包括葛根素和山楂叶的药用组合物的制作方法

专利名称：包括葛根素和山楂叶的药用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种主要由葛根素和山楂叶或山楂叶总黄酮制成的药物组合物及其制备方法和用途，属于医药技术领域。
2、背景技术心脑血管疾病是危害人类生命和健康的最主要的疾病，是导致死亡的第一杀手，具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点。据有关调查报告显示，我国每年死于心脑血管疾病的患者有300多万人，占我国每年总死亡人数的50％，而患病幸存下来的75％也不同程度地丧失劳动能力，4％重残。特别是其发病和死亡的年龄日益年轻化，使得如何有效地防治心脑血管疾病成为人们高度关注的问题。又因心脑血管疾病患者的治疗具有重复、持续用药的特点，而化学药物的毒副作用大，易产生抗药性，因此迫切需要研发疗效显著的中药新药。
心脑血管疾病包括冠心病、心绞痛、心肌梗塞、瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑血栓、高血压、高血脂等。这些疾病的主要发病原因是动脉硬化造成管腔狭窄、管道阻塞，从而导致心脑供血不足，引起头沉、头晕、头痛、胸闷等症状，严重者可导致脑中风及心肌梗塞的发生。心脑缺血后影响能量代谢，继发乳酸堆积、钙超载、自由基损伤等多种变化。多靶点逆转或改善这些变化，提高综合疗效是药物治疗的重要目标。
葛根素是由豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根中提取、分离得到的8-β-D-葡萄吡喃糖-4′，7-二羟基异黄酮，已收载入国家药典2005年版二部688页，其中规定含C21H20O9不得少于97.0％。葛根素目前已有多家生产上市。用葛根治疗一般疾病，早在我国古代的医学著作《本经》、《伤寒杂病记》和《医学大辞典》中就有记载。葛根素用于心血管系统具有增加冠脉血流量，改善心肌供应，降低血小板聚集及血液粘度，抗心律失常，降血脂，降血糖等作用，广泛用于冠心病、心绞痛、肺心病、心肌梗死等的治疗。用于脑血管系统具有扩张脑血管，增加脑血流量，改善脑循环等作用，用于脑梗塞、脑缺血、眩晕等的治疗。并且，葛根素毒性小、安全范围广、疗效好，极具临床应用价值。其结构式如下
山楂叶为蔷薇科植物山里红(Crataegus pinnatifida Bge.var.majorN.E.Br)或山楂(Crataegus pinnatifidaBge.)的干燥叶。山楂叶中的黄酮类化合物如芦丁、金丝桃苷、槲皮素、牡荆素等，是其主要的有效成分，具有扩张血管、增加冠脉血流量以及心肌缺血和脑缺血保护等多种药理活性，具有降压、降血脂和强心作用，能改善心脏活力和兴奋中枢神经系统等。大量研究表明，山楂叶总黄酮还具有抗氧化功能，对血管内皮细胞的氧化损伤具有明显的保护作用。研究还表明，黄酮类成分中牡荆素化合物具有良好的抗癌作用。中国药典2005年版一部575～576页，益心酮片项下，有山楂叶提取物的标准。其中规定，山楂叶提取物按干燥品计算，含总黄酮以无水芦丁(C27H30O16)计，不得少于80.0％；含金丝桃苷(C21H20O12)，不得少于0.40％。已有益心酮(山楂叶提取物)原料、片、滴丸、软胶囊上市。
目前，利用葛根素和山楂叶相互作用、配伍组方，用于制备治疗心脑血管疾病的药物，尚未见报道。
3、发明内容为了满足临床需要，扩大用药品种，本发明提供了一种治疗心脑血管疾病的药物组合物及其制备方法和用途，该发明组合物主要由葛根素和山楂叶制成，用于心脑血管疾病的治疗，效果显著。
上述药物组合物，其原料药的重量份数为葛根素40～1000份、山楂叶400～10000份；优选为葛根素100～400份、山楂叶1000～4000份；进一步优选为葛根素200份、山楂叶2000份。
上述药物组合物中的山楂叶可以用适宜的溶剂和方法提取制备得到提取物，提取溶剂优选水和乙醇，提取方法可以为浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法或连续提取法。所得提取物再与葛根素以及药学上可接受的辅料混合制成任一制剂。所得提取物的主要有效成分为山楂叶总黄酮，含量不应低于50％，最好不低于80％。葛根素为上市化学原料药，也可以直接从市场上购买。
本发明提供了一种优选的山楂叶提取工艺，具体如下取山楂叶，烘干粉碎，加60％乙醇回流提取三次，每次1小时，加乙醇8倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至相对密度为1.04～1.06(60℃)的浓缩液，加等量水稀释后，用1/2倍量的石油醚(60～90℃)振摇提取，弃去石油醚液，水层用乙酸乙酯振摇提取，提取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，再加入适量水溶解，加于已处理好的聚酰胺柱(30～60目，乙醇湿法装柱，乙醇适量预洗，再用水洗至无醇味，备用)上，先用2倍柱体积的水洗脱，弃去水洗液，然后分别用3倍柱体积的60％乙醇、75％乙醇、95％乙醇和无水乙醇洗脱，收集各洗脱液，合并，回收乙醇并浓缩至相对密度约1.08～1.12的浓缩液，喷雾干燥，得山楂叶提取物。
通过本工艺制备的山楂叶提取物的得率为2.0～2.5％，山楂叶总黄酮的含量不低于80.0％，金丝桃苷的含量不低于0.40％。
山楂叶除采用上述方法提取外，还可以通过以下方法提取制备，但不仅限于下述方法方法一取山楂叶，烘干粉碎，加70％乙醇回流提取二次，第一次加12倍量乙醇，第二次加10倍量乙醇，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.08～1.12，加3倍药材量的水，静置24小时，抽滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.08，加于已处理好的聚酰胺柱(30～60目，乙醇湿法装柱，乙醇适量预洗，再用水洗至无醇味，备用)上，先用2倍柱体积的水洗脱，弃去水洗液，再用3倍柱体积的75％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，真空干燥，得山楂叶提取物。
