专利名称：胰岛素抵抗性改善剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胰岛素抵抗性改善剂及其使用方法。
背景技术：
胰岛素抵抗性是指肌肉、肝脏、脂肪等全身组织对胰岛素的敏感性 降低的状态。在产生胰岛素抵抗性的状态下，组织对胰岛素的敏感性降 低，胰岛素依赖性的糖摄取能力下降。其结果是胰岛素降低血糖的效果 减弱。因此，当出现代偿性高胰岛素血症或胰岛素分泌能力不足时，引 起高血糖症状(非专利文献l)。
特别是对于2型糖尿病患者，由于胰岛素分泌能力的下降和胰岛素 抵抗性，处于胰岛素相对不足的状态，这被认为是病因所在。因此，在2 型糖尿病的药物治疗中，使用胰岛素抵抗性改善剂以提高组织中的胰岛 素依赖性糖摄取能力是有效的，实际上开发了许多药物并应用于临床(非 专利文献2)。
但是，现在使用的胰岛素抵抗性改善药中，也有不少可能引起严重 的副作用而使治疗难以继续。实际上报道了多起因发生肝功能障碍、浮 肿、体重增加、脂肪组织重量增加等副作用而不得不停止治疗和停止销 售的事例，这成为胰岛素抵抗性改善药的应用范围受到限制的一个原因 (非专利文献2)。
另一方面，作为2型糖尿病的新的治疗策略，利用GLP-1 (胰高血 糖素样肽-1 (Glucagon-LikePeptide-l))受体激动剂之一的GLP-1 (7-36)
酰胺的作用的方法受到关注(专利文献1 7;非专利文献4、5、6)。GLP-1 (7-36)酰胺是由小肠下段存在的L细胞分泌的多肽激素，每餐后一过 性分泌，直接或间接地作用于胰脏和其它全身组织。另外，己知其具有 血糖值依赖性的胰岛素分泌促进作用、胰高血糖素分泌抑制作用、食欲 抑制作用、消化道运动抑制作用(非专利文献7)，并认为其在机体内对 膳食糖吸收和血糖发挥调节作用的同时，承担为下次摄取食物做好准备 的作用(非专利文献8)。另外，2型糖尿病患者血浆中的GLP-1 (7-36)酰胺浓度降低，但在 这种状态下胰脏(3细胞对GLP-1 (7-36)酰胺仍保持敏感性(非专利文 献9)，认为通过外源性补充降低的内源性GLP-1 (7-36)酰胺可以改善 2型糖尿病的症状。
但是，即使外源性给予作为肽的GLP-1 (7-36)酰胺，也会被机体 内存在的分解酶二肽酰肽酶-IV (dipeptidyl peptidase (DPP) -IV)迅速 分解为非活性的代谢物(GLP-1 (9-36)酰胺)(非专利文献IO)。而且， 由于作为肽的化学特性，给药方法限于注射或基于其的侵入性给药方法， 目前将GLP-1 (7-36)酰胺作为2型糖尿病这种慢性疾病的治疗药还存 在非常大的困难。
基于这样的背景，对于利用GLP-1 (7-36)酰胺的生物活性作为2 型糖尿病的新型治疗法的方法，可以选择以下的方式(非专利文献4、 5、 6)。
(1) 以注射或以基于其的侵入性给药方法给予对DPP-IV具有耐受 性、且与GLP-1 (7-36)酰胺具有相同作用的长效GLP-1受体激动剂。
(2) 使用灌注泵这样的特殊装置，持续经静脉给予或持续皮下给药 GLP-1 (7-36)酰胺。
(3) 通过给予分解GLP-1 (7-36)酰胺的酶DPP-IV的活性抑制剂， 抑制餐后分泌的内源性GLP-1 (7-36)酰胺被代谢为非活性的代谢物
(GLP-1 (9-36)酰胺)以确保血浆中GLP-1 (7-36)酰胺浓度进行治疗。
但是，使用上述(1)的长效GLP-1受体激动剂的治疗(非专利文 献ll、 12、 13)以及上述(2)的GLP-1 (7-36)酰胺的持续给予(专利 文献8、 9)时，总的说来，与内源性水平相比，由于使极高浓度的GLP-1 受体激动剂以长时间持续作用，反而有可能舍弃GLP-1 (7-36)酰胺所 具有的多种生物活性的一部分。即由于此时的血桨中GLP-1受体激动 剂浓度的变动图形与每餐后一过性上升的被称为内源性GLP-1受体激动 剂浓度的变动图形完全不同，认为由于脱敏作用等的原因引起作用减弱， 而陷于不能充分发挥GLP-1 (7-36)酰胺所具有的生物活性的状态。
另外，使用上述(3)的DPP-IV抑制剂的治疗(非专利文献14、 15) 中，担心DPP-IV的选择性问题。己知DPP-IV不仅参与GLP-1 (7-36) 酰胺的代谢，还参与GLP-2、 GIP、 GHRH、 PYY等许多激素的代谢(非 专利文献16)。因此，认为将DPP-IV抑制剂给予糖尿病患者和糖尿病模 型动物后发现的药理作用不一定全部是GLP-1 (7-36)酰胺的分解抑制 产生的(非专利文献17、 18、 19)。另外，通过DPP-IV抑制剂非选择性 地长期抑制该酶的活性，担心可能发生动物试验中无法预见的副作用。
另外，DPP-IV也称作CD26，已知与免疫细胞的活性控制有很大关 系，特别是与T细胞的活性有密切关系(非专利文献20)，因此指出给 予DPP-IV抑制剂具有导致机体免疫功能下降的危险性。而且，据报道如 果反复给予DPP-IV抑制剂，则由于机体内DPP-IV活性代偿性上升，活 性减弱(非专利文献18)。
另外，上述现有的治疗方法中，对于GLP-1受体激动剂是否具有直 接改善患者胰岛素抵抗性的作用或增强胰岛素敏感性的作用尚不清楚。
关于将GLP-1受体激动剂给予糖尿病模型动物，通过改善高血糖状 态间接改善胰岛素抵抗性的试验(非专利文献21)，以及通过改善糖尿病 状态或阻止其发展以改善血管反应性或抑制恶化的试验已有报道(非专 利文献22)，但这些试验结果均定位于基于目前已知的GLP-1受体激动 剂的生物活性胰岛素分泌亢进作用或食欲抑制作用等的间接影响，考察 到通过长时间、以较高浓度维持血浆中的GLP-1受体激动剂浓度，使血 糖值降低，随之间接改善胰岛素抵抗性或血管反应性。因此，认为通过 使GLP-1受体激动剂以长时间、高浓度进行作用，会发生更强的作用。
由上述可知，现在的糖尿病治疗中，虽然己知GLP-1受体激动剂、 特别是GLP-1 (7-36)酰胺具有的特性有效，但是实际现状是未必能说 已经确立了充分发挥该特性的临床应用方法，因此期待着开发更好的治 疗方法。
专利文献1 特表平1-502746号公报 专利文献2 美国专利第5118666号 专利文献3 美国专利第5120712号 专利文献4 美国专利第5614492号 专利文献5 专利文献6 专利文献7 专利文献8 专利文献9 非专利文献1
特表平10-500114号公报 美国专利公开2002-0119146 美国专利公开2002-0160008 特开平7-2695号公报 美国专利公开2003-0050237
糖尿病学2001、第1版、p64-74、平成14年4月 25日发行，株式会社诊断与治疗社(日文原文糖尿病学2001、第l版、 p64-74、平成14年4月25日発行、株式会社診断i治療社)
非专利文献2 日本临床增刊号新时代的糖尿病学3，株式会社 日本临床社，422-8，平成M年9月28日发行(日文原文日本臨床増 刊号新時代O糖尿病学3、株式会社日本臨床社、422-8、平成14年9月 28日発行)
非专利文献3 最新医学，2005， 60巻36-42 (日文原文最新医 学、2005、 60巻:36-42)
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非专利文献5 非专利文献6 非专利文献7 非专利文献8 非专利文献9 非专利文献1 非专利文献1 非专利文献1 非专利文献l 非专利文献1 非专利文献1 非专利文献1 非专利文献l 非专利文献l 非专利文献1
非专利文献2 0
非专利文献21
