎尼酸4,5-(9-双咖啡酰基奎尼酸具体而言，本发明中含有木犀草素骨架的黄酮类化合物及咖啡酰奎尼酸类化合物的酚酸类有效部位的制备方法如下由蒲公英的全草经醇水系统提取、柱层析方法纯化。具体包括下列步骤a.用水-强极性有机溶剂(常用醇水混合溶剂)的混和液提取经粉碎或切成小段的药材，浓縮提取液回收有机溶剂得到浓縮液；b.将步骤a得到的浓縮液经大孔吸附树脂柱层析，先以水洗至近无色，继以3080%乙醇洗脱；c.将上述乙醇洗脱液减压浓缩至无醇味，采用喷雾干燥法进行千燥，得到粉末较细色泽均匀的有效部位，该有效部位为主要含有咖啡酰奎尼酸类化合物的混合物。本发明中的制备方法中，步骤a中的醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇或它们的混合物，优选甲醇及乙醇。醇水混合溶剂可以是醇和水以任意比例混合的溶剂，优选乙醇和水的混合溶剂，尤其优选30一75%的乙醇水溶液。歩骤b中柱层析所用介质可以是硅胶、反相硅胶、大孔树脂、离子交换树脂、氧化铝、葡聚糖凝胶(Sephaciex)类。优选大孔树脂。洗脱溶剂可以是丙酮、醇、水或者是它们的混合物。优选乙醇和水的混合溶剂进行梯度洗脱。步骤c中浓縮后待喷雾千燥溶液的密度在1.01.4内，优选1.05L25。本发明中的药材可以是任意一种中国产的蒲公英属植物任一部位，即可以是蒲公英(又称蒙古蒲公英)(7braxacwwwo"go/ZcwwHand-Mazz)、碱地蒲公英(乂称华蒲公英)(7braxac廳w'"z,c扁Kitag)、热河蒲公英(又称白缘蒲公英)(raraxacwmDiels)、东卩匕、蒲公英(Tbraxacwmo/w〖awwmKitag)、反甚蒲公英(Zlaraxacwwg/3^0c/owDahlst)、兴安蒲公英(raraxac騰>/"706訓Kitag)等中国药品市场上常见的蒲公英药材，可以是干品或鲜品，可以是蒲公英药材植物的根、茎、叶、花、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物。优选全-草。—更^[尤选蒲公英(又禾尔蒙古蒲公英)(Jbrajcacwwwowgo//cM/wHand-Mazz)禾口/或碱地蒲公英(又称华蒲公英)(7braxacwwKitag)的全草部分。本发明之说明书中均简称蒲公英。本发明人发现，本发明得到的蒲公英酚酸类成分有效部位提取物具有抑制流感病毒生长的功能；可以用于治疗流感病毒引起的感染症等。从而可能开发出抗流感病毒类药物组合物。这种药物组合物可以用制药领域中的常规技术制成，可以制成各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等。这些药物组合物可以用于治疗流感病毒感染疾病用途。下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。实施例1蒲公英植物中酚酸类化合物及药物组合物的制备取10kg蒲公英药材风干的样品，切成小段，以50%乙醇水溶液加热提取两次，第一次用8倍量，第二次用6倍量。第1次提取2小时，第2次提取1.5小时，浓缩，上样于己处理好的大孔吸附树脂，以水洗至色较浅，继以50%乙醇洗脱至色浅，洗脱液减压回收，喷雾千燥得原料细粉，此即为本发明中蒲公英植物提取物的酚酸类化合物有效部位，以下简称为喷干粉原料。以喷干粉原料(淀粉+微晶纤维素)按一定比例(1:0.51:3，其中淀粉微晶纤维素的范围为l:00:1)制粒后套入胶囊中(根据需要可以是()4号胶囊)，即得。以咖啡酸为标准品按比色法测定该有效部位含酚酸类化合物含量，具体方法为1.仪器与试药紫外-可见分光光度仪；十万分之一天平；甲醇，铁氰化钾，三氯化铁，盐酸为分析纯十二烷基磺酸钠为化学纯。