通过本工艺制备的山楂叶提取物得率为2.0～3.0％，山楂叶总黄酮含量不低于60.0％，金丝桃苷含量不低于0.30％。
方法二取山楂叶，切碎，加水煮沸提取二次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液用高速离心机离心20min，400rpm。过滤上清液，并加热浓缩(加热温度在70℃左右)至相对密度为1.05～1.08。浓缩液冷却后加入等体积乙醇，放入冰箱内2h后，5000r/min离心30min。过滤，滤液浓缩(加热温度为70℃左右)至无醇味，加于已处理好的大孔树脂柱(D101型，乙醇湿法装柱，乙醇适量预洗，再用水洗至无醇味，备用)上，先用2倍柱体积的水洗脱，弃去水洗液，然后用3倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.04～1.06(60℃)的浓缩液，喷雾干燥，得山楂叶提取物。
通过上述工艺制备的山楂叶提取物得率为2.5～3.5％，总黄酮含量不得少于50.0％，金丝桃苷含量不得少于0.20％。
本发明药物组合物还可以用山楂叶主题代替山楂叶投料制备，根据提取物相对于药材的得率计算，本发明药物组合物的原料重量份数为葛根素40～1000份、山楂叶总黄酮5～300份；优选为葛根素100～400份、山楂叶总黄酮15～120份；进一步优选为葛根素200份、山楂叶总黄酮30～60份。
上述药物组合物中，山楂叶总黄酮中总黄酮的含量不低于50％，最好不低于80％；金丝桃苷的含量不低于0.2％，最好不低于0.4％。
以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减小，如大规模生产可以千克为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间的重量配比不变。以上组成，若以克为单位，可以制成100～1000次用量的制剂，如作为注射剂，可制成1000支，每次用量1～10支。如作为片剂，可制成1000片，每次服用1～10片。
以上重量配比是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，可以相应调整组成的比例，增加或者减少不超过100％。
本发明的另一目的在于提供一种治疗心脑血管疾病的药物组合物，尤其适用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、脑血管病、偏头痛、糖尿病及微血管病变等疾病的治疗，效果显著。
本发明药物组合物可以加一种或多种药学上可接受的载体，以口服或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊、软胶囊、分散片、咀嚼片、口崩片、口服液、颗粒、滴丸、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油悬浮剂等，如水针、冻干粉针、无菌粉针、输液等。本发明药物组合物优选为注射剂和口服制剂。
本发明药物组合物可采用现有制药领域中的常规方法生产，需要的时候可以添加各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明药物组合物在制成口服制剂时，可选择的填充剂有淀粉、糖粉、磷酸钙、硫酸钙二水物、糊精、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、甘露醇等；可选择的黏合剂有羟甲基纤维素钠、PVP-K30、羟丙基纤维素、淀粉浆、甲基纤维素、乙基纤维素、预化淀粉等；可选择的崩解剂有干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、微粉硅胶等。
本发明药物组合物在制成注射剂时，为了增加其溶解度，可以加入聚山梨酯-80等增溶剂。输液中可以加入用于调节渗透压的等渗调节剂，例如，氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇和右旋糖苷等，优选氯化钠或葡萄糖。粉针中可加入赋形剂，例如，甘露醇、葡萄糖等。
本发明药物组合物的优点在于(1)提供了一种新的用于治疗心脑血管疾病的药物组合物，满足了临床急需。
(2)对本发明药物组合物各配比进行了药效学研究，得出了本发明药物组合物的最优配比。
(3)本发明经过药理学研究和药效动物实验研究表明，由葛根素和山楂叶或山楂叶总黄酮制成的药物，可以增加冠脉血流量，增加心肌供血，降低左室舒张末期压，降低心脏前负荷等，明显改善犬血液流动力学；改善脑血管循环，减小脑缺血面积；显著抗血小板聚集；显著减小心肌梗塞范围；对家兔脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。上述实验结果表明，葛根素与山楂叶或山楂叶总黄酮合并用药有协同作用，药效明显增强，其结果是本技术领域的普通人员所意想不到的。
(4)可以葛根素和山楂叶总黄酮为原料直接投料，制备工艺简单，避免了提取时造成的药物损失和由于原药材质量差异造成的不同产品质量差异较大的缺点，使药品纯度更高，杂质少，安全性高，且不同批次药品间质量差异小，药品质量更均匀稳定。
(5)稳定性实验表明本发明药物组合物注射液各项指标均比较稳定，保证了临床用药的安全性。
(6)对葛根素和山楂叶或山楂叶总黄酮的相互作用、配伍组方进行研究，本发明药物组合物的药效优于单独使用葛根素、山楂叶或山楂叶总黄酮的药效，合并用药呈协同作用，可相对减小用药剂量，具有广泛的应用前景。