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非专利文献2 3
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发明内容
因此，本发明的目的是提供副作用少且药物相互作用少的用于改善 胰岛素抵抗性的GLP-1受体激动剂的新的给药形式以及该给药用的胰岛 素抵抗性改善剂。
更详细地说，目的是提供不产生因给予现有的胰岛素抵抗性改善药 及利用现有的GLP-1受体激动剂的生物活性治疗糖尿病所产生的问题， 改善胰岛素抵抗性以及预防和治疗胰岛素抵抗性引起的疾病例如高血糖 症、糖尿病及肥胖症等的方法，以及含有该方法中使用的GLP-1受体激 动剂作为有效成分的胰岛素抵抗性改善剂。
本发明人等鉴于上述状况，认为如果通过给予GLP-1受体激动剂， 即GLP-1和GLP-1衍生物及其药理上可接受的盐，能够产生模仿或强调 健康个体的内源性G L P -1受体激动剂的日内变动的状态，则可以更有效 地利用该激动剂的生物活性，有可能发现关于糖尿病治疗的新型临床应 用，于是尝试进行证明。
其结果是新发现将GLP-1受体激动剂用于糖尿病治疗时的最恰当的 给药方法，不是以使GLP-1受体激动剂以持续的高浓度作用为目的的给 药方法，而是通过外源性给予GLP-1受体激动剂，最好是非侵入性给予， 来达到与内源性GLP-1受体激动剂每餐后一过性分泌相同的状况，并且 该给药方法可安全且有效地改善个体的胰岛素抵抗性。
因此，本发明的一个方面如下
(l)一种改善胰岛素抵抗性或者预防或治疗伴有胰岛素抵抗性的疾 病的医药组合物，其含有GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐作 为有效成分，所述医药组合物用于对呈现胰岛素抵抗性症状的个体，在
摄取食物前以单次剂量0.5 5000吗给予GLP-1受体激动剂或其药理学 上可接受的盐，1日1次以上，给药2周以上，按该连续方案给予；
(2) 上述(1)所述的医药组合物，其中所述给予还在摄取食物后
给予；
(3) 上述(1)或(2)所述的医药组合物，其中所述GLP-1受体 激动剂为GLP-1 (7-36)酰胺；
(4) 上述(1) (3)的任一项中所述的医药组合物，其中所述给 予为皮下给药、经鼻给药或经肺给药；
(5) 上述(1) (4)的任一项中所述的医药组合物，其中所述伴 有胰岛素抵抗性的疾病为高胰岛素血症、糖尿病、肥胖症、高脂血症、 动脉硬化症、高血压症或循环器官疾病；
(6) 上述(7)所述的医药组合物，其中所述伴有胰岛素抵抗性的 疾病为糖尿病；
(7) 上述(1)所述的医药组合物，其用于通过摄取食物前的经鼻 给药给予GLP-1 (7-36)酰胺。
另外，本发明的另一个方面是
(8) —种改善胰岛素抵抗性或者预防或治疗伴有胰岛素抵抗性的疾 病的方法，所述方法是对呈现胰岛素抵抗性症状的个体，在摄取食物前 以单次剂量0.5 5000吗给予GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的 盐，1日1次以上，给药2周以上，按该连续方案给予；
(9) 上述(8)所述的方法，其中所述给予还在摄取食物后给予；
(10) 上述(8)或(9)所述的方法，其中所述GLP-1受体激动剂 为GLP-1 (7-36)酰胺；
(11) 上述(8) (10)的任一项中所述的方法，其中所述给予为 皮下给药、经鼻给药或经肺给药；
(12) 上述(8) (11)的任一项中所述的方法，其中所述伴有胰 岛素抵抗性的疾病为高胰岛素血症、糖尿病、肥胖症、高脂血症、动脉 硬化症、高血压症或循环器官疾病；
(13) 上述(12)所述的方法，其中所述伴有胰岛素抵抗性的疾病 为糖尿病；
(14) 上述(8)所述的方法，其用于通过摄取食物前的经鼻给药给 予GLP-1 (7-36)酰胺。
进一步地，本发明的另一个方面是
(15) GLP-1受体激动剂在制备下述医药组合物中的用途，所述医 药组合物是改善胰岛素抵抗性或者预防或治疗伴有胰岛素抵抗性的疾病 的医药组合物，对呈现胰岛素抵抗性症状的个体，在摄取食物前以单次 剂量0.5 5000叱给予GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐，1 日1次以上，给药2周以上，按该连续方案给予；
(16) 上述(15)所述的用途，其中所述给予还在摄取食物后给予；
(17) 上述(15)或(16)所述的用途，其中所述GLP-受体激动 剂为GLP-1 (7-36)酰胺；
(18) 上述(15) (17)的任一项中所述的用途，其中所述给予 为皮下给药、经鼻给药或经肺给药；
(19) 上述(15) (18)的任一项中所述的用途，其中所述伴有 胰岛素抵抗性的疾病为高胰岛素血症、糖尿病、肥胖症、高脂血症、动 脉硬化症、高血压症或循环器官疾病；
(20) 上述(19)所述的用途，其中所述伴有胰岛素抵抗性的疾病 为糖尿病；
(21) 上述(15)所述的用途，其用于通过摄取食物前的经鼻给药 给予GLP-1 (7-36)酰胺。
上述提供的本发明，不是使GLP-1受体激动剂持续作用，而是通过 使血浆中GLP-1受体激动剂浓度的一过性上升间歇性地重复进行，模仿 内源性GLP-1受体激动剂的日内变动，据此直接改善胰岛素抵抗性，结 果首次发现对改善或治疗高血糖症状、糖尿病及肥胖症等的由胰岛素抵 抗性引起的疾病的症状是有效的。
在伴有过度饱食、肥胖及高胰岛素血症的胰岛素抵抗性模型小鼠
(KK-Ay/Ta小鼠)中，通过给予GLP-1受体激动剂，使血浆中GLP-1 受体激动剂浓度的一过性上升间歇性地重复进行，能首次确认该发现。 体内半衰期短的GLP-1受体激动剂即使以低用量只给予1次，虽然几乎 没有发现降血糖作用，但不是使其持续作用，而是通过使血浆中GLP-1 受体激动剂浓度的一过性上升间歇性地重复进行，发现可抑制血糖值上 升或降低血糖值。
该给药时的血糖值的降低，不一定必须增加胰岛素分泌量，与腹腔 内给予外源性胰岛素时的降血糖值作用相比，可以确认该作用是通过增 强胰岛素敏感性，即通过改善胰岛素抵抗性而降低血糖值。该作用是在 给予GLP-1受体激动剂后经过足够时间，虽为外源性给予但认为是在 GLP-1受体激动剂从体内消失的条件下进行确认的，表示即使不是如现 有方法中那样使之持续作用也能够获得目的效果。
由以上表明不是使GLP-1受体激动剂持续作用，而是通过给予使 血浆中GLP-1受体激动剂浓度的一过性上升间歇性地重复进行，改善个 体的胰岛素抵抗性，并且表明通过改善胰岛素抵抗性来改善高血糖症状。
而且，近年来由于弄清了如果因胰岛素抵抗性而使血液中的胰岛素 值及血糖值偏高的状态持续，那么会陷入"代谢综合征"(所谓的 metabolic syndrome)的状态，引起高血压、高脂血症或心脏循环系统障 碍等(非专利文献l)，因此胰岛素抵抗性改善剂不仅应用于2型糖尿病 的治疗，还可以期待在高脂血症、高血压、缺血性心脏病等各种疾病的 预防及治疗中的应用。
另外，本发明的胰岛素抵抗性改善作用，认为不是伴有改善高血糖 症状或促进胰岛素分泌的间接作用，因此不只是应用于发生全身性胰岛 素作用不足的2型糖尿病患者，也可能应用于局部胰岛素敏感性降低及 与之相伴的疾病的治疗。
本发明的特征在于通过一定期间反复给予GLP-1受体激动剂，使血 浆中浓度的一过性上升间歇性地重复进行，来改善胰岛素抵抗性。在给 予GLP-1后经过足够的时间达到血液中检测不出给予的GLP-1的状态 后，该作用也不消失。因此，该作用与己报道的GLP-1作用(促进胰岛
素分泌作用、增强GLP-1共存下的胰岛素的降血糖作用、胰岛素非依赖 性糖摄取作用等)有本质的不同。
