专利名称：用于治疗肿瘤的4000-10000道尔顿的寡脱氧核糖核苷酸的制作方法
用于治疗肿瘤的4000-10000道尔顿的 寡脱氧核糖核苷酸本发明主题为通过对患肺瘤的哺乳动物施用有效量的oligotide来治疗 所述哺乳动物的方法；具体地，涉及oligotide用于治疗血管发生依赖性肺 瘤(如多发性骨髄瘤或乳腺癌)的用途。
背景技术：
血管发生是引起由预先存在的脉管系统形成新血管的多步骤过程，它 是原发性肿瘤生长、侵袭和发生转移所必需的(20)。正常情况下，它在成 人中受到抑制，其中血管发生仅在生殖、发育和伤口愈合中暂时性出现。 超过临界体积之后，肿瘤不能在没有新血管形成的情况下进一步增殖(12)。 为了促进增殖，肿瘤必须获得血管发生表型，所i^型是正(仏血管发生) 和负(fefiL管发生)调节剂净平衡的结果(16)。然而，肺瘤在血管结构、分化 和功能性血供应上是高度异源的(24)。这些无血管血管发生前肿瘤大小上 的差异可能部分是因为肿瘤细胞在不同缺氧程度下存活的能力(18)。某些胂瘤血管发生依赖性的证据来自这一观察血管发生程度的度 量一一微血管密度是所述临床实体中独立的存活预后因子(17)，所述肿瘤 为例如多发性骨髄瘤，甚至非实体白血病和淋巴瘤(8)和(21)以及乳腺癌 (25)、结肠直肠癌(7)、胃癌(26)、前列腺癌(9)、宫颈癌(19)、肝细胞癌(23) 和非小细胞肺癌(13)。在最近的临^l研究中(再次在乳腺癌中)，已经开始明 确血管发生相关基因对临床结果是很重要的，例如血管内皮细胞生长因子 VEGF、 VEGF受体FLT1和金属蛋白酶MMP9(6)。定义
本文使用的术语oligotide用于标识分子量为4000-10000道尔顿的任何 寡脱氧核糖核香酸。其优选标识具有以下分析参数的任何寡脱氧核糖核苷 酸分子量(mw): 4000-10000道尔顿，增色性(h): <10，A+T/C+G: 1.100-1.455，A+G/C+T: 0.800-1.160，比旋光十30。誦+46.80，优选+300- +46.20。oligotide可以通iWw动物和/或植物组织(特别是哺乳动物器官讳l取而 产生，或者可以合成产生。优选地，通过^^取产生时，其优选按照引入本 文为参考的(l)、 (2)和(3)中所述方法获得。已知oligotide具有显著的抗局 部缺血活性。或植物组织提取获得，但也可以合成产生；所述多脱氧核糖核苷酸通常以 碱金属盐的形式使用， 一般为钠盐， 一般具有约45-50 kDa的分子量(CAS 登记号83712-60-1)。优选地，去纤维蛋白多核苷酸显示引入本文为参考的 (4)和(5)中描述的物理/化学特征。发明描迷我们最近开发了用于肿瘤血管发生备选途径的模型.除了从预先存在 的血管形成内皮细胞以外，我们提出血'^JL生的内皮细胞也可以产生肿瘤 脉管系统。这些内皮样细胞(ELC)在特定培养条件下由肿瘤相关的树突细 胞转分化(ll)。简言之，从健"供血者的白细胞分离产物中淘选单核细 胞，并在粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)存在下 培养，以刺激树突细胞(DC)的分化。此外，用肿瘤细胞特异性释放的混合 物(M-CSF、 IL.6和乳酸，Gottfried等，手稿已提交)处理细胞，以促itJt 瘤相关树突细胞(TuDC)向外生长。这些TuDC-ELC获得了内皮细J^^型(因子VIII相关的Ag， vWF)，
然而它们失去了单核细胞(CD14)和树突细胞标志物(CDla)。很重要的是， 它们不表达CD34，也不表达CD133或CD146,这证明它们是真实的转分 化产物，没有循环内皮祖细胞(CD34、 CD133)或成熟循环内皮细胞(CD146) 的污染。此外，它们能在MatrigelTM(血管发生的体外测定)中形成管样结 构'MatrigelTM测U最普遍并广泛使用的体外血管发生测定之一(22)。 MatrigelTM ^J&外M蛋白的半固体合成混合物，其刺激生理存在于血管 内皮细胞壁以下的基质。当目的细胞接种在显微小室栽玻片中的该M上 时，它们被激活，在3-7天内形成管状结构，^it^它们具有内皮细胞 表型的情况下发生。因此，该测定适于显示细胞引起肿瘤脉管系统发生的 潜在能力。我们的数据证明临床或亚临床浓度的oligotide和/或去纤维蛋白多核 苷酸能抑制转分化ELC(TuDC-ELC)在MatrigelTM中的管形成.将 TuDC-ELC和成熟的已分化内皮细胞AJ^frJ^(HUVEC)或,管内皮细 胞(HMEC)作为"稳定"对照在存在或不存在oligotide或去纤维蛋白多核 苷酸(各为10^g/mL)的条件下温育.重要的是，在单次加入去纤维蛋白多 核苷酸后，HUVEC和HMEC的管形成潜力未受影响，提示去纤维蛋白多 核苷酸和/或oligotide仅把向转分化内皮细胞(
图1A)。然而，重复加入去纤 维蛋白多核苷酸时，也能阻断成熟的完全分化内皮细胞的血管发生(见下 文)。借助来自NIH(ImageJ，http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)的辅助软件，我们能 够定量这些效果，评估管的总长和照片面积，接着以总长>1/面积<象素-11 给出微血管密度(MVD)。 DF显著(p-0.02， t检验)下调TuDC-ELC的 MVD(图1B)。为了用备选血管发生测定支持这些数据，在每日基础上应用DF时， 大鼠主动脉内皮细^ MatrigelTM中的萌发被接近100%阻止(图2)，提 示DF不但/ft用于转分化细胞，而且还作用于成熟的完全分化的内皮细胞。主动脉环测定研究大血管内皮细胞。但肿瘤脉管系统经常由^J^管内