以下通过实验例来进一步阐述本发明所述药物组合物的有益效果，这些实验例包括本发明药物组合物的药效学实验，葛根素和山楂叶或山楂叶总黄酮的组合物以下简称GS组合物。实验例所用的山楂叶总黄酮均取自于实施例1。
实验例1GS组合物药效学研究受试动物Wistar大鼠，雄性，体重200～220g，110只，随机分为11组，每组10只。
供试品空白对照组氯化钠注射液(山东长富洁晶药业有限公司)模型组葛根素组葛根素注射液(烟台鲁银药业有限公司，2ml0.1g)山楂叶总黄酮组山楂叶总黄酮注射液，自制GS组合物注射液组7个不同配比组(制备方法参见实施例3)，自制实验方法将大鼠随机分为11个组空白对照组、模型组、葛根素组、山楂叶总黄酮组、GS组合物注射液组葛根素+山楂叶总黄酮(100+15、150+30、200+50、250+60、300+80、350+100、400+120)。各药物均以生理盐水稀释至所需浓度，尾静脉注射给药。
大鼠实验性心肌梗死模型动物戊巴比妥腹腔注射麻醉(45mg/kg)仰位固定。气管插管，在胸骨左侧作2cm的纵切口，近胸骨侧剪断第3、第4肋软骨，打开胸腔后，连接人工呼吸机(通气量2ml/100g，50次/min)。剪开心包膜，暴露心脏，冠状动脉左前降支根部穿线以备结扎，记录标准II导联心电图，稳定10分钟，结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔。用针筒吸出动物喉部分泌物，使动物恢复自主呼吸。结扎冠状动脉15min后，静脉给药。结扎冠状动脉4小时后，摘取心脏，在结扎线以下横切5片，进行氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)染色，计算心肌梗死塞区面积占心室及心脏面积的百分比，并进行统计学处理(t检验)。结果见表1。
表1组合物对大鼠实验性心肌梗塞范围的影响(x±s)
注*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比；#p＜0.05，与山楂叶总黄酮组相比；×p＜0.05，与葛根素组相比；&p＜0.05，模型组与空白对照组相比实验结果及结论实验结果见表1。
(1)与空白对照组相比，模型组的心肌梗塞面积明显增加(p＜0.05)，说明造模成功。
(2)与模型组相比，葛根素组和山楂叶总黄酮组心肌梗塞面积明显减小(p＜0.05)，各组合物组心肌梗塞面积均显著减小(p＜0.01)。
(3)与单用葛根素、山楂叶总黄酮组相比，各组合物配比组的抗心肌梗塞作用优于单用山楂叶总黄酮和葛根素(p＜0.05，p＜0.05)。
表明，与单用葛根素、山楂叶总黄酮相比，葛根素和山楂叶总黄酮组成的各配比的组合物均可显著减小心肌梗塞面积，说明两药配伍有协同增效作用，且作用效果与配比相关，在配比为200±50时，效果最好。
实验例2GS组合物抗血小板聚集作用受试动物Wistar大鼠，雄性，体重200～220g，60只，随机分为6组，每组10只。
供试品空白对照组氯化钠注射液(山东长富洁晶药业有限公司)葛根素组葛根素注射液(烟台鲁银药业有限公司，2ml0.1g)山楂叶总黄酮组山楂叶总黄酮注射液，自制GS组合物注射液组自制(处方和制备方法参见实施例3)，分为高、中、低三个剂量组实验方法将大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组，葛根素组，山楂叶总黄酮组，GS组合物注射液高、中、低剂量组。各组动物腹腔注射给药，每日一次，连续给药7天，末次给药后1小时，动物麻醉后自腹主动脉取血，抗凝剂采用3.28％枸橼酸钠，与血液以1∶9比例混合。将抗凝全血在20℃条件下1500r·min-1离心5min获得富血小板血浆(PPR)。留取定量PPR后，将剩余PPR再次以3000r·min-1离心10min，获得自身对照贫血小板血浆(PPP)。以PPP调节PPR浓度，使各PPR浓度相同。将PPR在37℃的恒温孔中预热后，加入ADP(终浓度为3μmol·L-1)引起血小板聚集，记录最大聚集率。结果见表2。
表2抗血小板聚集作用(X±SD)
注*p＜0.05，**p＜0.01，与空白对照组相比；#p＜0.05，与山楂叶总黄酮组相比；×p＜0.05，与葛根素组相比实验结果及结论实验结果见表2。
(1)与空白对照组相比，葛根素组和山楂叶总黄酮组血小板最大聚集率均明显降低(p＜0.05)，组合物各剂量组血小板最大聚集率显著降低(p＜0.01)。
(2)与单用葛根素、山楂叶总黄酮组相比，组合物各剂量组的血小板最大聚集率明显降低(p＜0.05，p＜0.05)。
表明，与单用葛根素或山楂叶总黄酮相比，组合物各剂量组均都能明显抑制血小板聚集，表明山楂叶总黄酮与葛根素配伍有很好协同作用，且作用效果与给药剂量有关，高剂量时效果最好。
实验例3GS组合物注射液静脉给药对麻醉开胸犬血流动力学的影响受试动物杂种犬，30只，体重在11.0～13.0公斤，每组5只。
供试品空白对照组氯化钠注射液(山东长富洁晶药业有限公司)葛根素组葛根素注射液(烟台鲁银药业有限公司，2ml0.1g)山楂叶总黄酮组山楂叶总黄酮注射液，自制GS组合物注射液组自制(处方和制备方法参见实施例3)，分为高、中、低三个剂量组给药剂量空白对照组、葛根素组、山楂叶总黄酮组、GS组合物注射液高剂量组为20mg/kg，GS组合物注射液中剂量组为15mg/kg，GS组合物注射液低剂量组为10mg/kg。
实验方法取30只杂种犬，体重在11.0～13.0公斤，每组5只，雌雄兼用，随机分为6组，分别为空白对照组，葛根素组，山楂叶总黄酮组，GS组合物注射液高、中、低剂量组。各给药组在给药前用0.9％生理盐水配制所需浓度药液。