咖啡酸对照品和蒲公英提取物喷干粉原料由浙江海正天华新药研发有限公司提供。2.方法与结果2.1对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品2.50mg，以无水乙醇溶解并定容至25ml。2.2供试品溶液的制备取蒲公英提取物喷干粉原料(11.2mg)，转移至50ml的容量瓶中，溶解并定容至刻度，移取2ml至25ml容量瓶中，以无水乙醇或蒸馏水补加至3ml的70%乙醇溶液。2.3标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，置25ml量瓶中，分别加无水乙醇至3.0ml，再各加蒸馏水2.0ml，再分别精密加入0.3%十二烷基磺酸钠溶液2.0ml,0.6%铁氰化钾一0.9%三氯化铁(1:1)溶液2.0ml，摇匀，暗处放置5分钟，加0.1mol/L盐酸溶液至25ml，摇匀，暗处放置20分钟，以随行溶液为空白，在500nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品质量为横坐标，计算标准曲线。结果见下表，标准曲线为y=0.2068x-0.0331，r2=0.9998。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.4样品含量测定精密吸取喷干粉原料供试品溶液，以随行溶液为空白，同2.3所述在500nm处测定吸光度。并通过标准曲线计算样品总酚含量。测定样品吸光度为1.3126，根据标准曲线计算含量，结果为蒲公英提取物喷干粉原料中总酚以咖啡酸为标准品计含量为36.27%。2.5样品中咖啡酸单体和木犀草素7-P-D-葡萄糖苷单体含量的测定仪器WatersAlliance型高效液相色谱仪，配自动进样器及PDA二极管阵列检测器。色谱条件色谱柱为SymmetryC18(5|im，4.6x150mm);检测波长为280nm;柱温30"C;流速0.8mL/min;流动相甲醇/O.1%醋酸，梯度洗脱，流动相组成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.5.1标准曲线的绘制精密称取咖啡酸标准品1.90mg，置5mL容量瓶中，50%甲醇溶解定容。精密称取2mL置10mL容量瓶中；精密称取木犀草素-7-0-(3-D-葡萄糖苷标准品5.30mg，置10mL容量瓶中，50%甲醇溶解定容。精密称取2mL置有咖啡酸标准溶液2mL的10mL容量瓶中；50%甲醇稀释定容。配置成咖啡酸和木犀草素-7-0-(3-D-葡萄糖苷的混合标准溶液，浓度分别为0.076mg/mL和0.106mg/mL，备用。精密称取喷干粉原利.103.8mg，置50mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度，0.45(im微孔滤膜过滤，备用。精密称取混合标准品1pL、2pL、3pL、4pL、5^L，按照上述色谱条件测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制咖啡酸和木犀草素7-0-葡萄糖苷的标准曲线。得咖啡酸回归方程为Y:::156750.7+6650425x，r:0.9990;木犀草素7-O-葡萄糖苷回归方程为Y=43636.6+1876428x，r=0.9991。2.5.2喷干粉原料的含量测定精密称取该样品溶液5pL，按照2.5.1项下色谱条件进样，测定峰面积，根据上述标准曲线计算含量，结果显示蒲公英提取物喷干粉原料样品中咖啡酸含量为0.63%，木犀草素7-0-葡萄糖苷含量为1.00%。2.6蒲公英提取物喷干粉原料样品中双咖啡酰奎尼酸类酚酸性化合物的波谱数据2.6.13,5-6>-双咖啡酰基奎尼酸(Z,):Z,为淡黄色粉末，易溶于甲醇、水。