另外，GLP-1没有现有的胰岛素抵抗性改善药中所报道的肝功能障
碍、浮肿、体重增加、脂肪组织重量增加等副作用。因此，可以给予患 有肥胖或并发心功能不全的患者，认为比使用现有的胰岛素抵抗性改善 药的治疗方法有效。
根据以上各点，期待本发明的效果如下
(1) 对于高血糖症状的糖尿病发病前的胰岛素抵抗性患者，通过一
定期间反复给药，使血浆中GLP-1受体激动剂浓度的一过性上升间歇性
地重复进行，预防糖尿病发病。
(2) 对于确认有胰岛素抵抗性的糖尿病患者，通过一定期间反复给 药，使血浆中GLP-1受体激动剂浓度的一过性上升间歇性地重复进行， 改善胰岛素抵抗性。
(3) 对于确认有胰岛素抵抗性的糖尿病患者，通过一定期间反复给 药，使血桨中GLP-1受体激动剂浓度的一过性上升间歇性地重复进行来 改善胰岛素抵抗性，防止胰脏疲惫，抑制糖尿病态的发展。
(4) 对于不一定伴有血糖值上升的呈胰岛素抵抗性的病态，通过一 定期间反复给药，使血浆中GLP-1受体激动剂浓度的一过性上升间歇性 地重复进行，改善胰岛素抵抗性。
图1表示对KK-Ay/Ta Jcl小鼠1日1次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺 (500(ig/kg、皮下注射(s.c.))或曲格列酮(30mg/kg、腹腔内注射(i.p.)) 期间的饱餐时血糖值变化的结果。
图2表示对KK-Ay/TaJcl小鼠1日1次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺 (500(ig/kg、 s.c.)或曲格列酮(30mg/kg、 i.p.) 13天后的空腹时血糖值 比较的结果。
图3表示对1日1次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺(500吗/kg、 s.c.) 或曲格列酮(30mgZkg、 i.p.) 14天的KK-Ay/Ta Jcl小鼠，经口负荷葡萄
糖/ 3&脱氧葡萄糖混合溶液时血清中的放射性(糖负荷30分钟后测定) 的结果。
图4表示对1日1次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺(500pg/kg、 s.c.) 或曲格列酮(30mg/kg、 i.p.) 14天的KK-Ay/Ta Jcl小鼠，经口负荷葡萄 糖〃H-脱氧葡萄糖混合溶液时血清中的葡萄糖浓度(糖负荷30分钟后 测定)的结果。
图5表示对1日1次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺(500|ig/kg、 s.c.) 或曲格列酮(3Omg/kg、 i.p.) 14天的KK-Ay/Ta Jcl小鼠，经口负荷葡萄
糖/ 311 —脱氧葡萄糖混合溶液时放射性的组织移行率(糖负荷30分钟后 测定)的结果。
图6表示对小鼠皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺溶液(介质25%葡聚 糖70溶液，500|ig/kg)时血浆中活性型GLP-1浓度变化的结果。
图7表示1日3次反复皮下给予GLP-l(7-36)酰胺(15、50、150吗Zkg)
时的基础血糖值(9时)的结果。
图8表示1日3次反复皮下给予GLP-l(7-36)酰胺(15、50、150吗/kg)
时的基础血糖值(17时)的结果。
图9表示1日3次反复皮下给予GLP-K7-36)酰胺(15、50、150吗/kg) 时的糖化血红蛋白(HbAlc， 9时)的变化图。
图IO表示I日3次反复皮下给予GLP-l(7-36)酰胺(15、50、150吗/kg) 时的血浆中胰岛素浓度(9时)的变化图。
图11表示对1日3次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺(15、 50、 150吗/kg)约8周的KK-Ay/TaJcl小鼠，皮下给予胰岛素(0.75U/kg)时
的血糖值降低活性的确认结果。
图12表示对小鼠皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺溶液(介质生理盐 水，50吗/kg)时血浆中活性型GLP-1浓度变化的结果。
图13表示对食蟹猴经鼻给予含有GLP-1 (7-36)酰胺30吗或100ng 的30mg重量的药物粉末时血浆中活性型GLP-1浓度变化的结果。
图14.1表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1曰3
次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时给药期间的体重变化图。
图14.2表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1日3 次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时摄食量的变化图。
图14.3表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1日3 次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时随时血糖值(9时给药前) 的变化图。
图14.4表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1曰3 次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时糖化血红蛋白(HbAlc)的
变化图。
图14.5表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1曰3 次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时血浆中胰岛素的浓度(9时 给药前)的变化图。图14.1 14.5中，1组为普通食物组(给予介质)、2 组为普通食物组(给予GLP-1 (7-36)酰胺)、3组为高脂肪食物组(给 予介质)以及4组为高脂肪食物组(给予GLP-1 (7-36)酰胺)，l组对3 组*p<0.05、 "pO.01; 3组对4组#p<0.05、" <0.01。
图15表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1日3次 反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时乙酰乙酸的浓度图。
图16.1表示对负荷普通食物或高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1曰3 次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺22 24周后，从动物身上采取的肝脏的 重量图。
图16.2表示对负荷高脂肪食物的KK/Ta Jcl小鼠1日3次反复给予 GLP-1 (7-36)酰胺22 24周后，从动物身上采取的肝脏的组织标本显 微镜照片。图16.1及16.2中，l组为普通食物组(给予介质)、2组为普 通食物组(给予GLP-1 (7-36)酰胺)、3组为高脂肪食物组(给予介质) 以及4组为高脂肪食物组(给予GLP-l(7-36)酰胺)，1组对3组+pO.05; 3组对4组#p<0.05。
