专利名称：含有由氨基和苯基取代的环烷基和5元杂环的1-磷酸鞘氨醇激动剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为受体激动剂对一种或多种S1P受体(特别是S1P1、S1P4和S1P5受体类型)具有活性的1-磷酸鞘氨醇(S1P)类似物。本发明化合物包括具有磷酸根部分的化合物和具有抗水解的磷酸根替代物例如膦酸根、α-取代的膦酸根(特别当所述α-取代基为卤素的情况下)以及硫代磷酸根的化合物。
在S1P受体激动剂或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，其具有下式(IIA)的一般结构
其中，n为0、1、2或3；X选自羟基(-OH)、磷酸根(-OPO3H2)、膦酸根(-CH2PO3H2)、α-取代的膦酸根(包括-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2、-C＝OPO3H2)， 其中R1选自氢、卤素(其中F或C1为优选的卤素)、(C1-C6)烷基组成的组，例如甲基、乙基和丙基，或卤素、羟基、烷氧基、氰基取代的(C1-C6)烷基，例如三氟甲基。
R2基团选自烷基、烯基、炔基、烷基取代的芳基、烷基取代的环烷基、芳烷基和芳烷基取代的芳基组成的组。在R2中，5-8个碳原子的链长度为优选。
本发明还提供了式(II)的任何化合物的酯，例如磷酸酯，其中可添加酯官能度以形成增加口服利用度的前药。
在一优选的实施方案中，具有式(II)的所述化合物可具有选自以下组的R1H、卤素(优选F或Cl)、甲基、三氟甲基、乙基、丙基或其他低级烷基(C1-C6)，或卤素、羟基、烷氧基、氰基取代的低级烷基；且R2选自烷基、烯基、炔基、烷基(任选取代的芳基)、烷基(任选取代的环烷基)、芳烷基以及优选具有5-8个碳原子长度的芳烷基(任选取代的芳基)组成的组。
S1P受体拮抗剂前药(优选S1P1受体类型选择性拮抗剂)的潜在用途包括，但不限于 改变淋巴细胞运输，作为下述自身免疫性疾病的治疗方法例如眼葡萄膜炎、I型糖尿病、类风湿性关节炎、炎性肠病，以及更特别地多发性硬化症。多发性硬化症的“治疗”包括该疾病的多种形式，包括复发缓解型、慢性进展型等，且S1P受体拮抗剂可单独使用或联合缓解该疾病的体征和症状的其他制剂使用以及预防性使用。
另外，本发明化合物可用于改变淋巴细胞运输，所述改变淋巴细胞运输是一种延长同种异体移植物存活时间的方法，例如用于实质器官移植、移植物抗宿主疾病的治疗、骨髓移植等。
另外，本发明化合物可用于抑制自分泌运动因子(autotaxin)。自分泌运动因子——一种血清磷酸二酯酶，已经被证明可进行终产物抑制。自分泌运动因子水解几种底物产生溶血磷脂酸和1-磷酸鞘氨醇，且涉及癌症进展和血管发生。因此，S1P受体激动剂前药例如VPC01091可用于抑制自分泌运动因子。该活性可与对S1P受体的激动联合或不依赖于该活性。
另外，本发明化合物可用于抑制S1P裂解酶。S1P裂解酶是不可逆性降解S1P的细胞内酶。S1P裂解酶的抑制破坏淋巴细胞运输，并伴有淋巴细胞减少。因此，S1P裂解酶抑制剂可用于调节免疫系统功能。因此，前药例如VPC01091可用于抑制S1P裂解酶。该抑制作用可与S1P受体活性一致，或可不依赖于对任何S1P受体的活性。
多发性硬化症的“治疗”包括该疾病的多种形式，包括复发缓解型、慢性进展型等，且S1P受体激动剂可单独使用或联合缓解该疾病的体征和症状的其他制剂使用以及预防性使用。
本发明还包括含有本发明化合物的药物组合物。更具体地，所述化合物可使用本领域技术人员已知的标准的药学上可接受的载体、填充剂、增溶剂和稳定剂配制成药物组合物。例如，如本文所描述的含有本发明化合物或其类似物、衍生物或改性物的组合物用于将合适的所述化合物给药于受治疗者。
本发明化合物可用于治疗疾病或病症，包括给具有相应需要的受治疗者给予治疗可接受量的式(I)的化合物，或含有治疗有效量的式(I)的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
低级烷基的具体取值是乙基或丙基。
卤素的具体取值是氟或氯。
X的具体取值是羟基或OPO3H2。
α-取代的膦酸根包括-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2、-C＝OPO3H2或硫代磷酸酯根(OPO2SH2)。
R1的具体取值为氢。
R2的具体取值为具有5-8个碳原子长度的烷基。
R2的更具体的取值为庚基、辛基、壬基、-O-庚基、-C(＝O)庚基或CH3-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-。
R2中烷基的更具体的取值为辛基或-O-庚基。
R2中烷基的更具体的取值为辛基。
n的具体取值为1或2。
具有双键的具体环烷基包括
本发明具体化合物具有位于环烷基环对位的R2基团。
本发明具体化合物具有位于R2邻位或间位的R1基团。