在254nm下有弱蓝色荧光，与0.6%三氯化铁甲醇溶液反应显黄绿色。熔点170-172°C。(温度未校正)。[a诏:一198.r(甲醇;c0.32)紫外光谱UVmax(甲醇)220，247，300sh,330nm。ESI质谱(m/e):515，352，191，173。化合物Z,的"H核磁共振谱仪器INOVANMR400MHz;TMS为内标；溶剂気代甲醇；化合物Z,的'H-NMR中给出了两组咖啡酰基质子的特征信号S7.04(2H,brs),6.94(2H，brd,J=8.4Hz)，6.75(2H,d，J=8,4Hz)和两组AB型的反式烯质子信号56.33,6.24(各1H，d，J=16.0Hz)和S7.59,7.55(各1H，d,J=16.0Hz)，表明化合物Z,中存在两个咖啡酰基片断。此外，5.39(1H,m),5,36(〗H,m)和3.94(1H,d,J=4.4)的三个连氧氢以及2.29(1H,d，J=13.2Hz),2.16(1H，d,J=13.2Hz)和2.16(2H,m)四个质子信号，根据其化学位移以及峰形特征可归属于奎尼酸部分的七个脂肪质子的信号。根据化合物Z,的'H-NMR中H的化学位移值与文献对比，可以初步判定该化合物为3，5-(9-双咖啡酰基奎尼酸。化合物Z,的l3C核磁共振谱仪器INOVANMR100MHz;TMS为内标；溶剂気代甲醇；化合物Z,的。C-NMR和DEPT(不失真的极化转移增强)谱图在S114-169间给出了十个不饱和的次甲基碳(S115.1，115.2，115.6(2CH)，1J6.5(2CH)，123.0，123.1，146.8，147.0)，六个芳香季碳(5127.8，127.9,146.8(2C)，149.6，149.5)和两个a，卩-不饱和羰基的碳原子信号(S168.9,168.3)，进-一步证明了化合物Z,中含有两个咖啡酰基结构片断。此外，还有两个亚甲基碳(S36.1，37.8)，3个连氧的次甲基碳(572.6，72.1，70.7)，一个季碳(S74.9)和一个羧羰基信号(S177.8)，与文献中报道的奎尼酸的碳化学位移非常相似，且化合物Z,的奎尼酸结构片断的C-3和C-5存在酰化位移，从而可以推断出化合物Z:的母核应该是奎尼酸，并且有两个咖啡酰基取代基分别联在奎尼酸母核的3位和5位。且根据化合物Z,的nC-NMR中C的化学位移值与文献对比，可以初步判定该化合物为3,5-6>-双咖啡酰基奎尼酸。经过二维核磁共振谱如HSQC、HMBC、NOESY等验证，最终确定蒲公英提取物有效部位中的咖啡酰奎尼酸类化合物Z,结构为3,5-0-双咖啡酰基奎尼酸。2.6.23,4-0-双咖啡酰基奎尼酸(Z2):Z2质谱负离子FABMS显示准分子离子峰m/z515[M-l]—。红外化合物Z2的IR谱和化合物Z,的极其相似，其示有羟基(3420cm—。，酯基(1696cm-1)，苯环(1603，1523，")和双键(1632cm")。'H，13C以及DEPT谱可以推出化合物Z2的分子式为C25H24Ol2，化合物Z2的'HNMR中给出了两组咖啡酰基质子的特征信号S7.08(1H，brs),7.07(IH，brs)，6.95(2H,m),6.78(2H，d，J=8.4Hz)和两组AB型的反式烯质子信号S6.32,6.30(各1H,d,J=16.0Hz)和57.61,7.57(各1H,d,J=16.0Hz)。13CNMR以及DEPT谱在5114-169间给出了十个不饱和的次甲基碳(S115.0，115.2(3CH)，116.5(2CH)，123.2(2CH)，147.3(2CH)，六个芳香季碳(S127.7，127.8，146.8(2C),149.6(2C))和两个a,P-不饱和羰基的碳原子信号(S168.5(2C))，进一歩证明了化合物Z2中含有两个咖啡酰基结构片断。