皮细胞组成。因此，基于培养9-ll天后通过一层皮肤成纤维细胞层的微血 管内皮细胞血管化，进行了第三种体外血管发生测定。接着可以通过CD31 和vWF染色显示这些血管样结构。如图3(A和B)所示，DF还能阻断人微血管内皮细胞的血管发生，优 选每日应用。有趣的是，10/ig/mL左右的浓;l^来是最有效的。单次应用 DF不能显著阻断血管发生。总而言之，我们的数据强烈提出，去纤维蛋白多核苷酸和/或oligotide 能阻断肿瘤相关转分化内皮细胞和来自现有血管细胞的那些细胞的血管发 生。继续研究oligotide和去纤维蛋白多核苷酸是否在体内也抑制血管发 生。我们目前进行了背皮室测定(14),其在高度血管化的人胃癌小鼠模型(异 种移植系统)中研究去纤维蛋白多核苷酸的效果。初步数据明确显示DF处 理的肿瘤的^fc管密度(MVD)低于对照肿瘤。在截止时间前将重复i^M实 验。DF能阻断血管发生的作用机制仍有待阐明，但是来自Western印迹 的初步证据提示DF对活化的p70S6激酶(p-p70S6)(促分裂原活化的蛋白激 酶)的下调作用.对p70S6激酶影响的其他证据得自另一管形成测定，其中在存在或不 存在p70S6激酶抑制剂DRB的情况下培养HMEC.也有来自接受同种异体干细胞移植(SCT)的患者(pts.)的第 一批临床数 据在17名用去纤维蛋白多核苷酸治疗的一组患者中观察到了血清VEGF 水平的显著下降，也提示去纤维蛋白多核苷酸可能通过生长因子撤除发挥 作用，所述生长因子用于使肿瘤内皮细胞萌发，去纤维蛋白多核苷酸和oligotide是血管发生依赖性肿瘤治疗的有力候 选者，并且可单独使用或与其他^jk管发生剂(如雷帕霉素(14))组^^吏用。 有趣的是，雷帕霉素具有促血栓形成活性的消极副作用(15)，这可通过同 时应用^jfiL栓形成和溶纤维蛋白的去纤维蛋白多核苷酸来减弱。 参考文献1 US56461272 US56462683 US60461724 US49855525 US52236096 't Veer，L丄,et al.(2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415， 530-536.7 Abdalla，S.A.， et al.(1999) Prognostic relevance of microvessel density in colorectal tumours. Oncol.Rep.， 6， 839-842.8 Andersen，N.F.， et al. (2005) Syndecan-1 and angiogenic cytokines in multiple myeloma: correlation with bone marrow angiogenesis and survival. Br丄Haematol.， 128， 210-217.9 BostwickjD.G. & Iczkowski，K.A. (1998) Microvessel density in prostate cancer: prognostic and therapeutic utility. Semin.Urol.Oncol" 16， 118-123.10 Eissner，G.， et al. (2002) Fludarabine induces apoptosis， activation, and allogenicity in human endothelial and epithelial cells: protective effect of defibrotide. Blood, 100， 334-340.11 Fernandez，P.B.， et al. (2001) Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial誦like cells. Eur丄CeH Biol" 80， 99-110.12 Folkman，J.， et al. (1971) Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J.Exp.Med.， 133， 275-288.13 Fontanini，G.， et al. (1995) Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J.Pathol" 177， 57-63.14 Guba，M.， et al.(2002) Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat.Med.， 8， 128-135.15 Guba，M.