图17.1表示从反复给药22 24周后的负荷高脂肪食物(给予介质) 的动物(3组)摘除心脏，采用Langendorff灌注评价心功能的结果图。
图17.2表示从反复给药22 24周后的负荷高脂肪食物(给予GLP-1 (7-36)酰胺)的动物(4组)摘除心脏，采用Langendorff灌注评价心 功能的结果图。
图18表示对ICR系小鼠1日3次反复给予GLP-1 (7-36)酰胺15
周后，观察变更食物时血糖变化及停止给予GLP-1时血糖变化的结果图。
图19表示用普通食物或高脂肪食物饲养CRj: CD1 (ICR)系小鼠 时，对照组及GLP-1 (7-36)酰胺给药组的体重变化图。
图20.1表示用普通食物或高脂肪食物词养CRj: CD1 (ICR)系小鼠 时，对照组及GLP-1给药组的摄食重量(1组在1个笼子中饲养，消耗 的食物量除以动物数，得到平均摄食量)的变化图。
图20.2表示用普通食物或高脂肪食物饲养CRj: CD1 (ICR)系小鼠 时，对照组及GLP-1 (7-36)酰胺给药组的摄食热量(摄食重量乘以食物 单位重量的热量数)的变化图。
图21表示用普通食物或高脂肪食物饲养CRj: CD1 (ICR)系小鼠 时，对照组及GLP-1 (7-36)酰胺给药组在给药期间的血糖值变化图。
图22.1表示对CRj: CD1 (ICR)系小鼠1日1次或2次反复皮下给 予介质或GLP-1 (7-36)酰胺约5周，在以1.5g/kg的用量对最终给药后 禁食一夜的小鼠皮下给予葡萄糖，测定给药后30分钟的血浆中葡萄糖的 结果图。
图22.2表示对CRj: CD1 (ICR)系小鼠l日1次或2次反复皮下给 予介质或GLP-1 (7-36)酰胺约5周，在以1.5g/kg的用量对最终给药后 禁食一夜的小鼠皮下给予葡萄糖，测定给药后30分钟的胰岛素浓度的结 果图。
具体实施例方式
本发明中，GLP-1受体激动剂是指与GLP-1 (非专利文献23，序列 编号1)以及结合于GLP-1受体的具有促进胰岛素释放活性的该GLP-1 的衍生物。
GLP-1是由来源于前胰高血糖素原的37个氨基酸残基组成的肽，前
胰高血糖素原进一步被处理为GLP-1的N末端侧缺失6个氨基酸的 GLP-l (7-37)，或进一步被生物合成为GLP-l (7-36)的C末端经酰胺 化修饰的GLP-l (7-36)酰胺(非专利文献24)。由于这些肽激素(即 GLP-l或GLP-l衍生物)作用于胰脏的(3细胞，具有促进胰岛素分泌的 作用等，近年来，由其药理作用暗示有作为糖尿病治疗药的可能性(非 专利文献25、 26)。
另外，作为GLP-l衍生物，除了上述GLP-l (7-37)、 GLP-l (7-36) 酰胺外，例如可列举出在由GLP-l的37个氨基酸残基组成的肽中的1 个或数个氨基酸残基被替换、添加、缺失的具有促进胰岛素释放活性的 肽、该肽的氨基酸进一步被修饰的具有促进胰岛素释放活性的肽(例如 酰胺体)以及由它们的组合而得到的具有促进胰岛素释放活性的肽。
作为GLP-l衍生物的具体例子，除了本发明实施例记载的以外，可
以列举出以下例子
(1) GLP-l (7-34)、 GLP-l (7-35)、 GLP-l (7-36)、 GLP-l (7-34) 酰胺、GLP-1 (7-35)酰胺以及GLP-l (7-37)酰胺；
(2) GLP-l (7-37) -Arg、 GLP-l (7-37) -Arg-Arg、 GLP-l (7-37) 層Lys、 GLP-l (7-37) -Lys-Lys、 GLP-l (7-37) -Lys-Arg以及GLP-l (7-37) -Arg-Lys以及它们的C末端酰胺体；
(3) 将GLP-l的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser的GLP-l (7-37)以及GLP-l (7-36)酰胺；
(4) 将GLP-l的26位的氨基酸Lys替换为Arg的GLP-l (7-37) 以及GLP-l (7-36)酰胺；
(5) 将GLP-l的34位的氨基酸Lys替换为Arg的GLP-l (7-37) 以及GLP-l (7-36)酰胺；
(6) 将GLP-l的36位的氨基酸Arg替换为Lys的GLP-l (7-37) 以及GLP-l (7-36)酰胺；
(7) 将GLP-l的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 26位的氨基酸Lys替换为Arg的GLP-l (7-37)以及GLP-l (7-36)酰胺；
(8) 将GLP-1的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 34位的氨基酸Lys替换为Arg的GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰 胺；
(9) 将GLP-1的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 36位的氨基酸Arg替换为Lys的GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰 胺；
(10) 将GLP-1的26位的氨基酸Lys替换为Arg，再将34位的氨 基酸Lys替换为Arg的GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(11) 将GLP-1的26位的氨基酸Lys替换为Arg，再将36位的氨 基酸Arg替换为Lys的GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(12) 将GLP-1的34位的氨基酸Lys替换为Arg，再将36位的氨 基酸Arg替换为Lys的GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(13) 将GLP-1的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 26位的氨基酸Lys替换为Arg，再将34位的氨基酸Lys替换为Arg的 GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(14) 将GLP-1的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 26位的氨基酸Lys替换为Arg，再将36位的氨基酸Arg替换为Lys的 GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(15) 将GLP-1的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 34位的氨基酸Lys替换为Arg，再将36位的氨基酸Arg替换为Lys的 GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(16) 将GLP-1的26位的氨基酸Lys替换为Arg，再将34位的氨 基酸Lys替换为Arg，再将36位的氨基酸Arg替换为Lys的GLP-1 (7-37) 以及GLP-1 (7-36)酰胺；
(17) 将GLP-1的8位的氨基酸Ala替换为Thr、 Gly或Ser，再将 26位的氨基酸Lys替换为Arg，再将34位的氨基酸Lys替换为Arg，再 将36位的氨基酸Arg替换为Lys的GLP-1 (7-37)以及GLP-1 (7-36) 酰胺。
本发明中，优选的GLP-1受体激动剂为GLP-l(7-37)或GLP-l(7-36) 酰胺等的GLP-1衍生物，特别优选GLP-1 (7-36)酰胺。