此外，S5.68(1H,brs),5.6(1H,brs)和4.27(1H，brs)的三个连氧氢以及2.16(2H,m)和2.03(2H，m)四个质子信号，以及BCNMR中的两个亚甲基碳(S39.1，37.7)，3个连氧的次甲基碳(S75.3，70.1，67.0)，-一个季碳(S75.9)和一个羧羰基碳信号(S175.1)，与文献中报道的奎尼酸的化学位移非常相似。且化合物Z2的奎尼酸结构片断的C-3和C-4存在酰化位移，从而可以推断出化合物Z2的母核应该是奎尼酸，并且有两个咖啡酰基取代基分别联在奎尼酸母核的3位和4位。HMBC谱图中，55.68(H-3)，5.16(H-4)与S168.5(C-9')的碳具有远程相关信号，因此两个咖啡酰基连在奎尼酸的3位和4位。经过二维核磁共振谱如HSQC、HMBC、NOESY等验证，最终确定蒲公英提取物有效部位中的咖啡酰奎尼酸类化合物&为3，4-0-双咖啡酰基奎尼酸。2.6.34，5-(9-双咖啡酰基奎尼酸(Z3):1.质谱负离子FABMS显示准分子离子峰m/z515[M-l]—，353[M-H-162(咖啡酰基)]—，191[M-H-162(咖啡酰基)--162(咖啡酰基)]—，173[M-H-162-162-18(H20)r。2.红外化合物Z3的IR谱和化合物Z,的极其相似，其示有羟基(3445cm-1)，酯基(1694cm")，苯环(1597，1524cm")以及反式双键(978cm")。3."H，BCNMR以及DEPT谱可以推出化合物Z3的分子式为C25H24012，化合物Z;的NMR中亦给出了两组咖啡酰基质子的特征信号56.99(1H,brs),6.96(1H，brs)，6.88(1H,d，J=8Hz),6.85(1H，d，J=8Hz)，6.71(2H,m)和两组AB型的反式烯质子信号56.25,6.15(各1H,d,J=16.0Hz)和37.56,7.48(各1H，d,J=16.0Hz)。l3CNMR以及DEPT谱在在5114-169间给出了十个不饱和的次甲基碳(S115.1(2CH)，116.4(2CH)，123.2(2CH)，147.5,147.7(3CH))，六个芳香季碳(S127.5,127.6，146.7(2C)，149.6(2C))和两个a，(3-不饱和羰基的碳原子信号(S168.6，168.3)，进一步证明了化合物Z3中含有两个咖啡酰基结构片断。此外，5.74(1H,brs)，5.09(1H,d,J=7.2)和4.35(1H,brs)的三个连氧氢以及2.26(2H,m),2.10(lH,m)和2.26(lH,m)四个质子信号，以及l3CNMR中的两个亚甲基碳(338.5，39.8)，3个连氧的次甲基碳(S76.1，69.8，69.2)，-一个季碳(S76.2)和一个羧羰基碳信号(S176.1)，与文献中报道的奎尼酸的碳原子化学位移非常相似。且化合物Z3的奎尼酸结构片断的C_4和C-5存在酰化位移，从而可以推断出化合物Z:i的母核应该是奎尼酸，并且有两个咖啡酰基取代基分别联在奎尼酸母核的4位和5位。4.HMBC谱图中，S5.09(H-4)，5.74(H-5)与S168.3,168.6的碳具有远程相关信号，因此两个咖啡酰基连在奎尼酸的4位和5位。经过二维核磁共振谱如HSQC、H:MBC、NOESY等验证，最终确定蒲公英提取物有效部位中的咖啡酰奎尼酸类化合物Z3为4,5-0-双咖啡酰基奎尼酸。实施例2:由实施例1制备得到的蒲公英提取物喷干粉原料胶囊剂的制备用由实施例1制备得到的、含有权利要求16中的药物组合物10，000mg，以原料淀粉微晶纤维素按比例(1:0.5:0.5)制粒后套入l号空心胶囊中。共装100粒，每个胶囊重200mg。