犬用3％戊巴比妥钠1ml/kg前肢静脉注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，剪去颈部、胸部和右后肢内侧的毛。75％乙醇消毒剪毛区。分离气管，并插入气管插管，备人工呼吸用；分离颈外静脉，并从颈外静脉插管经上腔静脉进入右心房并达到心房窦处，用于抽取冠状静脉的血液；分离股静脉，插入静脉插管，整个实验过程中缓慢恒速注入10％葡萄糖。分离股动脉，插入动脉插管(管内充满25U/ml的肝素钠生理盐水)，接通TP-400T型压力换能器，由AP-641G型血压放大器记录血压(收缩压SAP，舒张压DAP，平均动脉压MAP)。人工呼吸下，于第4肋间开胸，剪开心包膜，分离升主动脉根部和左冠状动脉前降支，分别放置适宜内径的电磁血流量计探头(13，2mm)测量心输出量(CO)和冠状动脉血流量(CBF)。将左心室插管(管内充满25U/ml的肝素生理盐水)经左心室心尖部插入左心室内，通过TP-400T型压力换能器，由AP-641G型血压放大器记录左室内压(LVP)，通过AD-601G型放大器记录左室舒张末期压(LVEDP)将针状电极插入犬四肢皮下，描记标准II导联心电图(ECG)。上述测量信号均输入RM-6000型八道生理记录仪记录，描记。同时将心输出量、心电、血压及心室内压的电信号输入微机的生物医学生理信号处理系统进行处理，并由微机读出心室内压峰值(LVSP)、舒张末期压(LVEDP)、心室收缩参数(+dp/dtmax)、心室舒张参数(-dp/dtmax)。最后，计算心指数(CI)、每搏输出量(SV)、心搏指数(SI)、每搏功指数(SWI)、血管总外周阻力等参数(TPVR)。手术完成后稳定20min，将药物溶于100ml生理盐水中，15min内经股静脉恒速滴入。
在给药前、给药后1h、2h分别抽取左心室及冠状静脉血，肝素抗凝，注射于i-STAT G3+Cartridges(i-STAT公司G3+型测试片)中，通过血气分析仪测量动、静脉血氧分压。心肌耗氧量由Kanter公式计算而来，其公式是MVO2＝3.25×10×CF(PaO2-PvO2)/Wt。MVO2是指每100g左室心肌的耗氧量，CF为冠脉流量，PaO2、PvO2分别表示动、静脉血氧分压，Wt是左心室肌重。
所有数据均以平均值±标准偏差表示，根据用药前后各组中各个指标的变化，采用配对t-检验来判断用药前后各种指标改变的统计学意义。
实验结果(1)对麻醉犬总外周血管阻力的影响与空白对照组比较，各剂量GS组合物注射液组均能显著降低麻醉犬总外周血管阻力(p＜0.01)，葛根素组能明显降低麻醉犬总外周血管阻力(p＜0.05)，山楂叶总黄酮组的作用较葛根素注射液组低；与单用山楂叶总黄酮、葛根素组相比，各剂量GS组合物注射液组均能明显降低麻醉犬总外周血管阻力(p＜0.05)。
(2)对麻醉犬左室舒张末期压的影响与空白对照组比较，各剂量GS组合物注射液组均能显著降低麻醉犬左室舒张末期压(p＜0.01)，山楂叶总黄酮组以及葛根素注射液组均能明显降低麻醉犬左室舒张末期压(p＜0.05)；与单用山楂叶总黄酮、葛根素组相比，各剂量GS组合物注射液组均能明显降低麻醉犬左室舒张末期压(p＜0.05)。
(3)对麻醉犬冠状动脉血流量的影响与空白对照组比较，各剂量GS组合物注射液组均能显著增加麻醉犬冠状动脉血流量(p＜0.01)，山楂叶总黄酮组以及葛根素注射液组均能明显增加麻醉犬冠状动脉血流量(p＜0.05)；与单用山楂叶总黄酮、葛根素组相比，各剂量GS组合物注射液组均能明显增加麻醉犬冠状动脉血流量(p＜0.05)。
(4)对麻醉犬心室收缩参数的影响与空白对照组比较，各剂量GS组合物注射液组均能显著增加麻醉犬心室收缩参数(p＜0.01)，山楂叶总黄酮组以及葛根素注射液组均能明显增加麻醉犬心室收缩参数(p＜0.05)；与单用山楂叶总黄酮、葛根素组相比，各剂量GS组合物注射液组均能明显增加麻醉犬心室收缩参数(p＜0.05)。
(5)对麻醉犬心室舒张参数的影响与空白对照组比较，各剂量GS组合物注射液组均能显著增加麻醉犬心室舒张参数(p＜0.01)，山楂叶总黄酮组以及葛根素注射液组均能明显增加麻醉犬心室舒张参数(p＜0.05)；与单用山楂叶总黄酮、葛根素组相比，各剂量GS组合物注射液组均能明显增加麻醉犬心室舒张参数(p＜0.05)。
(6)对麻醉犬心输出量、每搏输出量、心指数以及心搏指数的影响与空白对照组比较，各剂量GS组合物注射液组均能显著增加麻醉犬的心输出量、每搏输出量、心指数、心搏指数(p＜0.01)，山楂叶总黄酮组以及葛根素注射液组均能明显增加麻醉犬的心输出量、每搏输出量、心指数、心搏指数(p＜0.05)；与单用山楂叶总黄酮、葛根素组相比，各剂量GS组合物注射液组均能明显增加麻醉犬的心输出量、每搏输出量、心指数、心搏指数(p＜0.05)。
结论山楂叶总黄酮和葛根素合并用药可通过增加冠状动脉血流量，使心肌的供血增加，降低左室舒张末期压，使血液易于从心外膜向心内膜下区域流动，对冠状动脉血流量进行重新分配；能明显降低心脏前负荷，对后负荷无明显影响；能显著改善心脏的泵血功能；能明显改善心脏的收缩和舒张功能。山楂叶总黄酮和葛根素合并用药的效果优于单用山楂叶总黄酮或葛根素，提示两药有协同增效作用。
实验例4GS组合物对实验性犬脑缺血的影响受试动物杂种犬，30只，体重在11.0～13.0kg，随机分为6组，每组5只。
供试品空白对照组氯化钠注射液(山东长富洁晶药业有限公司)葛根素组葛根素注射液(烟台鲁银药业有限公司，2ml0.1g)山楂叶总黄酮组山楂叶总黄酮注射液，自制GS组合物注射液组自制(处方和制备方法参见实施例3)，分为高、中、低三个剂量组实验方法取30只杂种犬，体重在11.0～13.0公斤，每组5只，雌雄兼用，随机分为6组，分别为空白对照组，葛根素组，山楂叶总黄酮组，GS组合物注射液高、中、低剂量组。各药物均以生理盐水稀释至所需浓度，静脉注射给药。
犬大脑中动脉结扎所致脑缺血模型的制作取犬腹腔注射3％戊巴比妥钠1.0ml/kg(30mg/kg)麻醉，固定犬于手术台上，然后在犬右外眼角与右耳根部1/2处(中点)，用电刀切开皮肤，分离肌肉，用手术专用颅骨钻钻开颅骨，以咬骨钳扩大颅骨孔，切开硬脑膜，找到大脑中动脉。先用多谱勒超声血流探测仪测定大脑中动脉血流速度，然后立即将大脑中动脉结扎造成脑缺血。大脑中动脉结扎6小时后，分离双侧颈总动脉并夹闭之，即刻从右侧颈总动脉夹闭处的远心端灌注20ml龙胆紫饱和溶液对脑组织进行染色，然后处死动物，开颅取出脑组织，称全脑重，遂切下未染色的脑组织(即缺血区脑组织)称重，求出其占全脑重量的百分率，并进行病理组织学检查，以判断其是否属于脑缺血性损伤，结果见表3。