， et al. (2005) Rapamycin induces tumor-specific thrombosis via tissue factor in the presence of VEGF. Blood.16 Hanahan，D. & Folkman，J. (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell， 86， 353-364.17 Hasan,J.， et al. (2002) Intra國tumoural microvessel density in human solid tumours. Br丄Cancer， 86， 1566-1577.18 HelmIinger，G, et al. (1997) Interstitial pH and p02 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nat.Med., 3， 177-182.19 Kainz，C.， et al. (1995) Prognostic value of tumour microvessel density in cancer of the uterine cervix stage IB to IIB. Anticancer Res" 15， 1549-1551.20 Morabito，A., et al. (2004) Antiangiogenic strategies, compounds, and early clinical results in breast cancer. Crit Rev.Oncol.Hematol,， 49， 91-107.21 Podar，K. & Anderson,ICC. (2005) The pathophysiologic role of VEGF in hematologic malignancies: therapeutic implications. Blood， 105， 1383-1395.22 Staton，C.A.， et al. (2004) Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int丄Exp.Pathol.， 85， 233-248.23 S叫H.C.， et al. (1999) Microvessel density of hepatocellular carcinoma: its relationship with prognosis. J.Cancer Res.Clin.Oncol" 125， 419-426.24 Verheul，H.M.， et al. (2004) Are tumours angiogenesis-dependent J.Pathol.， 202， 5-13. 25 Weidner，N.， et al. (1992) Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J.Natl.Cancer Inst" 84， 1875-1887.26 Xiangming，C.， et al. (1998) Angiogenesis as an unfavorable factor related to lymph node metastasis in early gastric cancer. Ann.Surg.Oncol.， 5， 585-589.
权利要求
1、 分子量为4000-10000道尔顿的寡脱氧核糖核苷酸用于生产具有抗 肺瘤作用的制剂的用途。
2、 根据权利要求l的用途，其特征在于所述寡脱氧核糖核苷酸具有以 下分析^lt: h<10， A+T/C+G: 1.100-1.455， A+G/C+T: 0.800-1.160，比旋 光+30。國+46.80。
3、 根据权利要求2的用途，其特征在于所述比旋光在+30°到+46.2°之间。
4、 根据权利要求1的用途，其特征在于通it^动物和/或植物組织提 取、优选从哺乳动物器官提取获得所述寡脱氧核糖核苷酸。
5、 根据权利要求l的用途，其特征在于所述寡脱氧核糖核苷酸通过合 成获得.
6、 根据权利要求l的用途，其特征在于将所述制剂施用于哺乳动物。
7、 根据权利要求l的用途，其特征在于所述哺乳动物为人.
8、 根据权利要求l的用途，其特征在于静脉内施用所述制剂。
9、 根据权利要求l的用途，其特征在于所述制剂为水溶液。
10、 根据权利要求l的用途，其特征在于所述制剂含有至少另一具有 抗肿瘤作用的活性成分。
11、 根据权利要求10的用途，其特征在于具有抗肿瘤作用的另一种活 性成分选自去纤维蛋白多核苷酸、雷帕霉素、紫杉醇、单野百合碱、BCNU 和/或环磷酰胺。
12、 根据权利要求l的用途，其特征在于所述制剂含有惯用的赋形剂 和/或佐剂.
全文摘要
描述了具有4000-10000道尔顿分子量的寡脱氧核糖核苷酸作为抗肿瘤剂单独或与具有抗肿瘤作用的其他活性成分组合的用途。所述oligotide可以通过从动物和/或植物组织(特别是从哺乳动物器官)提取产生，也可以合成产生。可以治疗的肿瘤优选为血管发生依赖性肿瘤如多发性骨髓瘤或乳腺癌。
文档编号A61P35/00GK101123973SQ200680005555
公开日2008年2月13日 申请日期2006年2月27日 优先权日2005年3月3日
发明者G·艾森纳, L·I·费罗, M·亚科贝利 申请人:真蒂奥姆有限公司