实施例3:由实施例1制备得到的蒲公英提取物喷干粉原料组合物胶囊剂的制备用由实施例1制备得到的、含有权利要求16中的药物组合物5,000mg，以原料淀粉:微晶纤维素按比例(1:1:1)制粒后套入2号空心胶囊中。共装100粒，每个胶囊重150mg。蒲公英提取物喷干粉原料具有重要的生物活性，本发明将该蒲公英提取物喷干粉原料采用微量细胞病变抑制法和中性红染色法，空斑法，鸡胚法，以利巴韦林(病毒唑)为阳性对照药，从蒲公英提取物喷干粉原料的最大无毒浓度开始，测定蒲公英提取物喷干粉原料抑制流感病毒FM-1株的半数有效浓度(EC5Q)以及治疗指数。发现蒲公英提取物喷干粉原料在体外具有较强抑制流感病毒FM-1的作用。本发明的蒲公英提取物喷干粉原料可以与药学上常用的辐料或载体结合，制备得到具有预防和治疗流感病毒引起的病症之药物及药物组合物或保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。本发明的蒲公英提取物喷干粉原料还可以与现己上市的流感病毒抑制剂或其他治疗流感相关病症的治疗药物及其原料药如金刚烷胺和金刚乙胺和/或神经氨酸酶抑制剂如扎那米韦和奥司他韦等联合使用，制备得到具有治疗流感相关病症活性的组合物或复方制剂，可预期成为治疗流感疾病药品或者保健品。上述各类药物组合物或者保健品可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。为了更好地理解本发明的实质和本发明所述蒲公英提取物酚酸性有效部位在药物开发上的应用前景，下面以药理实施例形式分别介绍本发明中制备出的蒲公英提取物有效部位采用微量细胞病变抑制法和中性红染色法，空斑法，鸡胚法，以利巴韦林(病毒唑)为阳性对照药，从蒲公英提取物喷干粉原料的最大无毒浓度开始，测定蒲公英提取物喷千粉原料抗流感病毒FM-1株的半数有效浓度(EC5。)，治疗指数等药理实验结果，说明其在制药领域中的新用途。药理实施例给出了代表性蒲公英提取物酚酸性有效部位的部分活性数据。必须说明，本发明的药理实施例及所采用的药效学模型是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进，以及在本发明实施例所涵盖的病因基础上的简易扩充的其他适应症都属于本发明要求保护的范围。药理实施例1:微量细胞病变抑制(CPE)法研究实施例1制备得到的蒲公英提取物喷干粉原料的抗流感病毒作用1.1蒲公英提取物喷干粉原料细胞毒性测定取生长旺盛的MDCK细胞一瓶，培养成单层细胞。弃去营养液，用PBS洗2次。将已配好的蒲公英提取物喷干粉原料原液，分别用无血清1640液作连续10倍的系列稀释，稀释6个浓度，并标记为原液(100mg/ml)，1Omg/ml、lmg/ml、100吗/ml、10吗/ml、l吗/ml、0.1吗/ml7个浓度。然后将原液和6个浓度药液分别加入MDCK细胞板中，并设正常细胞对照。整个实验重复3次。将96孔板置37i:、5%(:02孵箱中培养3天。观察细胞病变效应(CPE)，结果记录为"++++"为100%病变；"+++"为75%病变；"++"为50%病变"+"为25%病变，"为阴性结果。观察结東后将96孔板结晶紫染色后保存。蕞终经;+算确定藩公英提取物啧干粉原料对细胞半数中毒浓度(TD5G)为3.22mg/mL，90%中毒浓度为8.18mg/mL，最大无毒浓度为1000pg/ml。1.2微量细胞病变抑制法测定蒲公英提取物喷干粉原料体外抗病毒作用取生长旺盛的单层MDCK细胞一瓶，加入1640稀释的、浓度为100TCID5o病毒液IOOW，37°c、5。/。CO/F吸附2小时。加入蒲公英提取物喷干粉原料最大无毒浓度(TDQ)药液作连续2倍稀释的6个浓度，每浓度3孔，37°c、5%C02下培养3天。加入利巴韦林(病毒唑)最大无毒浓度(TD())药液作连续2倍稀释的6个浓度，37°C、5%CO/F培养3天。