本发明的GLP-1受体激动剂可以用公知的方法例如化学合成法或基 因重组技术以及它们的组合制得。
作为本发明可以使用的GLP-1受体激动剂的盐，优选药学上可接受 的盐，例如可列举出与无机碱形成的盐、与有机碱形成的盐、与无机酸 形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或酸性氨基酸形成的盐等。
作为与无机碱形成的盐的优选例，例如可列举出钠盐、钾盐等的碱 金属盐；钙盐、镁盐等的碱土类金属盐；及铝盐、铵盐等。
作为与有机碱形成的盐的优选例，例如可列举出与三甲胺、三乙胺、 吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N，N'-二 苄基乙二胺等形成的盐。
另外，作为与无机酸形成的盐的优选例，例如可列举出与盐酸、氢 溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。
作为与有机酸形成的盐的优选例，例如可列举出与甲酸、乙酸、三 氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、拧檬酸、琥珀酸、苹果酸、 甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等形成的盐。
作为与碱性氨基酸形成的盐的优选例，例如可列举出与精氨酸、赖 氨酸、鸟氨酸等形成的盐，作为与酸性氨基酸形成的盐的优选例，例如 可列举出与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
以上盐中，特别是钠盐、钾盐是最优选的。
含有GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐作为有效成分的本 发明的药物，可以与药理学上可接受的载体、赋形剂、增量剂等混合用 于个体(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴等)。
对本发明的GLP-1受体激动剂的给药量没有特别限制，可以根据本 发明的药物的使用目的和个体的年龄、体重、个体的种类等进行适当选 择，但优选通过外源性给予个体GLP-1受体激动剂可以再现相当于正常
状态的个体摄食时诱导的内源性GLP-1受体激动剂浓度上升的给药量。
即可以是在给药对象的个体中，血浆中的GLP-1受体激动剂(本发明中 也称作活性型GLP-1)浓度一过性地达到20pg/mL以上的有效量。
这里，"一过性"是指使血浆中的GLP-1受体激动剂浓度从刚给药 后至约1 3小时之间上升到20pg/mL以上的浓度。
作为给药量中的GLP-1受体激动剂的重量，优选在制剂中含有能够 给予0.5吗 5000(ig、更加优选5.0(ig 5000|ig的重量。将其按照1日1 次以上给予并持续2周以上的连续方案进行给药。
例如，当成人经鼻给予作为GLP-1受体激动剂的GLP-1 (7-36)酰 胺时，制剂中的GLP-l (7-36)酰胺可以为300叱 5000吗。推断该用量 为人实现实施例1及实施例2中改善小鼠的胰岛素抵抗性时的血浆中浓 度所需要的量。即300吗的用量是预想使血浆中的GLP-1受体激动剂 浓度上升到与以15吗/kg的用量皮下给予小鼠GLP-1 (7-36)酰胺时大致 相同的水平的给药量，5000吗的用量是预想使血浆中的GLP-1受体激动 剂浓度上升到与以500吗/kg的用量皮下给予小鼠GLP-1 (7-36)酰胺时 大致相同的水平的给药量。
将其按照1日1次以上在摄取食物前给予并持续2周以上的连续方 案进行给药。
作为给药时间，不只是在摄取食物前，进一步在摄取食物后进行也 可以。特别是对于人，优选在每餐前后进行例如1日3次的给药。
进一步地，作为每次给药的间隔，优选使血浆中的GLP-1受体激动 剂(活性型GLP-1)浓度下降到20pg/mL以下的状态持续1小时以上。
另外，当对食蟹猴在2周内反复经鼻给予与实施例3中使用的GLP-1 (7-36)酰胺的粉末滴鼻剂同一种类的制剂进行安全性评价时，认为即 使1日6次给予3600吗，也没有发现毒性变化及鼻粘膜的刺激性。
GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐可以通过与药学上可接 受的载体配合，作为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等固体制剂或糖浆剂、 注射剂等液体制剂经口或非经口给药。
作为药学上可接受的载体，可以使用作为制剂材料常用的各种有机 或无机载体物质，可以同时配合固体制剂中的赋形剂、润滑剂、粘合剂、 崩解剂；液体制剂中的溶剂、助溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、镇痛 剂等。
另外，根据需要，也可以使用防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂等 制剂添加剂。
作为赋形剂的优选例，例如可列举出乳糖、白糖、D-甘露糖醇、淀 粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等。作为润滑剂的优选例，例如可列举出 硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅等。
作为粘合剂的优选例，例如可列举出结晶纤维素、白糖、D-甘露糖 醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯垸酮等。
作为崩解剂的优选例，例如可列举出有淀粉、羧甲基纤维素、羧甲 基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠等。
作为溶剂的优选例，例如可列举出注射用水、醇、丙二醇、聚乙二 醇、芝麻油、玉米油等。
作为助溶剂的优选例，例如可列举出聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖 醇、苯甲酸节酯、乙醇、三羟甲基氨基甲垸、胆固醇、三乙醇胺、碳酸 钠、拧檬酸钠等。
作为悬浮剂的优选例，例如可列举出三乙醇胺硬脂酸酯(stearyl tdethanol amine)、月桂基硫酸钠、月桂氨基丙酸(lauryl aminopropionic add)、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、硬脂酸甘油酯等的表面活性剂； 例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲 基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等的亲水性高分子等。
作为等渗剂的优选例，例如可列举出氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。
作为缓冲剂的优选例，例如可列举出磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠 檬酸盐等的缓冲液等。
作为镇痛剂的优选例，例如可列举出苯甲醇等。
另外，作为防腐剂的优选例，例如可列举出对羟基苯甲酸酯类、氯
丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
作为抗氧剂的优选例，例如有亚硫酸盐、抗坏血酸等。