本发明具体化合物具有位于苄基环烷基的对位(即1，4)的R2基团。
本发明化合物的酯的非限制性实例包括其中X基团为下述基团的化合物
其中Y选自O、CH2、CHOH、CHF、CF2和
成的组；以及 R9和R10独立地选自烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基，
O-R11，
以及
组成的组； 其中，R11选自C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基以及任选取代的芳基组成的组。特别优选的R9和R10为烷氧基，
以及
在
图1中的流程中提供了制备VPC01091和VPC01211的合成途径。本领域技术人员可使用已知的对所述流程的操作方法和本文具体实施例中的详细说明改进的技术来制备式(I)或式(II)的其他化合物。
本发明式(II)的具体化合物为VPC01091，其中X为OH，R1为氢，R2为辛基(C8H17)，n为2，且R2基团在苯环的对位。该式为
本发明式(II)的具体化合物为VPC02162，其中X为OH，R1为氢，R2为辛基(C8H17)，n为2，且R2基团在苯环的间位，该式为
本发明还包括下列异构体
以及
这些化合物可以配制为混合物并通过色谱方法分离。分离的合适条件如下柱Chiralpak AD 4.6 mmID x 250mm；流动相Hex/EtOH/MeOH/DEA＝95/2.5/2.5/0.03；流速1mL/min；检测器UV 220nm；柱温40℃；或柱温25℃。分离之后，发现两种异构体在体外未被SPHK2酶磷酸化。然而，当测试之前磷酸化时，发现磷酸化的化合物为S1P受体的有效激动剂。
本发明式(II)的另一具体化合物为VPC01211，其中X为OPO3H2，R1为氢，R2为辛基(C8H17)，n为2，且R2基团在苯环的对位，该式为
本发明式(II)的另一具体化合物为VPC02164，其中X为OPO3H2，R1为氢，R2为辛基(C8H17)，n为2，且R2基团在苯环的间位，该式为
在环烷基环中包括杂原子(例如N、S、O)和/或双键的本发明化合物的其他实例包括以下结构
或
具有通式(III)的式(I)或式(II)的其他化合物在下文描述。具体的变化形式在表1中描述
表1 本发明还提供了式(I)或式(II)的化合物的酯，其中所述酯的形成可将所述化合物转化为增强给药的前药，例如增加口服利用度。另外，本发明还提供了式(I)或式(II)的化合物的药学上可接受的盐。另外，本发明提供了式(I)或式(II)所述的结构的所有可能的异构体，注意当n为1时(环丁烷基)，所述化合物为对称的，并缺少手性中心，但存在顺式和反式形式。
含有本发明一种或多种化合物的药物组合物可通过任何数目的途径和方法给药于需要相应治疗的受治疗者，所述途径和方法包括，但不限于局部、口服、口腔、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮肤、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道、眼、肺或直肠途径。口服途径通常应用于需要本发明化合物的大多数情况中。优选静脉内注射或输注给药用于急性治疗。对于维持方案，口服或胃肠外，例如肌肉内或皮下途径为优选。
根据一个实施方案，提供了含有本发明化合物或其类似物、衍生物或改性形式和白蛋白的组合物，更特别地，所述组合物含有本发明化合物、药学上可接受的载体和0.1-1.0％白蛋白。白蛋白作为缓冲剂起作用并改进所述化合物的溶解性。一方面，不添加白蛋白。
在一个实施方案中，可进行可用于实施本发明的药物组合物的给药以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。在另一实施方案中，可进行可用于实施本发明的药物组合物的给药以递送1ng/kg/天至100g/kg/天的剂量。
有用的药学上可接受的载体包括，但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其他药学上可接受的盐溶液，例如磷酸盐及有机酸盐。这些和其他药学上可接受的载体的实例在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991，MackPublication Co.，New Jersey)中有所描述。
可以以无菌注射液或油悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售药物组合物。这种悬浮液或溶液可根据已知技术进行制备，并且除活性成分外，还含有其他成分，例如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。这种无菌注射制剂可使用无毒性的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂制备，例如水或1，3-丁二醇。其他可接受的稀释剂和溶剂包括，但不限于林格氏液、等渗氯化钠溶液、非挥发性油例如合成的单甘酯或甘油二酯。