表3组合物对实验性犬脑缺血的影响(X±SD)
注*p＜0.05，**p＜0.01，与空白对照组相比；#p＜0.05，与山楂叶总黄酮组相比；×p＜0.05，与葛根素组相比实验结果及结论实验结果见表3。
(1)与空白对照组相比，葛根素组和山楂叶总黄酮组脑缺血区均明显减小(P＜0.05)，组合物各剂量组脑缺血区显著降低(P＜0.01)。
(2)与单用葛根素、山楂叶总黄酮组相比，组合物各剂量组的脑缺血区域明显降低(p＜0.05，P＜0.05)。
表明，与单用葛根素或山楂叶总黄酮相比，GS组合物注射液的作用强于单用山楂叶总黄酮或葛根素(P＜0.05)，表明山楂叶总黄酮与葛根素配伍的组合物有很好的抗脑缺血作用。
实验例5GS组合物对家兔脑缺血灌注损伤的保护作用受试动物家兔，78只，雌雄兼用，体重2.4～2.8kg，随机分为缺血再灌注组(18只)、GS组合物注射液治疗组(18只)、山楂叶总黄酮治疗组(18只)、葛根素注射液治疗组(18只)和假手术对照组(6只)。
供试品生理盐水氯化钠注射液(山东长富洁晶药业有限公司)山楂叶总黄酮组山楂叶总黄酮注射液，自制葛根素组葛根素注射液，自制GS组合物注射液组自制，(处方和制备方法参见实施例3)供试液的配制所有供试品均配成20mg/ml的供试液给药剂量空白对照组、葛根素组、山楂叶总黄酮组、GS组合物注射液高剂量组为20mg/kg，GS组合物注射液中剂量组为15mg/kg，GS组合物注射液低剂量组为10mg/kg。
实验方法(1)缺血再灌注组18只，用25％的氨基甲酸乙脂溶液1g/kg耳缘静脉麻醉，颈部正中切口分离气管插入气管套管，暴露两侧颈总动脉，夹闭两侧动脉20min，造成脑缺血，分别再灌注1、6和12h，3个时间点各6只。松夹10min后，耳缘静脉推注生理盐水5ml/kg。(2)GS组合物注射液治疗组每一GS组合物注射液剂量组18只，手术方法同缺血再灌注组，3个时间点各6只。松夹10min后，耳缘静脉推注GS组合物注射液20mg/kg。(3)山楂叶总黄酮治疗组18只，手术方法同缺血再灌注组，3个时间点各6只。松夹10min后，耳缘静脉推注山楂叶总黄酮供试液20mg/kg。(4)葛根素注射液治疗组18只，手术方法同缺血再灌注组，3个时间点各6只。松夹10min后，耳缘静脉推注葛根素注射液20mg/kg。(5)假手术对照组6只，仅行麻醉和动脉分离术而不夹闭，1h后处死。上述各组实验结束后即断头，在冰浴中剥出大脑，冰盘上解剖出双侧海马区组织，用锡纸包裹放在4℃冰箱中储存，备测磷脂酶A2(PLA2)；切取皮层组织测脑梗死面积、脑含水量，选取大脑中动脉供血区的额顶区组织标本进行病理学观察。所有计量资料数据均采用平均值±标准偏差表示，组间比较采用t检验。
实验结果(1)对海马组织PLA2活性的影响缺血再灌注组再灌注1h、6h和12h后，PLA2活性较假手术对照组明显增高(p＜0.01)，且随灌注时间延长，PLA2活性呈递减趋势，但各时间点间比较差异不显著(p＞0.05)；GS组合物注射液治疗组(1h、6h、12h)PLA2活性明显降低，与假手术对照组和缺血再灌注组各相应时间点比较具有显著性差异(p＜0.01)，且随再灌时间延长，PLA2活性逐渐恢复正常水平；山楂叶总黄酮治疗组和葛根素注射液治疗组(1h、6h、12h)PLA2活性降低，与假手术对照组和缺血再灌注组各相应时间点比较具有明显差异(p＜0.05)，山楂叶总黄酮的作用低于葛根素注射液。
(2)对皮层组织含水量(％)和梗死面积(％)的影响缺血再灌注组各时间点脑含水量均增高；GS组合物注射液治疗组各时间点脑水含量与缺血再灌注组相比明显减轻(p＜0.001)，脑梗死面积与缺血再灌注组相比明显缩小(p＜0.01)；山楂叶总黄酮治疗组和葛根素注射液治疗组各时间点脑水含量与缺血再灌注组相比明显降低(p＜0.01)，脑梗死面积与缺血再灌注组相比明显缩小(p＜0.05，p＜0.01)。
(3)脑组织病理改变假手术对照组无梗死状，神经元结构形态正常，无间质水肿；缺血再灌注组有梗死状，梗死状周神经元肿胀，细胞轮廓不清，间质水肿明显；GS组合物注射液治疗组、山楂叶总黄酮治疗组、葛根素注射液治疗组梗死状面积均缩小，梗死状周神经元肿胀不明显，间质水肿明显减轻；GS组合物注射液治疗组作用更明显。
结论上述实验结果表明，脑缺血再灌注后，GS组合物注射液、山楂叶总黄酮、葛根素注射液均可降低海马组织PLA2活性，改善脑缺血所致内环境紊乱，减轻脑水肿，减小脑梗死面积；说明GS组合物、山楂叶总黄酮、葛根素均具有清除自由基，快速切断自由基连锁反应，抑制脂质过氧化，减轻迟发性脑损伤等脑组织保护作用。GS组合物注射液在各项指标中效果均优于山楂叶总黄酮和葛根素注射液单独用药的效果，提示，两药具有协同增效作用。
实验例6GS组合物注射液小鼠注射给药急性毒性实验(1)实验方法供试品GS组合物注射液组自制(处方和制备方法参见实施例3，2ml含山楂叶总黄酮47.6mg、含葛根素200mg)受试动物小鼠，每组雌雄各60只，雄性体重25～28g，雌性体重21～24g给药途径静脉注射、腹腔注射。
观察专案死亡数、一般状态、体重、剖检、半数致死剂量。
(2)实验结果按照急性毒性实验要求进行预试，腹腔注射及静脉注射两种给药途径皆无法测出药物的半数致死量，也未见明显的毒性反应，故进行日最大给药量实验。给药剂量尾静脉注射0.1ml/10g，腹腔注射0.1ml/10g，一日1次。
死亡数未出现死亡。
一般状态未见异常变化。
体重于给药前1天，给药日，给药后2、4、6、8、10、12、14天测量；未见异常变化。
剖检心、肝、肺、肾等组织未见异常变化。