作为适于非经口给药的制剂形式，例如可列举出经鼻给药、经肺给 药、静脉内给药、皮内给药、皮下给药、或肌肉内给药用等的滴鼻剂、 注射剂、点滴剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂或吸入剂等。作为 适于经口给药的制剂形式，例如可列举出胶囊剂、片剂、糖浆剂等。其 中，作为本发明的制剂形式，优选适于非经口给药的制剂形式，例如优 选滴鼻剂、注射剂、点滴剂、经粘膜吸收剂或吸入剂等制剂形式。
对于这些制剂形式本领域技术人员已知道多种，本领域技术人员可 以适当选择适于所希望的给药途径的制剂形式，还可以根据需要使用本 领域能够利用的1种或2种以上的制剂用添加物来制备医药用组合物形
式的制剂。
例如，注射剂或点滴剂形式的药物，可以通过将作为有效成分的
GLP-1受体激动剂与等渗剂、pH调节剂、镇痛剂、防腐剂等的1种或2 种以上的制剂用添加物溶解于注射用蒸馏水中，再进行灭菌来制备。另 外，注射剂或点滴剂形式的药物，也可以作为冻干形式的药物来提供。 这种制剂可以通过在临用时添加注射用蒸馏水或生理盐水等进行溶解， 作为注射剂或点滴剂来使用。另外，例如在经粘膜给药中，优选滴鼻剂 或鼻腔内喷雾剂等的鼻腔内给药剂、舌下剂等的口腔内给药剂或者经肺 给药用吸入剂等。
对给药方法没有特别限制，优选经鼻给药、经肺给药、静脉内给药、 皮内给药、皮下给药、或肌肉内给药用等的非经口给药，更优选为非侵 入性给药。作为非侵入性给药，优选经鼻给药或经肺给药。
实施例
下面通过实施例进一步具体地说明本发明。
实施例1:对胰岛素抵抗性模型小鼠(KK-Ay/TaJd小鼠)反复皮下给予 GLP-1 (7-36)酰胺2周时的活性评价
将GLP-1 (7-36)酰胺溶解在25%葡聚糖70溶液中，以500叫/kgZ
日的给药量对雄性KK-Ay/Ta Jcl小鼠按1日1次反复皮下给药14天，测 定给药期间的血糖值及各组织中的糖摄取活性。此时，亮-暗周期设为12 小时(光照熟7时 19时)，反复给药期间喂食普通食物(固体(CRF-1)， 才y工y夕/p酵母工業株式会社)。
(1) 组构成
对照组为未给予药物组(N二4)。对受试物质给予组(N = 4)，按1 日1次傍晚(16时左右)时皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺500吗/kg。对 阳性对照组(N = 4)，按1日1次傍晚(16时左右)时腹腔内给予现有 的胰岛素抵抗性改善药曲格列酮30mg/kg。
(2) 评价项目及结果
(a) 用简易型血糖测定器(AntsenseII， /《一工》一三共(株))测定 受试物质或阳性对照物质开始给予前、反复给予后第7天及第13天的血 糖值(药物给予前的饱餐时血糖值)，结果如图l所示。
与对照组相比，GLP-1 (7-36)酰胺给药组中给药期间的饱餐时血糖 值降低。该作用也比曲格列酮给药组强。
(b) 反复给予受试物质或阳性对照物质13天后，禁食约20小时， 用简易型血糖测定器(Antsense II， /M工》一三共(株))测定空腹时的 血糖值，结果如图2所示。
在GLP- (7-36)酰胺给药组中，空腹时血糖值降低。该作用与给 予曲格列酮时大致相同。
(c) 反复给予受试物质或阳性对照物质14天，在最终给药30分钟 后，经口给予0.15g/mL葡萄糖和0.123叫/0.83MBq/mL3H-脱氧葡萄糖混 合溶液(10mL/kg)。另外，第13天给药后禁食约20小时。用液体闪烁 计数器(TRICARB2200、 Packard公司)测定糖负荷30分钟后血清中的 放射性浓度，另外，用变位酶 GOD法分别测定血清中葡萄糖浓度，其 结果分别如图3及图4所示。
另外，用液体闪烁计数器(TRICARB2200、 Packard公司)测定肝
脏、白色脂肪及骨骼肌中的放射性浓度，其结果如图5所示。
与对照组相比，GLP-1 (7-36)酰胺给药组中血清中的放射性及葡萄 糖浓度降低，肝脏中的放射性的摄取活性(KP值)上升。曲格列酮给药 组中任一项目与对照组都没有发现差别。
(d)将GLP-1 (7-36)酰胺溶解在25%葡聚糖70溶液中，对正常 小鼠(C57BL小鼠)以500吗/kg的用量进行皮下给药时，确认血桨中的 活性型GLP-1浓度变化(参照图6)。
血浆中的活性型GLP-1浓度在给药15分钟后上升到约2ng/mL，给 药1小时后下降到0.4ng/mL。
(3)结论
KK-Ay/Ta Jcl小鼠为由于过度饱食以及胰岛素抵抗性而呈现高胰岛 素血症及高血糖状态的2型糖尿病模型小鼠，已知即使给予降血糖药磺 酰脲剂也无效。
由于对KK-Ay/Ta Jcl小鼠按1日1次反复皮下给予GLP-1 (7-36) 酰胺500吗/kg 13天，给药期间的饱餐时及空腹时血糖值降低。由此暗示 GLP-1 (7-36)酰胺具有改善胰岛素抵抗性的作用。另外，在第14天给 药30分钟后经口负荷葡萄糖〃H-脱氧葡萄糖混合溶液时，血清中葡萄 糖及放射性浓度降低，向肝脏及肌肉中放射性的移行性上升。
本实施例中确认的末梢组织中的糖摄取促进作用，是在刚给予的 GLP-1 (7-36)酰胺存在的状态下确认的，但推测认为如果通过GLP-1 受体激动剂改善胰岛素抵抗性，则不仅在刚给药后，而且在给药后经过 足够的时间，血浆中几乎不存在活性型GLP-1的条件下，末梢组织中的 糖摄取活性也将增强，于是进一步进行了以下实验。
实施例2:对胰岛素抵抗性模型小鼠(KK-Ay/TaJcl小鼠)反复皮下给予 GLP-1 (7-36)酰胺8周时的活性评价
将GLP-1 (7-36)酰胺溶解在生理盐水中，对雄性KK-Ay/Ta Jcl小
鼠按1日3次反复皮下给药8周，研究对基础血糖值、糖化血红蛋白 (HbAlc)及血浆中胰岛素浓度的影响。另外，对最终给药结束后的动 物进行腹腔内给予胰岛素0.75U/kg，经时测定血糖值。此时，亮-暗周期 设为12小时(光照期8时 20时)，反复给药期间喂食普通食物(固体(crf-i)、才y工y夕少酵母工業株式会社)。
(1) 组构成
对照组为给予介质(生理盐水)组(N=10)。对受试物质给予组按 1日3次(9时左右、13时左右及17时左右)进行8周的反复皮下给予 GLP-l (7-36)酰胺15、 50及150吗/kg。
(2) 评价项目及结果
(a) 按1日3次(9时左右、13时左右及17时左右)反复皮下给 予GLP-l (7-36)酰胺8周，测定给药期间的给药前的血糖值(9时及 17时)、糖化血红蛋白(HbAlc， 9时)及9时给药前的血浆中胰岛素浓 度(9时)。其结果分别如图7 10所示。
给药期间的血糖值(9时)及HbAlc (9时)的上升出现略有受抑制 的倾向。傍晚17时给药前测定的血糖值没有观察到差别(9时)。给药期 间的胰岛素浓度(9时)的上升在15 150|ig/kg给药量时受到抑制。而 且，反复皮下给药8周后的动物中，虽然没有观察到禁食16小时以上后 的血糖值(空腹时血糖值)的差别，但是腹腔内给予胰岛素(0.75U/kg) 时的血糖值降低作用增强，另外认为，在进行血糖值及血浆中胰岛素浓 度测定的9时，从前一次给药起经过约16小时，给予的GLP-1 (7-36) 酰胺已经从体内消失。在本试验期间，发现各组的体重及摄食量没有差 别。
(b) 对KK-Ay/Ta Jcl小鼠按1日3次(9时左右、13时左右及17 时左右)进行反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺约8周后，在最终给药
(17时左右)后禁食16小时以上。然后，经时测定腹腔内给予胰岛素 0.75U/kg时的血糖值，其结果如图ll所示。