可以配制使用本文所述任何方法鉴定的化合物并将其给药于受治疗者用于治疗本文所述的任何疾病和病症。然而，本发明化合物的用途不应解释为仅包括本文所述的疾病和病症。优选地，所述受治疗者为人。
本文所述的药物组合物的制剂可通过药学领域已知的或将来开发的任何方法来制备。一般来讲，这些制备方法包括将活性成分引入与载体或一种或多种其他辅助成分合并，且然后，如果有必要或需要，将所述产物成形或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的说明原则上是针对适于符合伦理道德地给药于人的药物组合物，但本领域技术人员应理解这些组合物通常适于给药于所有种类的动物。
为使所述组合物适于给药于各种动物的适于给药于人的药物组合物的改性为熟知的，且兽医药理学的普通技术人员可设计且仅使用普通实验实施这种改性。所考虑的可进行本发明药物组合物的给药的受治疗者包括，但不限于人和其他脊椎动物和哺乳动物，包括商业上有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量大体积或作为多个单一单位剂量制备、包装或销售。如本文所使用，“单位剂量”为含有预定量的活性成分的分离量的药物组合物。所述活性成分的量通常等于给药于受治疗者的活性成分的剂量或这种剂量的合适部分，例如这种剂量的1/2或1/3。
本发明药物组合物的活性成分、药学上可接受的载体以及任何其他成分的相对量，将根据其性质、大小以及所治疗的受治疗者的病情且还根据给予所述组合物的途径而不同。举例来说，所述组合物可含有0.1％-100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分，本发明的药物组合物还含有一种或多种其他药物活性成分。特别考虑的其他成分包括止吐剂和清除剂例如氰化物清除剂和氰酸盐清除剂。
本发明药物组合物的控释或缓释制剂可使用传统技术制备。
在某些情况中，所使用的剂型可作为一种或多种活性成分的缓释或控释形式使用例如羟丙基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透的膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体或微球体或它们的组合形式来提供以提供不同比例的所需释放模式。本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂(包括本文所述的那些)可容易地被选择用于与本发明的药物组合物一起使用。因此，本发明包括适于控释的适于口服给药的单一单位剂量形式，例如片剂、胶囊、软胶囊和小胶囊。
大多数控释制剂被设计成最初释放迅速产生所需治疗作用的药物量，并逐渐和持续释放其他量药物以在延长的时间段维持该水平的治疗作用。为了在体内维持药物的该恒定水平，药物必须以将取代正被代谢并从机体排泄的药物的量的速率从该剂型释放。
活性成分的控释可受多种诱因刺激，例如pH、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。
本发明药物制剂的粉末和颗粒制剂可使用已知方法制备。这些制剂可直接给药于受治疗者，所述制剂可用于例如形成片剂、填充胶囊或通过添加水载体或油载体制备水悬浮液或油悬浮液或溶液。这些制剂各自还可以进一步含有一种或多种分散剂或湿润剂，悬浮剂和防腐剂。其他赋形剂，例如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂也可包括在这些制剂中。
如本文所使用，“油”液体是含有包含碳的液体分子并表现比水极性小的特征的液体。
适于口服给药的本发明的药物组合物的制剂可以作为离散的固体剂量单位制备、包装或销售，所述固体剂量单位包括，但不限于片剂、硬胶囊或软胶囊、扁胶囊、含片、或锭剂，各自含有预定量的活性成分。适于口服给药的其他制剂包括，但不限于粉末或颗粒制剂，水或油悬浮液、水或油溶液、糊剂、凝胶、牙膏、漱口剂、包衣、口服灌洗剂或乳剂。术语口服灌洗剂和漱口剂在本文可互换使用。
含有所述活性成分的片剂可通过例如将活性成分任选与一种或多种其他成分一起压制或模制而制备。压制片剂可通过于合适的装置中将以自由流动形式的活性成分例如粉末或颗粒制剂任选与一种或多种粘合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂一起混合压制而制备。模制的片剂可通过于合适的装置中，模制活性成分、药学上可接受的载体的混合物和至少足够润湿所述混合物的液体而制备。用于制备片剂的药学上可接受的赋形剂包括，但不限于惰性稀释剂，粒化剂和崩解剂、粘合剂和润滑剂。已知的分散剂包括，但不限于马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。已知的表面活性剂包括，但不限于十二烷基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙以及磷酸钠。已知的粒化剂和崩解剂包括但不限于玉米淀粉和藻酸。已知的粘合剂包括，但不限于明胶、阿拉伯胶、预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石。