分别设立实验药和阳性药、细胞对照和病毒对照组。3天后显微镜下观察细胞病变，记录病变程度(CPE)。按Reed-Muench法分别计算蒲公英提取物喷千粉原料和利巴韦林的抗病毒效果。按照cpe法测出的蒲公英提取物喷千粉原料的半数有效浓度1<:5()=238pg/ml;治疗指数TI:TD5q/IC5(^13.5;而阳性对照的利巴韦林的半数有效浓度50.0吗/ml;治疗指数丁1=253.0。药理实施例2:中性红染色法研究实施例1制备得到的蒲公英提取物喷干粉原料的抗流感病毒作用2.1蒲公英提取物喷干粉原料细胞毒性测定同药理实施例1。2.2取生长旺盛的单层MDCK细胞^瓶，加入1640稀释的、浓度为100TCIDs。病毒液10037°C、5%0)2下吸附2小时。加入蒲公英提取物喷干粉原料最大无毒浓度(TDO)药液作连续2倍稀释的6个浓度，每浓度3孔，37°c、5%0)2下培养3天。加入利巴韦林(病毒唑)最大无毒浓度(TD())药液作连续2倍稀释的6个浓度，37°C、5%<:02下培养3天。分别设立实验药和阳性药、细胞对照和病毒对照组。3天后用PBS洗后加入屮性红染液，37°C，5%C02孵育1.5小时。弃染色液，用PBS再清洗，然后每孔加90%乙醇，室温放置2-3小时，通过酶标仪，以病毒对照孔为空白对照，在546nm处比色，测定其吸光度A值。记录试验结果。按照中性红染色法计算出来的蒲公英提取物喷干粉原料的半数有效浓度206吗/ml;治疗指数T卜TDWIC5f15.6;而阳性对照的利巴韦林的半数有效浓度33.9pg/ml;治疗指数丁1=287.0。中性红染色计算结果和CPE观察结果基本符合，结果显示利巴韦林的抗病毒效果好于蒲公英提取物喷干粉原料。药理实施例3:空斑抑制法(PFU)研究实施例1制备得到的蒲公英提取物喷干粉原料的抗流感病毒作用3.1蒲公英提取物喷干粉原料细胞毒性测定同药理实施例1。3.2空斑抑制法取生长旺盛的单层MDCK细胞三瓶，用PBS清洗，加入预先稀释好的100TCID50FM-1病毒液，100pl/每孔，37°C、5%(:02下吸附1.5小时。将蒲公英提取物喷干粉原料从最大无毒浓度(TD。)开始，再作连续2倍稀释5个浓度，分别加入上述24孔板中。37°C、5%032下培养40小时。培养板细胞加福尔马林固定，结晶紫溶液染色，进行空斑计数。与病毒对照比较，计算50%抑制浓度IC5。实验重复3次。求得平均PFU。与病毒对照比较，计算50。/。抑制浓度IC5(,为300pg/ml，即蒲公英提取物喷干粉原料在300pg/ml时能抑制FM-1流感病毒株50%的空斑形成。药理实施例4:鸡胚法测定由实施例1制备得到的蒲公英提取物喷干粉原料的药物对流感病毒的抑制作用4.1流感病毒对鸡胚的半数感染量将不同稀释度的流感病毒(IVA)分别接种于鸡胚中，收集尿囊液，通过血凝试验，测定病毒在鸡胚中半数感染量(EID50)，以了解IVA在鸡胚中的毒力情况，采用Reed-Muench法计算，IVA在鸡胚中的EIDso为10—V0.1mL，在抗病毒实验中，采用的病毒攻击量为ioo个mD,4.2药物对鸡胚的毒性作用为了解蒲公英提取物喷干粉原料、利巴韦林对鸡胚的毒性作用，确定试验中用药剂量，将受试药和对照药各个浓度(100mg/mL，10mg/mL，1mg/mL，100吗/mL)分别接种5只鸡胚，0.25mL/胚。35"C培养5天后观察。蒲公英提取物喷干粉原料组原液浓度(100mg/mL)死亡2只，说明蒲公英提取物喷干粉原料100mg/mL的浓度对鸡胚有一定毒性，其它各浓度未出现鸡胚死亡，说明这些浓度的蒲公英提取物喷干粉原料对鸡胚无毒性作用或毒性较小；利巴韦林组鸡胚发育一般较小，原液浓度死亡5只，说明利巴韦林100mg/mL的浓度对鸡胚毒性较大，其它各浓度未出现鸡胚死亡，说明这些浓度的利巴韦林对鸡胚无毒性作用或毒性较小。