(3)结论本实验中未出现死亡，GS注射液对雌雄小鼠静脉和腹腔注射给药的最大耐受量为0.1ml/10g，相当于60kg体重人日最大用量6ml的100倍。表明本品低毒，安全性高。
实验例7GS组合物注射液稳定性实验样品GS组合物注射液(处方和制备方法参见实施例3)考察项目性状、pH值、澄明度、含量、有关物质长期稳定性实验方法及结果将本品置温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下放置6个月、12个月，各项指标均无明显变化，实验结果表明组合物注射液长期放置基本稳定。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料代替，或者减少、增加。实施例2～9所用的山楂叶总黄酮均取自于实施例1。
实施例1山楂叶总黄酮的制备取山楂叶，烘干粉碎，加60％乙醇回流提取三次，每次1小时，加乙醇8倍量，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至相对密度为1.04～1.06(60℃)的浓缩液，加等量水稀释后，用1/2倍量的石油醚(60～90℃)振摇提取，弃去石油醚液，水层用乙酸乙酯振摇提取，提取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，再加入适量水溶解，加于已处理好的聚酰胺柱(30～60目，乙醇湿法装柱，乙醇适量预洗，再用水洗至无醇味，备用)上，先用2倍柱体积的水洗脱，弃去水洗液，然后分别用3倍柱体积的60％乙醇、75％乙醇、95％乙醇和无水乙醇洗脱，收集各洗脱液，合并，回收乙醇并浓缩至相对密度约1.08～1.12的浓缩液，喷雾干燥，得山楂叶总黄酮。
山楂叶总黄酮的鉴别实验取山楂叶总黄酮研细，取0.1g，加乙醇5ml，摇匀，超声处理5分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品、金丝桃苷对照品，分别加乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法实验，吸取上述三种溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-丙醇-水(7∶5∶6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，吹干，放置1小时后，置紫外光灯下(365nm)下，检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
山楂叶总黄酮的含量测定标准溶液的制备精密称取芦丁对照品200mg，置于100ml容量瓶中，加入乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取此溶液10ml置100ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀即得(每1ml含无水芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备精密吸取标准溶液0.01、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml分别置25ml容量瓶中，各加乙醇至6ml，加10％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.0ml，放置6min，加氢氧化钠试液10.0ml，最后用乙醇稀释至刻度。摇匀，以第1瓶为空白，照紫外分光光度法，在510nm处测定吸收度。
供试品的制备精密称定提取物1.0g，置索氏提取器中，加乙醇回流至无色，提取液于蒸发皿中，水浴浓缩至干，用50ml热水溶解并转移至分液漏斗中，加入水饱和正丁醇液萃取3次，每次10ml，合并萃取液于蒸发皿中，水浴蒸干，再加乙醇使溶解，并滤入50ml容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。精密吸取5ml于25ml容量瓶中。加乙醇至刻度，摇匀，即得。
测定法按标准曲线的制备操作测定供试品溶液的吸收度，带入回归方程，计算，即得。
山楂叶总黄酮中金丝桃苷的含量测定色谱条件及系统适应性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-水-甲酸(55∶45∶400∶1.5)为流动相；检测波长为255nm；柱温为25℃；流速为1ml/min。
对照品溶液的制备精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24h的金丝桃苷对照品适量，加甲醇制成每1ml中含20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取山楂叶总黄酮约0.4g，精密称定，加入70％丙酮溶液超声提取，共3次，每次使用溶液30ml，超声10min，滤过，最后使用少量70％丙酮溶液反复洗涤3～4次，合并滤液，水浴挥干，残渣加甲醇溶解，并稀释成50ml，摇匀，过微孔滤膜，得供试品。
测定法分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
按照上述方法制备三批山楂叶总黄酮，总黄酮的含量和得率见表4。从结果可以看出，通过本工艺得到的山楂叶总黄酮的得率为2.0～2.5％，总黄酮含量不低于80％，金丝桃苷含量不低于0.4％。
表4山楂叶提取物的含量测定结果和得率
实施例2GS组合物粉针剂的制备处方山楂叶总黄酮47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素 200g聚山梨酯80 80g甘露醇 300g山梨醇 50g无菌注射用水加至3000ml共制备 1000支制备工艺(1)首先将配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，胶塞等进行无菌处理。