片剂可以为非包衣的，或可使用已知方法包衣以在受治疗者胃肠道中达到延迟的崩解，由此提供活性成分的持续释放和吸收。举例来说，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可用于对片剂进行包衣。还举例来说，片剂可使用美国专利第4,256,108、4,160,452和4,265,874号所述的方法进行包衣以形成渗透控释的片剂。片剂还可以含有甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂或它们的某些组合，以提供药学上美观适口的制剂。
含有所述活性成分的硬胶囊可使用生理上可降解的组合物例如明胶来制备。这种硬胶囊含有活性成分，并还可以含有其他成分，包括，例如惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土。
含有所述活性成分的软胶囊可使用生理上可降解的组合物例如明胶来制备。这种软胶囊含有所述活性成分，其可以与水或油基质例如花生油、液体石蜡或橄榄油一起混合。
适于口服给药的本发明的药物组合物的液体制剂可以以液体形式或在使用前使用水或其他合适载体重溶的干制品来制备、包装或销售。
注射剂可以单位剂型例如安瓿或含有防腐剂的多个剂量容器制备、包装或销售。胃肠外给药的制剂包括但不限于油或水载体中的悬浮剂、溶液、乳剂，糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。所述制剂还可含有一种或多种其他成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于胃肠外给药的制剂的一个实施方案中，以干燥形式(即粉末或颗粒)提供所述活性成分，使用合适的载体(如无菌无热原水)重溶所述干燥形式，然后胃肠外给予所重溶的组合物。
本发明的药物组合物可以以适于口腔给药的形式来制备、包装或销售。合适的制剂可以以例如片剂或锭剂形式使用给药传统方法制备，且可以含有例如0.1-20％(w/w)活性成分、含有口服可溶解或可降解的组合物的平衡液以及任选地一种或多种本文所述的其他成分。可选地，适于口腔给药的制剂可以包括粉末或雾化或喷雾溶液或含有所述活性成分的悬浮液。这些粉末、雾化或喷雾制剂，当被分散时，优选具有约0.1至约200纳米范围的平均颗粒或微滴大小，并还可含有一种或多种本文所述的其他成分。
如本文所使用，“其他成分”包括，但不限于一种或多种以下成分赋形剂、表面活性剂、分散剂、惰性稀释剂、粒化剂和崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂、生理上可降解的组合物例如明胶、水载体和溶剂、油载体和溶剂、悬浮剂、分散剂或湿润剂、乳化剂、粘滑剂、缓冲剂、盐、增稠剂、填充剂、乳化剂、抗氧化剂、抗生素、抗真菌剂、稳定剂和药学上可接受的聚合或疏水材料。见Genaro，ed.，1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，通过引用并入本文。
所述化合物可以每天几次频繁地给药于受治疗者，或其可较不频繁地给药，例如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次，或甚至更不频繁，例如每几个月一次或甚至每年一次或更不频繁。给药的频率将容易地为本领域技术人员显而易见的，且将依赖于任何数量的因素，例如，但不限于所治疗的疾病的类型和严重性，受治疗者的种类和年龄，等。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包括填充有本发明药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。根据一个实施方案，提供了一种用于治疗需要免疫调节的受治疗者的试剂盒。优选地，所述受治疗者是人。在一个实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种本发明的S1P类似物且还可以包括一种或多种已知的免疫抑制剂。这些药物制剂可包装于多种容器中，例如管形瓶、试管、微量滴定微孔板、小瓶等。其他试剂可以包括在分开的容器中并使用试剂盒提供，例如阳性对照样品、阴性对照样品、缓冲剂、细胞培养基等。优选地，所述试剂盒还包括使用说明书。
尽管类似或等同于本文所述的那些方法和材料可用于本发明的实践或测试中，本文中描述了优选的方法和材料。