尽管禁食6小时以上后的血糖值(空腹时血糖值)在组间没有差别， 但GLP-1 (7-36)酰胺给药组与对照组相比，胰岛素的血糖值降低作用 增强。
(c) 将GLP-1 (7-36)酰胺溶解在生理盐水中，以50吗/kg的用量 对正常小鼠(C57BL小鼠)进行皮下给药时，确认血浆中的活性型GLP-1 浓度变化。血浆中的活性型GLP-1浓度在给药后5分钟时上升到1.14ng/mL，给药后30分钟以内下降到小于定量限(小于0.1ng/mL)(参 照图12)。
(3)结论
根据本试验的结果可以认为通过对KK-Ay/Ta Jcl小鼠反复皮下给 予GLP-1 (7-36)酰胺，引起血浆中的活性型GLP-1浓度一过性上升， 从而抑制胰岛素抵抗性的恶化，且增强胰岛素敏感性。由于发现该作用 在1日3次皮下给予15 150pg/kg的组中具有大致相同的强度，因而认 为15吗/kg的给药量时作用已经饱和。另外，由于给药期间动物的体重、 摄食量及反复给药结束后的空腹时的血糖在各组间没有差别，且给予 GLP-1 (7-36)酰胺对饱餐时血糖值上升的抑制作用微小，因此可以认为 本试验中发现的GLP-1 (7-36)酰胺的胰岛素敏感性增强不是伴有血糖 值降低作用或摄食量抑制作用的间接作用，而是通过直接改善末梢组织 的胰岛素抵抗性。
实施例3:对雄性食蟹猴经鼻给予GLP-1 (7-36)酰胺的粉末滴鼻剂时， 评价血浆中的活性型GLP-1浓度的变化
将1粒胶囊的GLP-1 (7-36)酰胺的粉末滴鼻剂装入专用装置，考 察将胶囊中充填的药剂粉末通过装置的喷嘴喷雾给予鼻腔内时，血浆中 的活性型GLP-1浓度的变化。
(O组构成
将含有GLP-1 (7-36)酰胺30吗或IOO吗的30mg重量的药剂粉末 分别喷雾给予4只雄性食蟹猴的鼻腔内。
(2) 评价项目及结果
用市售的ELISA Kit测定给予GLP-1 (7-3 6)酰胺的粉末滴鼻剂后的 血浆中的活性型GLP-1浓度。血浆中的活性型GLP-1浓度在刚给药后上 升到约0.15或约1.0ng/mL，给药180分钟(3小时)后大致降低到给药 前的值(参照图13)。
(3) 结论
使用食蟹猴考察了 GLP-1 (7-36)酰胺的粉末滴鼻剂的药物动态。
根据该结果可以认为通过在一定期间内对人也间歇性地重复经鼻给予
本制剂，能够再现模仿健康人的内源性GLP-1 (7-36)酰胺的日内变动 的血桨中浓度变化。由此确立对人非侵入性给予GLP-1受体激动剂的方 法。
由上述实施例可以确认使GLP-1受体激动剂的血浆中浓度的一过
性上升间歇性地重复进行，可抑制KK-Ay/Ta Jcl小鼠的胰岛素抵抗性的 恶化，改善高胰岛素血症及因伴有胰岛素抵抗性的胰岛素相对不足而产 生的高血糖状态。
另外，可以确认的是通过对食蟹猴经鼻给予GLP-1 (7-36)酰胺的 粉末滴鼻剂，可使血浆中活性型GLP-1浓度一过性上升。还可以认为如 果使用GLP-1 (7-36)酰胺的粉末滴鼻剂，则可以在每餐时对人非侵入 性地反复给予天然型GLP-1 (7-36)酰胺。
实施例4:对高脂肪食物负荷的KK/TaJcl小鼠反复皮下给予GLP-l(7-36) 酰胺时的活性评价
将GLP-1 (7-36)酰胺溶解在生理盐水中，对雄性KK-Ay/Ta Jcl小 鼠(日本夕l^7株式会社)按1日3次反复皮下给药15周时，研究给药 期间对体重、摄食量、基础血糖值、糖化血红蛋白(HbAlc)及血浆中 胰岛素浓度的影响。在15周给药结束后，将高脂肪食物变更为普通食物， 观察再变更回高脂肪食物时的血糖变化以及停止给予GLP-1 (7-36)酰 胺2周时的血糖变化。在全部给药结束后(从给药开始时起第22 24周)， 采取动物的肝脏及心脏，观察肝重量和脂肪肝的程度，同时采用 Langendorff灌注评价心功能。另外，饲养期间的亮-暗周期设为12小时 (光照期8时 20时)，反复给药期间喂食普通食物(固体(CRF-1)， 才y工y夕》酵母工業株式会社)或高脂肪食物(固体(QuickFat)，日本夕 P了株式会社)。
(1)组构成
普通食物组及高脂肪食物组两组均设定给予介质(生理盐水)的对 照组和受试物质给予组(N=8 9)。对受试物质给予组按1日3次(9时 左右、13时左右及17时左右)在22 24周(包括2周停药期间)内反
复皮下给予GLP-l (7-36)酰胺150貼/kg。
(2)评价项目及结果
(a) 1日3次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周，测定给药期 间的体重、摄食量、随时血糖值(9时及17时)、糖化血红蛋白(HbAlc， 第l天及第73天的9时)及血浆中胰岛素浓度(9时)(参照图14)。高 脂肪食物组中，给予GLP-1 (7-36)酰胺显著抑制随时血糖值(9时)、 HbAlc及血浆中胰岛素浓度(9时)的上升。普通食物组中，给予介质 与给予GLP-1 (7-36)酰胺间血糖值(9时及17时)及HbAlc值没有观 察到差别。普通食物组及高脂肪食物组的任一组中，介质给予组与GLP-1
(7-36)酰胺给予组之间的摄食量没有差别，但观察到有抑制体重增加 的倾向。
(b) 测定1日3次反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺15周时的乙 酰乙酸浓度(给药第85天的9时给药前)(参照图15)。与普通食物组相 比，高脂肪食物组中乙酰乙酸浓度显著上升，且观察到由于给予GLP-1
(7-36)酰胺而抑制上升的倾向。 .
(c) 从反复皮下给药22 24周结束后起禁食一夜的动物身上采取 肝脏。与普通食物组相比，高脂肪食物组的肝脏重量显著增加，确认脂 肪沉着。另一方面，普通食物组中，未观察到由于给予GLP-1 (7-36) 酰胺而引起的肝脏重量的变化，高脂肪食物组中观察到由于给予GLP-1 而显著抑制肝脏重量的增加，几乎没有出现肝脏中的脂肪沉着(参照图 16)。
(d) 反复皮下给药22 24周结束后，从高脂肪食物组的动物身上 采取心脏，并采用Langendorff灌注评价心功能。与介质给予组相比， GLP-1 (7-36)酰胺给予组中，缺血再灌注后的心输出量恢复快，作为收 縮能力指标的最高-最低灌注压差扩大(参照图17)。
(e) 反复给药15周结束后，将高脂肪食物组的食物变更为普通食 物时，因高脂肪食物诱发的高血糖立刻降低，但再次变更为高脂肪食物 时，血糖值马上上升到与食物变更前相同的程度。在GLP-1 (7-36)酰 胺给予组中，没有出现因食物种类而引起的血糖值的变动，即使GLP-1
(7-36)酰胺停止给药2周，血糖值也没有急剧上升(参照图18)。 (3)结论
根据本试验的结果，通过对KK/Ta Jcl小鼠进行反复皮下给予GLP-1 (7-36)酰胺，使血浆中的活性型GLP-1浓度的一过性上升间歇性地重 复进行，可改善因高脂肪食物负荷而诱发的高血糖及高胰岛素血症。与 此同时，抑制作为酮的乙酰乙酸的生成或脂肪肝的产生。即使停止给予 GLP-1 (7-36)酰胺，高血糖及高胰岛素血症的改善作用也继续保持(图 18)，因此推断GLP-1具有通过调整肝脏的糖脂质代谢平衡而改善胰岛素 抵抗性、抑制糖尿病发病的作用。另外，与仅摄取高脂肪食物的组相比， GLP-1 (7-36)酰胺给予组改善缺血再灌注后的心功能。由于是在给予 GLP-1 (7-36)酰胺结束后经过12小时以上的条件下进行的，灌注液中 也没有添加GLP-1，因此该作用是与目前己知的这种持续给予GLP-1时 的心脏保护作用不同的作用，推断是通过使血浆中的活性型GLP-1浓度 的一过性上升间歇性地重复进行，从而改善心脏组织的胰岛素抵抗性， 获得心肌对缺血应激的耐受性。