(2)按照处方量称取原辅料。
(3)将山楂叶总黄酮加入配液量30％无菌注射用水中加热溶解完全。甘露醇、山梨醇加配液量30％的无菌注射用水加热搅拌溶解完全，聚山梨酯80加20％的无菌注射用水后制成水溶液加入葛根素加热溶解，合并上述溶液，补加无菌注射用水至全量。
(4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
(5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
(6)经0.45μm的微孔滤膜精滤。
(7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
(8)分装于抗生素玻璃瓶中，半压塞。将样品放入冻干机中冷冻干燥。预冻-45℃5小时，低温真空干燥-45℃～0℃20小时，然后升温至25℃真空干燥3小时。
(9)冻干结束，压塞，轧盖。
(10)成品全检，包装入库。
实施例3GS组合物水针剂的制备处方山楂叶总黄酮47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素 200g聚乙二醇400 200ml乙醇200ml注射用水加至2000ml共制备 1000支制备工艺(1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
(2)将乙醇与等量的水混合，加入山楂叶总黄酮使溶解；将聚乙二醇400用50％的水溶解，再加入葛根素搅拌溶解。
(3)合并上述两溶液，补加注射用水至全量。
(4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
(5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
(6)经0.45μm的微孔滤膜精滤。
(7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
(8)将溶液熔封于玻璃安瓿中。
(9)100℃流通蒸汽灭菌30分钟。
(10)趁热将样品放入0.01％的亚甲蓝溶液中检漏。
(11)灯检，成品全检，包装入库。
实施例4GS组合物氯化钠输液的制备处方山楂叶总黄酮47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素 200g聚山梨酯80 100g氯化钠 900g注射用水加至100000ml共制备 1000瓶制备工艺(1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
(2)将山楂叶总黄酮加入配液量20％注射用水加热搅拌溶解完全，将氯化钠用配液量20％的注射用水溶解完全。聚山梨酯80加20％的无菌注射用水后制成水溶液加入葛根素加热溶解。
(3)合并上述溶液，补加注射用水至全量。
(4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
(5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
(6)经0.45μm的微孔滤膜精滤。
(7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
(8)灌装于100ml的输液瓶中。
(9)115℃热压灭菌30分钟。
(10)灯检，成品全检，包装入库。
实施例5GS组合物葡萄糖输液的制备处方山楂叶总黄酮 47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素200g聚山梨酯8050g葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml共制备1000瓶制备工艺(1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
(2)将山楂叶总黄酮加入配液量20％注射用水中加热搅拌溶解完全，将葡萄糖用配液量20％的注射用水溶解完全，加热煮沸15分钟。聚山梨酯80加20％的无菌注射用水后制成水溶液加入葛根素加热溶解。
(3)合并上述溶液，补加注射用水至全量。
(4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
(5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
(6)经0.45μm的微孔滤膜精滤。
(7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
(8)灌装于100ml的输液瓶中。
(9)115℃热压灭菌30分钟。
(10)灯检，成品全检，包装入库。
实施例6GS组合物片剂的制备处方山楂叶总黄酮47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素 200g预胶化淀粉 120.0g微晶纤维素 40.0g低取代羟丙纤维素40g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁6.0g羧甲淀粉钠 12.0g共制备 1000片制备工艺(1)将葛根素和山楂叶总黄酮粉碎过100目筛备用。
(2)按照处方量称取原辅料。
(3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用。
(4)将山楂叶总黄酮、葛根素、预胶化淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素混合均匀，加入2％HPMC水溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。
(5)过20目筛制颗粒。
(6)颗粒在60℃的条件下烘干。