本领域技术人员将容易地理解本发明将很好地适于实践所述目标并获得所提到的终点和优点以及其中固有的那些。本发明可以在不背离其精神或基本性质的情况下以其他特定形式实施。
实施例 现在参照下列实施例来描述本发明。提供这些实施例仅为了说明的目的，且本发明决不应理解为限制这些实施例，而应解释为包括作为本文提供的教导结果而显而易见的任何和所有变化形式。
实施例1(1-氨基-3-(4-辛苯基)环戊基)甲醇(6) A3-(4-碘代苯基)环戊酮(1) 在N2氛围下将0.23g醋酸钯(II)(0.1当量)和0.23g氯化锑(III)(0.1当量)添加至80mL含有0.82g(10mmol)2-环戊-1-酮、2.48g(10mmol)4-碘代苯硼酸和1.6g(20mmol)醋酸钠的醋酸溶液。在25℃下搅拌24小时之后，过滤去除黑色沉淀并使用250mL盐水稀释过滤液，然后使用50mL二氯甲烷提取两次。使用饱和的NaHCO3溶液搅拌有机提取物30min，然后使用盐水洗涤并经MgSO4干燥。去除溶剂得到黄色油状物，使用快速柱(氯仿)进一步纯化得到1.92g(67％)白色固体产物。J.Org.Chem.，1995，60，883-888。
1H NMR(CDCl3)δ7.63(d，2H，ArH)，7.00(d，2H，ArH)，3.35(m，1H，ArCHCC)，2.7-1.8(m，6H，环戊基)； 13C NMR(CDCl3)δ218，143，138，129，95，46，42，39，31。
B.3-(4-辛-1-炔基)苯基)环戊酮(2) 将1.1g(10mmol)1-辛炔添加至装有10mL含有1.43g(5mmol)1的THF溶液的火焰干燥的25mL烧瓶中。脱气30min之后，在N2保护下添加2mL三乙胺、5mg CuI和10mg Pd(PPh3)4。反应在6小时内完成，去除溶剂和挥发性试剂之后，使用氯仿将混合物进行柱纯化得到1.34g(99％)黄色油状物。
1H NMR(CDCl3)δ7.35(d，2H，ArH)，7.15(d，2H，ArH)，3.37(m，IH，ArCHCC)，2.7-2.2(m，6H，环戊基)，1.95(m，2H，CCCH2CH2)，1.6-1.2(m，8H，CH2)，0.89(t，J＝6Hz，2H，CH3)； 13C NMR(CDCl3)δ220，143，132，127，122，91，80，46，42，39，32，31，29，29，23，20，14。
C3-(4-辛苯基)环戊酮(3) 将几滴甲酸和催化量5％Pd/C添加入装有10mL甲醇和1.34g(5mmol)2的25mL烧瓶中。使用H2冲洗该反应容器3次，然后装上H2气囊。两天的氢解之后，通过二氧化硅垫过滤洗涤溶质，然后浓缩得到黄色油状物。收集1.32g(98％)产物。
1H NMR(CDCl3)δ7.18(s，4H，ArH)，3.38(m，IH，ArCHCC)，2.60(t，2H，CCCH2CH2)，2.45-1.91(m，6H，环戊基)，1.64-1.15(m，12H，CH2)，0.90(t，3H，CH3)； 13C NMR(CDCl3)δ220，142，140，129，127，46，42，39，36，32，32，32，30，30，29，23，14。
D.1-氨基-3-(4-辛苯基)环戊烷腈(4) 将3.20g(11.8mmol)、1.15g(23.5mmol)氰化钠和1.25g(23.5mmol)氯化铵添加至20mL氢氧化铵中。混合物经剧烈过夜搅拌之后，使用10mL二氯甲烷提取两次。干燥并浓缩有机提取物得到3.30g黄色油状物。粗产物在未进一步纯化的情况下用于下一步骤。J.Med.Chem.，1986，29，1988-1995。
E.1-氨基-3-(4-辛苯基)环戊烷羧酸(5) 将3.3g(11.2mmol)和50mL浓盐酸加热至70℃并过夜搅拌。将所得到的澄清水溶液蒸发至干燥。添加10mL水并再次干燥。重复该过程几次。使用水和乙酮洗涤粗产物得到白色细粉末。得率为1.7g(45％)。
1H NMR(d6-DMSO)δ7.25-7.06(m，4H，ArH)9 3.21(m，IH，ArCHCC)，2.38-1.62(m，6H，环戊基)，1.49-1.20(m，14H，CH2)，0.81(t，J＝6Hz，3H，CH3)； 13C NMR(d6-DMSO)δ175，141，140，64，51，46，45，44，36，35，35，34，32，32，29，29，23，15。