实施例5:用高脂肪食物词养的小鼠反复皮下给药时的活性评价
对雄性CRj: CD1 (ICR)系小鼠(于亇一/V乂lJ/《一'^亇/《V，)按1 日2次(休息日1日1次)反复皮下给予介质(生理盐水)或GLP-l(7-36) 酰胺150吗/kg约5周，考察给药期间对体重、摄食量、基础血糖值、糖 负荷后的血浆中葡萄糖及胰岛素浓度的影响。此时，亮-暗周期设为12 小时(光照離21时 9时)，反复给药期间喂食普通食物(固体(CRF-1)， 才y工y夕》酵母工業株式会社)或高脂肪食物(固体(Quick Fat)，日本夕 ^了株式会社)。
(1) 组构成
作为对照组，设用普通食物饲养的介质给予组(N=6 7)及用高脂 肪食物词养的介质给予组(N=6 7)。对受试物质给予组(N=6)按1曰 2次(9时左右及17时左右，休息日1日1次)反复皮下给予GLP-l(7-36) 酰胺150吗/kg约5周。
(2) 评价项目及结果
测定饲养期间的体重、摄食量、随时血糖值(9时给药前测定)及
最终给药后禁食一夜后以1.5g/kg的用量皮下给予葡萄糖，给药后30分
钟的血浆中葡萄糖及胰岛素浓度。
(a) 体重、摄取能量
高脂肪食物组的体重在饲养期间比普通食物组高，由于给予GLP-l (7-36)酰胺而抑制体重增加(参照图19)。摄食重量(各组的平均值) 在组间没有明显差别。将摄食量换算成摄取能量，高脂肪食物组比普通 食物组高10 20% (参照图20)。
(b) 血糖值
反复给药期间的随时血糖值在组间没有明显差别(参照图21)。最 终给药后禁食一夜后测定的空腹时血糖值，与普通食物组相比高脂肪食 物组中显示显著的高值，且观察到由于给予GLP-l (7-36)酰胺而受抑 制的倾向(参照图21)。皮下给予1.5g/kg葡萄糖30分钟后的血浆中葡 萄糖及胰岛素浓度，与普通食物组相比高脂肪食物组中显著上升。由于 给予GLP-l (7-36)酰胺而具有抑制胰岛素浓度上升的倾向，但没有显 著差别，高脂肪食物组中的血浆中葡萄糖浓度的上升没有受到抑制(参 照图22)。
(3)结论
当对摄取高脂肪食物的小鼠反复给予GLP-l (7-36)酰胺时，摄食 量没有变化，伴随着摄取高脂肪食物的体重增加受到抑制。另外，由于 给予GLP-l (7-36)酰胺，因长期摄取高脂肪食物引起的空腹时血糖值 上升被抑制到与摄取普通食物组相同的程度，因摄取高脂肪食物引起的 血浆中胰岛素浓度的高值也受到抑制。实验确认该结果与KK/Ta Jd 小鼠中的效果非常相关，如KK/Ta Jcl小鼠这种没有保持容易使遗传性糖 尿病发病的体质的动物，对于因长期摄取高脂肪食物而诱发胰岛素抵抗 性和肥胖，可以通过使血浆中的活性型GLP-l浓度的一过性上升间歇性 地重复进行得到改善。
工业实用性
本发明提供使用副作用少且药物相互作用少的GLP-l受体激动剂的
新的用于改善胰岛素抵抗性的给药方法及该给药用的胰岛素抵抗性改善 剂。即提供一种新的改善胰岛素抵抗性的方法及预防和治疗胰岛素抵 抗性引起的疾病例如高血糖症、糖尿病及肥胖症等的方法，以及含有该 方法中使用的GLP-1受体激动剂作为有效成分的胰岛素抵抗性改善剂。
权利要求
1.一种改善胰岛素抵抗性或者预防或治疗伴有胰岛素抵抗性的疾病的医药组合物，含有GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐作为有效成分，所述医药组合物用于对呈现胰岛素抵抗性症状的个体，在摄取食物前以单次剂量0.5～5000μg给予GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐，1日1次以上，给药2周以上，按该连续方案给予。
2. 如权利要求1所述的医药组合物，其中所述给予还在摄取食物后 给予。
3. 如权利要求1或2所述的医药组合物，其中所述GLP-1受体激 动剂为GLP-1 (7-36)酰胺。
4. 如权利要求1 3所述的医药组合物，其中所述给予为皮下给药、 经鼻给药或经肺给药。
5. 如权利要求1 4所述的医药组合物，其中所述伴有胰岛素抵抗 性的疾病为高胰岛素血症、糖尿病、肥胖症、高脂血症、动脉硬化症、 高血压症或循环器官疾病。
6. 如权利要求7所述的医药组合物，其中所述伴有胰岛素抵抗性的 疾病为糖尿病。
7. 如权利要求1所述的医药组合物，其用于通过摄取食物前的经鼻 给药给予GLP-1 (7-36)酰胺。
8. —种改善胰岛素抵抗性或者预防或治疗伴有胰岛素抵抗性的疾病 的方法，所述方法是对呈现胰岛素抵抗性症状的个体，在摄取食物前以 单次剂量0.5 5000吗给予GLP-1受体激动剂或其药理学上可接受的盐， 1日1次以上，给药2周以上，按该连续方案给予。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述给予还在摄取食物后给予。
10. 如权利要求8或9所述的方法，其中所述GLP-1受体激动剂为 GLP-1 (7-36)酰胺。
11. 如权利要求8 10的任一项中所述的方法，其中所述给予为皮 下给药、经鼻给药或经肺给药。
12. 如权利要求8 11的任一项中所述的方法，其中所述伴有胰岛 素抵抗性的疾病为高胰岛素血症、糖尿病、肥胖症、高脂血症、动脉硬 化症、高血压症或循环器官疾病。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述伴有胰岛素抵抗性的疾病 为糖尿病。
14. 如权利要求8所述的方法，其用于通过摄取食物前的经鼻给药 给予GLP-1 (7-36)酰胺。
15. GLP-1受体激动剂在制备下述医药组合物中的用途，所述医药 组合物是改善胰岛素抵抗性或者预防或治疗伴有胰岛素抵抗性的疾病的 医药组合物，对呈现胰岛素抵抗性症状的个体，在摄取食物前以单次剂 量0.5 5000昭给予GUM受体激动剂或其药理学上可接受的盐，1日1 次以上，给药2周以上，按该连续方案给予。
16. 如权利要求15所述的用途，其中所述给予还在摄取食物后给予。
17. 如权利要求15或16所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂 为GLP-1 (7-36)酰胺。
18. 如权利要求15 17的任一项中所述的用途，其中所述给予为皮 下给药、经鼻给药或经肺给药。
19. 如权利要求15 18的任一项中所述的用途，其中所述伴有胰岛 素抵抗性的疾病为高胰岛素血症、糖尿病、肥胖症、高脂血症、动脉硬 化症、高血压症或循环器官疾病。
20. 如权利要求19所述的用途，其中所述伴有胰岛素抵抗性的疾病 为糖尿病。
21. 如权利要求15所述的用途，其用于通过摄取食物前的经鼻给药 给予GLP-1 (7-36)酰胺。
全文摘要
本发明提供使用副作用少且药物相互作用少的用于改善胰岛素抵抗性的GLP-1受体激动剂的新的给药形式以及该给药用的胰岛素抵抗性改善剂。所得到的给药方法不是使GLP-1受体激动剂持续作用，而是至少在摄取食物前给药，优选在一定期间内重复进行非侵入性给药，从而产生与内源性GLP-1受体激动剂在每餐后的一过性分泌相同的状况，得到模仿或强调健康个体中的内源性GLP-1受体激动剂的日内变动的血浆中浓度变化；所得到的医药组合物是以该给药用的GLP-1受体激动剂作为有效成分的医药组合物。
文档编号A61K45/00GK101184509SQ20068001858
公开日2008年5月21日 申请日期2006年5月26日 优先权日2005年5月27日
发明者原田由利子, 增田丰, 若林直美 申请人:阿斯比奥制药株式会社