两种药物对鸡胚的最大无毒浓度均为10mg/mL。4.3鸡胚法测定药物对流感病毒的抑制作用将不同稀释度的蒲公英提取物喷干粉原料分别注射0.25mL于鸡胚中，半小时后经相同途径注射100EID5o半数感染量的病毒0.1mL，孵育5天。收集尿囊液，测其血凝效价滴度。能抑制其血凝滴度32倍以上所注射的最小药量，即为其抑制效价(MIC)。采用Fisher精确概率检验法，比较各治疗组的感染率。结果表明，蒲公英提取物喷干粉原料浓度为10mg/胚剂量组对流感病毒有明显的抑制作用。利巴韦林10mg/胚、1mg/胚剂量组均有明显抑制作用，可以看出，蒲公英提取物喷干粉原料鸡胚内抗病毒作用比利巴韦林低，其抑制效价MIC二10mg/mL。以上抗病毒试验实施例结果均说明蒲公英提取物喷干粉原料在预防和治疗流感病毒感染性疾病上有着显著的功效。有望进一步开发成为预防和治疗流感疾病的中药新药。权利要求1.一种具有抑制流感病毒功能的蒲公英植物提取物，其特征为由下列方法制备得到a)用溶剂提取经粉碎或切成小段的蒲公英植物，浓缩提取回收溶剂；b)将步骤a得到的浓缩液经柱层析，水洗，然后用醇溶剂洗脱；c)将步骤b得到的洗脱液减压浓缩至无醇味，干燥，粉碎得产品。2.根据权利要求1的蒲公英植物提取物，其中步骤a中的溶剂为醇水混合溶剂，其中醇是甲醇、乙醇、乙二醇或者它们的混合物；步骤b中的柱层析所用介质是硅胶、反相硅胶、大孔树脂、离子交换树脂、氧化铝或葡聚糖凝胶(Sephadex)类；步骤b中的醇溶剂是指乙醇水溶液。3.根据权利要求2的蒲公英植物提取物，其中步骤a中的溶剂是30---75%的乙醇水溶液，提取1一5次，每次用3—10倍量，每次提取0.5—3小时；步骤b中的柱层析所用介质是大孔树脂；歩骤b中的醇溶剂是30—80%的乙醇。4.根据权利要求l一3之一的蒲公英植物提取物，其特征为提取物中酚酸类化合物的含量在20%及以上。5.根据权利要求l一4之一的蒲公英植物提取物，其特征为该提取物中咖啡酸含量在0.3%及以上；木犀草素7-0"(3-D-葡萄糖苷含量在0.5%及以上。6.根据权利要求1一-4之一的蒲公英植物提取物，其特征为该提取物中除含有咖啡酸、阿魏酸和绿原酸外，还含有三个结构相似的双咖啡酰奎尼酸类酚酸化合物活性物质，它们是3,5-0-双咖啡酰基奎尼酸；3，4-0-双咖啡酰基奎尼酸；4,5-0-双咖啡酰基奎尼酸。7.根据权利要求l一6之一的蒲公英植物提取物具有抑制流感病毒的药理学活性。8.根据权利要求l一6之一的蒲公英植物提取物用于制备预防或治疗病毒感染引起的流感及其相关病症药物的用途。9.根据权利要求8的用途所制备得到的一种具有抗流感病毒功能的药物或药物组合物，其特征为含有治疗有效量的权利要求l一6之一的蒲公英植物提取物和可药用载体。10.根据权利要求9的药物或药物组合物，其可以是片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射剂、滴丸、透皮贴剂或气雾剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。全文摘要本发明涉及一种具有预防和治疗流感病毒感染疾病的蒲公英植物提取物及其制备方法和医药用途。本发明的蒲公英植物提取物由蒲公英植物鲜品或干品经醇水提取、柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，提取物中酚类化合物作为有效成分含量在20％以上。本发明得到的蒲公英植物提取物具有明显的抗流感病毒功效，可以用于预防以及治疗病毒感染引起的流感及其相关病症。文档编号A61K9/48GK101112409SQ20061003667公开日2008年1月30日申请日期2006年7月26日优先权日2006年7月26日发明者于荣敏,峰李,昱赵申请人:赵昱;于荣敏;李峰