F.(1-氨基-3-(4-辛苯基)环戊基)甲醇(6) 将63.4mg(0.2mmol)5和27mg(0.6mmol)硼氢化钠溶解于3mLTHF。将该溶液冷却至0℃之后，将51mg(0.2mmol)I2溶解于1mL THF并逐滴添加。然后，给该容器装配冷凝器并在N2下回流反应混合物5小时。使用甲醇淬灭过量的NaBH4。去除溶剂之后，添加2mL水和5mL二氯甲烷，搅拌混合物约1小时直至有机层变澄清。收集有机相，使用二氯甲烷再提取水相两次。将合并的有机提取物进行干燥并浓缩，得到43mg(71％)粗产物。于TLC上使用甲醇/氯仿(5∶95)进一步纯化得到13mg澄清油状物。J.Org.Chem.，1993，58，3568-3571. 1H NMR(CD3OD)δ7.11(m，4H，ArH)，3.80(t，J＝7.5Hz，IH，环戊基-CH2O)，3.67(t，J＝7.5Hz，IH，环戊基-CH2O)，3.01(m，IH，ArCHCC)5 2.55(t，J＝7.5Hz，2H，ArCH2)，2.29-1.69(m，6H，环戊基)，1.57(m，2H，ArCH2CH2)，1.38-1.28(m，10H，CH2)，0.89(t，J＝7.5Hz，3H，CH3)； 13C NMR(CD3COCD3)δ141，128，127，96，45，44，43，35，35，33，33，32，32，29，29，29，23，13。
实施例2(1-氨基-3-(4-辛苯基)环戊基)甲基二氢磷酸酯(7) (1-氨基-3-(4-辛苯基)环戊基)甲基二氢磷酸酯(7) 将1mL 85％H3PO4缓慢滴加入0.5g的P2O5，中，然后在N2保护下，于100℃将酸-酐混合物加热1小时。将另外的0.5g的P2O5和30mg 6添加入聚磷酸中并于100℃加热5小时。冷却至室温后，将10mL冰水添加至反应混合物中。产物作为白色固体沉淀出。收集产物并使用水洗涤。真空干燥之后收集31mg(82％)绿色产物。MS仅两个峰M+1＝384.4与304.4(水解回6)。
实施例3GTPγS-35结合测定 该测定说明了在分离中G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂活性。该测定通过使用编码各蛋白的四种质粒DNA转染HEK293T细胞来促使重组GPCR(如S1P1-5受体)和异源三聚体G蛋白的三种亚单位(通常为α1、β2、γ3)各自在所述细胞中的伴随表达。转染后约60小时，收获、破碎细胞，并抛弃细胞核。这允许从残留物制备粗的微粒体。微粒体上G蛋白受体复合物的激动剂(例如S1P)刺激导致α亚单位上以剂量依赖方式将GTP转换为GDP。为检测GTP结合的α亚单位，使用了GTP类似物(GTPγS-35)，其为放射性核素(硫-35)标记的硫代磷酸酯，不被水解为GDP。通过过滤收集带有附着的G蛋白的微粒体，并在液体闪烁计数器中对结合的GTPγS-35进行定量。测定得到相对效力(EC50值)和最大作用(功效，Emax)。在固定量的拮抗剂的存在下于激动剂剂量-反应曲线中测出拮抗剂活性为右移。如果拮抗剂竞争性地起作用，可测定受体/拮抗剂对(Kj)的亲和力。
在该测定中，所有VPC01091异构体的磷酸化形式以及磷酸化的VPC01091(VPC01211，CA5-P)本身为阴性，或为S1P3受体的反激动剂，并相对于S1P为S1P1受体的部分激动剂(即不完全有效)。反激动剂为拮抗剂，即，它们将干扰激动剂配体的结合，但不激发受体的活化。
VPC01211(CA5-P)和环己基(CA6-P)类似物为S1P1受体(图6)的部分激动剂，对S1P2受体(图7和8)和S1P3受体(图9)无活性。这些化合物为S1P4受体(图10)的完全激动剂和S1P5受体(图11)的部分激动剂。环己基化合物(CA4-9)对S1P1受体具有非常小的激动剂活性，但具有与环戊基和环己基化合物相似的活性。
评估了1-磷酸鞘氨醇(S1P)，VPC01211(磷酸化的VPC01091)和VPC01211的四种组分异构体对重组的人1型S1P(S1P1)受体(图16)的作用。该测定按照Davis，M-D.，JJ.Clemens，T.L.Macdonald and K.R.Lynch(2005)“S1P Analogs as Receptor Antagonists”Journal of BiologicalChemistry，vol.280，pp.9833-9841中所述进行。该实验中的所述化合物的效力等级次序(EC50)为异构体1＞异构体3＞异构体4＞异构体2＞S1P＞VPC01211。通过对VPC01091的各异构体进行化学磷酸化来制备异构体。
评估了1-磷酸鞘氨醇(S1P)，VPC01211(磷酸化的VPC01091)和VPC01211的四种组分异构体对重组的人3型S1P(S1P3)受体(图17)的作用。该测定按照Davis，M.D.，JJ.Clemens，T.L.Macdonald and K.R.Lynch(2005)“S1P Analogs as Receptor Antagonists”Journal of BiologicalChemistry，vol.280，pp.9833-9841中所述进行。该实验中的所述化合物的效力等级次序(EC50)为S1P＞异构体2＞VPC01211＞异构体4＞异构体1＞异构体3。通过对VPC01091的各异构体进行化学磷酸化来制备异构体。