(7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁和羧甲淀粉钠，过18目筛整粒，混合均匀。
(8)取样，半成品化验。
(9)按照化验确定的片重压片。
(10)成品全检，包装入库。
实施例7GS组合物胶囊剂的制备处方山楂叶总黄酮 47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素200g预胶化淀粉120.0g微晶纤维素50.0g低取代羟丙纤维素 30g2％HPMC水溶液 适量硬脂酸镁 6.0g共制备1000粒制备工艺(1)将葛根素和山楂叶总黄酮粉碎过100目筛备用。
(2)按照处方量称取原辅料。
(3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用。
(4)将山楂叶总黄酮、葛根素、预胶化淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素混合均匀，加入2％HPMC水溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。
(5)过20目筛制颗粒。
(6)颗粒在60℃的条件下烘干。
(7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁，过18目筛整粒，混合均匀。
(8)取样，半成品化验。
(9)按照化验确定的装量装入胶囊。
(10)成品全检，包装入库。
实施例8GS组合物颗粒剂的制备处方山楂叶总黄酮 47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素200g糖粉 2000.0g甜菊素15g柠檬香精 适量2％HPMC50％乙醇溶液 适量共制备1000包制备工艺(1)将蔗糖粉碎过80目筛备用；将葛根素和山楂叶总黄酮粉碎过100目筛备用。
(2)按照处方量称取原辅料。
(3)将葛根素、山楂叶总黄酮与糖粉、甜菊素以等量递加的方法混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材，(4)过20目筛制颗粒。
(5)颗粒在60℃的条件下烘干。
(6)干颗粒过18目筛整粒，喷入适量柠檬香精。
(7)取样，半成品化验颗粒中主药的含量，确定装量。
(8)包装，成品全检，包装入库。
实施例9GS组合物口服液的制备处方山楂叶总黄酮 47.6g(相当于山楂叶约2000g)葛根素200g丙二醇1000ml苯甲酸钠 15g甜菊甙10g纯化水加至10000ml共制备1000支制备工艺(1)将山楂叶总黄酮加入配液量50％的纯化水中加热搅拌溶解完全；葛根素加入丙二醇加热搅拌溶解完全。
(2)将苯甲酸钠和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全。
(3)合并上述溶液，补加纯化水至全量。
(4)过0.8μm的微孔滤膜过滤。
(5)半成品化验。
(6)灌装。成品全检，包装入库。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物主要由下列重量份的原料药制成葛根素40～1000份、山楂叶400～10000份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物主要由下列重量份的原料药制成葛根素100～400份、山楂叶1000～4000份。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物主要由以下重量份的原料药制成葛根素200份、山楂叶2000份。
4.根据权利要求1～3所述的任一药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的山楂叶可以用适宜的溶剂和方法提取制备得到提取物，提取物再与葛根素以及药学上可接收的辅料混合制成任一制剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所得提取物的主要有效成分为山楂叶总黄酮，主要有效成分的含量不低于50％。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物也可以由下列重量份的原料药制成葛根素40～1000份、山楂叶总黄酮5～300份。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物可以由下列重量份的原料药制成葛根素100～400份、山楂叶总黄酮15～120份。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物可以由下列重量份的原料药制成葛根素200份、山楂叶总黄酮30～60份。
9.根据权利要求6～8所述的任一药物组合物，其特征在于，山楂叶总黄酮中总黄酮的含量不低于50％，金丝桃苷的含量不低于0.2％。
10.根据权利要求1～3、6～8所述的任一药物组合物，其特征在于，该药物组合物可以与药学上可接受的辅料混合制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开了一种治疗心脑血管疾病的药物组合物及其制备方法和用途。该组合物主要由葛根素和山楂叶或山楂叶总黄酮制成，其中葛根素40～1000份、山楂叶400～10000份或山楂叶总黄酮5～300份。该组合物可制成临床或药学上可接受的任一剂型，优选注射剂或口服制剂。该药物组合物可用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、脑血管病、偏头痛、糖尿病及微血管病变等疾病，效果显著。
文档编号A61P3/06GK101049356SQ20061004350
公开日2007年10月10日 申请日期2006年4月7日 优先权日2006年4月7日
发明者黄振华 申请人:黄振华