实施例4淋巴细胞减少测定 将前药化合物(即伯醇，例如VPC01091)溶解于2％的羟丙基β-环糊精并通过口腔管饲法以0.01-30mg/kg体重的剂量引入小鼠。24小时(或其倍数)之后，将小鼠轻柔麻醉，并从眶窦抽取0.1ml血液。使用Hemavet血液分析仪测定淋巴细胞数量(以每ml血液数千个来表示，正常为4-11千)。在直方图中，显示了VPC01091的四种异构体，载体处理的小鼠的100％值为在24小时为7.5，在96小时为5。每组三只小鼠，其种系为混合的svl29 x C57BL/6。将活性化合物(如VPC01211)以20mM溶解于酸化的DMSO，并在搅拌下以1∶20稀释于2％的羟丙基β-环糊精水溶液。将该溶液以0.01-10mg/kg体重的剂量通过腹膜内(i.p.)注射引入小鼠。
当溶解于2％的羟丙基β-环糊精(载体)水溶液并口腔(管饲)给药于小鼠时，VPC01091激发深度的持续长时间的淋巴细胞减少(图3)。图3描述了VPC01091或载体单次剂量之后的总血淋巴细胞计数。VPC01091的单ED95剂量可引起淋巴细胞减少一周或更久。每组五只小鼠，雄性，10-11周龄svl29/C57B16系。
在淋巴细胞减少测定中，VPC01091的剂量响应曲线如图4中给出。图4图示总结了于2％羟丙基β-环糊精中的VPC01091的口腔给药，每组3只小鼠(与图3中同系)。
认为这些化合物的这种磷酸化在体内通过2型鞘氨醇(SPHK2)催化，所述2型鞘氨醇在小鼠中由SPHK2基因编码。当VPC01091被引入无功能性SPHK2基因的小鼠时，未观察到淋巴细胞减少(图5)。
在图18中，描述了SPHK2酶磷酸化四种VPC01091异构体的能力。
在图19中，图示说明了使用VPC01091的磷酸化异构体通过口腔管饲给药的测定结果。记录了在将磷酸化的VPC01091异构体IV给药后24小时和96小时的总淋巴细胞计数(k/μl)。
实施例5鞘氨醇激酶测定 通过将相关的质粒DNA转染入HEK293T细胞来促使小鼠或人重组酶的表达来制备重组的2型鞘氨醇激酶(SPHK2)。约60小时之后，收获、破碎细胞并保留无微粒体(即可溶的)部分。将含有重组酶的破碎细胞悬浮液与受试化合物(VPC01091、鞘氨醇等)(5-50微摩尔)和γ-32P-ATP混合并在37℃培养0.5-2.0小时。将反应混合物中的脂质体提取成有机溶剂并通过正相的薄层色谱展示。通过放射自显影法检测放射性标记的条带，从培养板刮除所述条带并通过闪烁计数进行定量。在所显示的直方图中，鞘氨醇为15μM，VPC01091及其异构体为50μM，培养时间为0.5小时。
实施例6钙动员测定 使用人S1P2或人S1P3受体DNA转染仓鼠CHOK1细胞，并分离并扩增显示异位表达受体的克隆群体。为检测响应激动剂刺激的钙动员，将细胞铺入96孔培养板，使用钙传感染料Fluo-4AM上样，并将细胞暴露于不同浓度的激动剂3-5min。使用FlexStation荧光计检测与细胞内钙动员相关的荧光变化。重复三次检测每一激动剂浓度。该方案于Davis，M.D.，JJ.Clemens，T.L.Macdonald and K.R.LynchSphingosine 1-phosphate analogs asreceptor antagonists.J.Biological Chemistry 280，9833-9841(2005)中较详细叙述。于图7和9中描述了结果。
图7使用S1P2受体DNA转染的CHOK1细胞。
图9使用S1P3受体DNA转染的CHOK1细胞。
实施例7心率测定 使用VPC01091(静脉内，3mg/kg)或载体(2％羟丙基β-环糊精)对小鼠进行给药，并在给药后在指定时间检测心率。使用ECGenieTM系统捕捉未抑制、有意识的动物的心率。
结果描述于图2。
在本文中包括标题，用于参照和有助于对某些部分进行定位。这些标题非意于限制其下方描述的概念的范围，并且这些概念可以适用于整个说明书的其他部分。
所使用的但本文未描述的其他方法为临床、医学、细胞学、组织化学、生物化学、分子生物学、微生物学以及重组DNA技术的领域的普通技术人员所公知的并在其能力范围内。
本文所使用的缩略语在化学和生物学领域中具有其传统含义。说明书中所引用的所有公布、专利和专利文件通过引用并入本文，如同各自通过引用并入本文。在任何不一致的情况中，本发明的内容包括其中的任何定义将优先适用。参照各具体和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应理解在本发明的精神和范围内，可做出许多变动和修改。
权利要求
1.一种具有下式的化合物或其药学上可接受的盐或酯
或
其中，R4和R7独立地为CH或CH2；R5为C、CH或N，R6为CH、CH2、O、S或SR3；R3为氢或(C1-C10)烷基；
X选自羟基、磷酸根、膦酸根、α-取代的膦酸根；
R1选自氢、卤素、三氟甲基、(C1-C10)烷基、被卤素、羟基、(C1-C10)烷氧基或氰基取代的(C1-C10)烷基组成的组；且
R2选自(C1-C20)烷基、环烷基取代的烷基、(C2-C20)烯基、(C2-C20)炔基、芳基、烷基取代的芳基、芳烷基以及芳基取代的芳烷基组成的组；其中R2基团中的一个或多个碳原子可独立地被非过氧化物氧、硫或NR8取代；
其中R8为氢或(C1-C10)烷基；
其中R2中的烷基、烯基和炔基任选被氧代取代；n是0、1、2或3；且
表1、2或3个任选的双键。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有下式(II)
其中，X选自羟基、磷酸根、膦酸根、α-取代的膦酸根；
其中R1选自氢，卤素，(C1-C6)烷基，被卤素、羟基、烷氧基、氰基取代的(C1-C6)烷基组成的组；
R2选自烷基、烯基、炔基、烷基取代的芳基、烷基取代的环烷基、芳烷基和芳烷基取代的芳基组成的组；且n是0、1、2或3。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述R1为氟或氯。
4.如权利要求1-3任一项所述的化合物，其中所述X是羟基或OPO3H2。
5.如权利要求4所述的化合物，其中所述X是OPO3H2。
6.如权利要求4所述的化合物，其中所述X是羟基。
7.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述α-取代的膦酸根是-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2、-C＝OPO3H2或-OPO2SH2。
8.如权利要求7所述的化合物，其中所述α-取代的膦酸根是-CHFPO3H2、-CF2PO3H2、-CHOHPO3H2，或-C＝OPO3H2。
9.如权利要求1-8任一项所述的化合物，其中所述R1是氢。
10.如权利要求1-9任一项所述的化合物，其中所述R2是具有5、6、7或8个碳原子的烷基。
11.如权利要求10所述的化合物，其中所述R2是庚基、辛基、壬基或-O-庚基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述R2是辛基。
13.如权利要求1-12任一项所述的化合物，其中所述n是1或2。
14.如权利要求1-13任一项所述的化合物，其中所述R2基团位于所述环烷基环的对位。
15.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述环烷基具有下式
或
16.如权利要求1-15任一项所述的化合物，其中所述R1基团位于所述R2的邻位或间位。
17.如权利要求1-15任一项所述的化合物，其中所述R2基团位于所述苄基环烷基的对位。
18.如权利要求1或2所述的化合物，其具有下式
或
19.一种用于预防或治疗哺乳动物的病理疾病或症状的方法，其中涉及1-磷酸鞘氨醇受体的活性，且所述活性的激动是期望的，所述方法包括给药于所述哺乳动物有效量的如权利要求1-18任一项所述的化合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述病理疾病是自身免疫性疾病。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是眼葡萄膜炎、I型糖尿病、类风湿性关节炎、炎性肠病或多发性硬化症。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述病理疾病是淋巴细胞运输改变。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述治疗是改变淋巴细胞运输。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述淋巴细胞运输提供了延长的同种异体移植物的存活时间。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述同种异体移植物用于移植。
27.一种用于预防或治疗哺乳动物的病理疾病或症状的方法，其中涉及S1P裂解酶活性，且S1P裂解酶的抑制是所需的，其包括给药于所述哺乳动物有效量的如权利要求1-18任一项所述的化合物。
28.权利要求1-18任一项所述的化合物用于医学治疗的用途。
29.权利要求1-18任一项所述的化合物用于制备用于预防或治疗哺乳动物病理疾病或症状的药物的用途，其中涉及1-磷酸鞘氨醇受体的活性。
30.如权利要求28所述的用途，其中所述药物含有液体载体。
全文摘要
本发明提供了1-磷酸鞘氨醇类似物，其为一种或多种S1P受体(特别是S1P1受体类型)的有效和选择性的激动剂。本发明化合物包括具有磷酸根部分的化合物和具有抗水解的磷酸根替代物例如膦酸根、α-取代的膦酸根以及硫代磷酸根的化合物。
文档编号A61K31/425GK101119714SQ200680004868
公开日2008年2月6日 申请日期2006年2月14日 优先权日2005年2月14日
发明者凯文·R·林奇, 蒂莫西·L·麦克唐纳 申请人:弗吉尼亚大学专利基金会